65
66
考 察
本章では, 妊娠期喫煙影響のリスク要因であるコリン作動性神経毒ニコチンを用いて検 討を行った。
本実験では
,
母動物において50 ppm
で体重および摂餌量の減少, 10 ppm
以上で摂水量の 減少がみられた。子動物では体重の減少が50 ppm
の雌雄でみられ, 2
および10 ppm
の雄で も散見された。また,
摂餌量の減少が2 ppm
以上の雌雄でみられ,
脳重量の低値が生後21
および
77
日に50 ppm
の雄でみられた。母動物および子動物の同様の変化は妊娠期にニコチンを曝露した実験でも報告されている（50）。第一章で検討したように発達期に低たん白 食を与えた発達期低栄養の子動物では, 生後
77
日まで継続する体重増加抑制と脳重量の低 値がみられるものの,
ニューロン新生には影響はみられなかった。したがって,
ニコチンの 発達期曝露によるニューロン新生への影響は発達期低栄養による二次的な影響ではないと 考えられた。Dcx
はtype-2b, type-3
前駆細胞および未成熟ニューロンに（44
）, Tbr2
はtype-2
前駆細胞 に（39）, TUC4
は未成熟ニューロンに（45）,
それぞれ発現する分子である。本実験では, 生 後21
日にDcx
陽性細胞の増加が10 ppm
以上に, TUC4陽性細胞の減少が2 ppm
にみられ, 二 重染色を用いた検討では未成熟ニューロンの減少を示唆するTUC4
陽性/ Dcx陽性または陰 性細胞の減少が2
および10 ppm
にみられた。また,
同群ではTUC4
陰性/Dcx
陽性細胞の増 加もみられた。さらに, Tbr2
陰性/ Dcx
陽性細胞の増加が50 ppm
にみられたが, Tbr2
陽性細 胞に変動はみられなかった。これらの変化を総括するとTbr2
陽性細胞に変化はみられてい ないことから, 2および10 ppm
のTUC4
陰性/Dcx陽性細胞の増加ならびに50 ppm
のTbr2
陰性/ Dcx陽性細胞の増加はtype-3
前駆細胞の増加を示唆する変化と考えられた。また, SGZにおける
TUNEL
陽性アポトーシス細胞およびPCNA
陽性増殖細胞に変動はなく, 顆粒細胞層の
NeuN
陽性細胞数にも変動はなかったことから, type-3前駆細胞の増加および未成熟ニ ューロンの減少は, type-3
前駆細胞から未成熟ニューロンへの分化の遅延による変化である67
と推測された。上述の如く
,
これらの変化は用量反応性が明確ではなかったが,
同様の変化 がニコチンを成獣ラットに処理した実験で報告されており, 用量反応性のない未成熟ニュ ーロンの減少を示す歯状回の発達遅延がみられている（1）歯状回門のニューロンでは
GAD67
陽性GABA
性介在ニューロンとNeuN
陽性ニューロン の増加が生後21
日にみられた。げっ歯類の歯状回門では, GABA
性介在ニューロンは他の ニューロンとほぼ同数存在することが知られている（40
）。アクリルアミドを発達期曝露し た実験では,
子動物の歯状回門でReelin
陽性介在ニューロンとNeuN
陽性ニューロンの増加 がみられており（55
）,
発達期甲状腺機能低下モデルラットでは成長後におけるGAD67
陽 性介在ニューロンの増加と離乳時におけるcalbindin-D28K
陽性介在ニューロンの増加が確 認されている（65）。これらの結果は, ニューロン新生への影響のタイプと強さによって, 異 なるタイプの介在ニューロンが影響を受けることを示すものと考えられた。したがって,
ニ コチンの発達期曝露では成熟型のGABA
性介在ニューロンが一時的に増加するものと判断 された。しかしながら,
顆粒細胞の移動と位置決定に重要な役割を果たすreelin
については,
その陽性細胞に変動はみられず,
アクリルアミド発達期曝露（55
）や発達期甲状腺機能低下 モデル（65）とは異なる結果であった。コリン性の刺激は
GABA
性介在ニューロンを活性化し, 前駆細胞へのGABA
の放出を介 してSGZ
の前駆細胞の分化を調節することが明らかにされている（78）。したがって, GABA 性介在ニューロンの変動はコリン性の刺激に変動を与え,
海馬顆粒細胞の分化に影響を与 える可能性がある。また,
歯状回の前駆細胞と新生ニューロンは様々なタイプのアエチルコ リンレセプターを発現しており（14
）,
特にNAChRα7
がニコチンの標的となることが示さ れている（73）。しかしながら, 顆粒際層下帯におけるNAChRα7
陽性/Neun陰性前駆細胞に 変動はみられず, real-time RT-PCRによるChrna7およびChrnb2のmRNA
発現にも変動はみ られなかったことから, 本実験ではSGZ
の前駆細胞が有するNAChR
