ア ミ ラ ー ゼ は 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社(大 阪)， ア ミ ロ グ ル コ シ ダ ー ゼ は シ グ マ ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン 合 同 会 社(東 京) ， イ ン ベ ル タ ー ゼ は 東 洋 紡 株 式 会 社 (大 阪)よ り 購 入 し た 。 と ろ み 調 整 剤 は デ ン プ ン 系(商 品 A)， グ ァ ー ガ ム 系(商 品 B)お よ び キ サ ン タ ン ガ ム 系(商 品 C)を 使 用 し た 。4-ア ミ ノ 安 息 香 酸 エ チ ル エ ス テ ル お よ び ピ リ ジ ン ボ ラ ン コ ン プ レ ッ ク ス は 東 京 化 成 工 業 株 式 会 社 (東 京)よ り 購 入 し た 。 ス ト レ プ ト ゾ ト シ ン(STZ)は ナ カ ラ イ テ ス ク 株 式 会 社(京 都)よ り 購 入 し た 。
4.2.2 実 験 動 物
5~7 週 齢 の 雄 性 ICR 系 マ ウ ス(体 重 26~32 g， 日 本 SLC 株 式 会 社 ， 静 岡)を 使 用 し た 。 マ ウ ス は 24 ± 2 ˚Cで 飼 育 し ， 実 験 ま で 固 形 飼 料(MF， オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 株 式 会 社 ，東 京)や 水 を 自 由 に 摂 取 で き る 環 境 に お い た 。全 て の 動 物 実 験 は 近 畿 大 学 動 物 実 験 規 程 に 従 い 行 っ た 。
4.2.3 と ろ み 調 整 剤 の 消 化 酵 素 処 理
と ろ み 調 整 剤 を Englyst ら の 方 法 に 従 い 消 化 酵 素 処 理 を 行 っ た 3 5 )。 人 工 胃 液 お よ び 人 工 腸 液 は 次 の よ う に 調 製 し た 。 す な わ ち ， 人 工 胃 液 は 第 十 七 改 正 日 本 薬 局 方 溶 出 試 験 第 1 液 に 従 い ， 塩 化 ナ ト リ ウ ム 2 g を 塩 酸 7 mL お よ び 水 に 溶 か し て 1,000 mL と な る よ う 調 製 し た(pH 1.2)。 人 工 腸 液 は 日 本 薬 局 方 溶 出 試 験 第 2 液 に 従 い ，pH 6.8 の リ ン 酸 緩 衝 液 と 水 を 1 : 1 で 混 合 し た 。酵 素 溶 液 は ア ミ ラ ー ゼ ， ア ミ ロ グ ル コ シ ダ ー ゼ お よ び イ ン ベ ル タ ー ゼ を そ れ ぞ れ 3.84 mg/mL と な る よ う 人 工 腸 液 で 溶 解 し た 。 デ キ ス ト リ ン ， グ ァ ー ガ ム ， キ サ ン タ ン ガ ム の 多 糖 類 お よ び デ ン プ ン 系 ， グ ァ ー ガ ム 系 ， キ サ ン タ ン ガ ム 系 の と ろ み 調 整 剤 1 %(w/v)に な る よ う に 水 に 溶 解 し た 。多 糖 類 お よ び と ろ み 調 整 剤 の 1%溶 液 5 mL
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に 人 工 胃 液 4 mL を 加 え 37˚C で 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。 そ の 後 ， 2.5 M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム に よ り pH 5.2 に 調 製 し ， 各 酵 素 溶 液 1 mL を 添 加 し て 37˚C で 酵 素 反 応 を 開 始 し た 。 反 応 開 始 後 0，10，20，30，60，120，240 分 に 経 時 的 に 反 応 液 100 µL を 採 取 し ， エ タ ノ ー ル を 300 µL加 え 激 し く 撹 拌 す る こ と で 反 応 を 停 止 さ せ た 。 遠 心 分 離 後(1,500 × g，10 分)， 上 清 を 回 収 し 消 化 酵 素 処 理 に よ り 生 成 し た グ ル コ ー ス を 分 離 し た 。