への直接的な刺激は海 馬顆粒細胞の変動に関与していないものと考えられた。妊娠期における喫煙は児の甲状腺機能に影響を与えることが報告されている（
62
）が,
喫68
煙に関連した甲状腺への有害作用はニコチンによるものではないことが示されている（
16
）。 本実験では生後21
日の子動物に明らかな影響は認められなかった。また, 生後77
日にT
4 の変動がみられたものの同時期にニューロン新生への影響はみられておらず, 本実験では ニューロン新生の変化と甲状腺関連ホルモンは関連しないものと考えられた。コチニンは哺乳類におけるニコチンの代謝物の中で主要な代謝物である（
52
）。妊娠女性 の喫煙はその児の尿中コチニンおよびニコチン濃度を上昇させ（41
）,
母乳中のコチニンお よびニコチン濃度は母親の喫煙行動と比例することが報告されている（42
）。本実験でも,
子 動物の尿中コチニン濃度が用量に応じて上昇し,
ラットにおけるコチニンの胎盤および乳 汁移行が確認された。69
小 括
第
4
章では, コリン作動性神経毒ニコチンを用いて検討を行った。ニコチンの発達期曝露は, 可逆性ではあるもののラット子動物の海馬歯状回におけるニ ューロン新生の後期に影響を及ぼした。この影響は
2 ppm
以上の子動物にみられたことか ら,
本実験における子動物の最小毒性量は2 ppm
（ニコチンフリー体換算で0.091mg/kg/day
） であった。アメリカにおける一般的な喫煙者のニコチン摂取量は0.2 mg/kg/day
であり,
（59
）,
本実験の
10 ppm
に相当する。したがって,
一般的な喫煙者は子の体重および海馬SGZ
の後期ニューロン新生と歯状回門の
GABA
性介在ニューロンへの影響が懸念される。以上より, ニコチンのラットを用いた発達期曝露は, type-3前駆細胞から未成熟ニューロンへの分化の 遅延とそれに関連した成熟型のGABA
性介在ニューロンの増加を引き起こした。本研究の 実施により,
今回新たにニコチンによるニューロン新生後期の分化遅延を標的とした可逆 性の発達神経毒性が見出されたことから,
コリン作動性神経毒による発達神経毒性の解析 には,
曝露終了時と成熟後での海馬歯状回顆粒細胞系譜とGABA
性介在ニューロンの変動 解析が有効であることが示された。70
総合考察
本研究では, 短期スクリーニングに適う発達神経毒性評価系の確立を目的として, ニュ ーロン新生に着目し, 神経病理学的解析に特化した評価法の検討を実施した。
現在
,
発達神経毒性を評価するためのガイドラインとしてOECD
のTG426
およびEPA
のOPPTS 870.6300
が発効され,
評価に用いられているが,
いずれも母動物および子動物を合わせると
700
匹以上のラットを使用し,
評価に約1
年を要する大規模な高次試験であること から,
小規模で短期のスクリーニング評価系を確立する必要があると考えられている（17
）。第
1
章では, IUGRモデル（36, 86）を利用して発達期に低たん白食を母動物に与えること により低栄養性の脳発達遅延の子動物を作出し, 海馬歯状回でのニューロン新生への影響 を検討した。その結果,
母動物を介した発達期低栄養では子動物に生後21
および77
日のい ずれにおいても海馬歯状回門におけるReelin, Calb-D-28K
およびGAD67
陽性細胞の分布に 影響はなく, NeuN
陽性ニューロンおよびSGZ
における細胞増殖やアポトーシスにも変動は みられなかった。したがって,
海馬歯状回のニューロン発達障害性に着目して発達期神経影 響を評価するうえで, 化学物質による脳作用と母体毒性を介した非特異的な低栄養性脳発 達遅延の影響を弁別することが可能であることが明らかとなった。第
2
章では, ドーパミン作動性ニューロン傷害性のパーキンソニズム様の症状を引き起 こすことで知られる神経毒マンガンの発達期曝露を行い海馬SGZ
における細胞増殖とアポ トーシスならびに顆粒細胞の系譜の検索と歯状回門におけるReelin
産生介在ニューロンの 分布の検索を行った。その結果, Mn
の発達期曝露はSGZ
のDcx
の発現分布に影響を及ぼす ことが生後21
日で確認された。Dcxはtype-2b
およびtype-3
神経前駆細胞ならびに未成熟 ニューロンにおいて発現することが知られているが（44）, type-2神経前駆細胞で発現を示 すTbr2
では陽性細胞数に変動はみられなかった（39）ことから, Dcx陽性細胞数の増加はtype-3
細胞または未熟顆粒細胞の増加を示唆するものと考えられた。海馬歯状回門ではReelin
陽性細胞の増加が生後21
日で確認された。Reelin
はGABA
性介在ニューロンから分
ドキュメント内
ニューロン新生に着目した化学物質の発達期神経毒性評価法の確立に関する研究
(ページ 66-75)