4.2.4 グ ル コ ー ス の 定 量 法
Wang ら の 方 法 3 6 )を 応 用 し ，4-ア ミ ノ 安 息 香 酸 エ チ ル エ ス テ ル(ABEE)化 試 薬 (表 10)を 用 い ， 生 成 し た グ ル コ ー ス を 蛍 光 標 識 化 し た(図 26)。 す な わ ち ， 反 応 用 試 験 管 に サ ン プ ル 10 µL と 内 部 標 準 物 質 と し て 300 µMリ ボ ー ス を 10 µL 添 加 し ，ABEE 化 試 薬 40 µL を 加 え 80˚C で 60 分 間 加 熱 し た 。 反 応 終 了 後 200 µL の 蒸 留 水 を 加 え ，次 い で 同 量 の ク ロ ロ ホ ル ム を 加 え 遠 心 分 離 し(10,000×g，10 分)， 過 剰 の ABEEを 除 去 し た 。 水 層 を HPLC 法 に よ る 測 定 試 料 と し た 。
表 10 ABEE 化 試 薬 の 組 成 ABEE 化 試 薬
4-アミノ安 息 香 酸 エチルエステル 165.19 mg
酢 酸 41 L
ピリジンボランコンプレックス 52 L
メタノール 350 L
図 26 ABEE に よ る グ ル コ ー ス の 蛍 光 標 識 化
単 糖 4 -ア ミ ノ 安 息 香 酸 エ チ ル エ ス テ ル
80˚C 60min
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HPLC 分 析 は ，Agilent Technologies 1200 series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を 用 い て 行 っ た 。分 離 用 カ ラ ム は InertSustain C18 (4.6 mm×75 mm， 3 µm, GL Sciences， 東 京)を 使 用 し ， カ ラ ム 温 度 は 30 ˚Cに 設 定 し た 。 移 動 相 は A 液(0.2 M ホ ウ 酸 カ リ ウ ム 緩 衝 液(pH 8.9) : ア セ ト ニ ト リ ル ，93 : 7)，B液(0.02%
ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 : ア セ ト ニ ト リ ル ，50 : 50)，流 速 は 1.0 mL/min で 測 定 し た 。 分 離 用 カ ラ ム は A 液 で 40 分 間 分 析 し た 後 ，B液 で 20 分 間 洗 浄 し ，A 液 で 20 分 間 平 衡 化 し た 。 試 料 注 入 量 は 5 μL， 検 出 波 長 は Ex. 305 nm，Em. 360 nm で 測 定 し た 。
0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 mM に 調 製 し た グ ル コ ー ス 標 準 溶 液 に て 検 量 線 を 作 成 し ， 試 料 中 の グ ル コ ー ス 濃 度 を 定 量 し た 。 な お ， 今 回 の サ ン プ ル の 測 定 値 は す べ て こ の 範 囲 内 で あ っ た 。
4.2.5 健 常 マ ウ ス へ の と ろ み 調 整 剤 投 与 に よ る 血 糖 値 へ の 影 響
一 晩(20 時 間)絶 食 さ せ た 条 件 で 健 常 マ ウ ス に グ ル コ ー ス(0.6 g/kg)ま た は 各 系 統 (商 品 A，Bお よ び C)の と ろ み 調 整 剤(表 11)を 経 口 投 与 し ， 血 糖 値 を 評 価 し た 。
と ろ み 調 整 剤 の 投 与 量 は 製 品 に 記 載 さ れ て い る 推 奨 量 よ り 算 出 し た 。 と ろ み 調 整 剤 の 投 与 量 は ， 諸 口 ら の 報 告 よ り 高 齢 者 の 体 重 を 50 kg と し た 場 合 3 7 )， デ ン プ ン 系 と ろ み 調 整 剤 で 考 え る と ，150 mLの 味 噌 汁 を ケ チ ャ ッ プ 状 に す る た め に 約 14 g，200 mL の 水 を ケ チ ャ ッ プ 状 に す る た め に 約 14 g，そ の 他 の 料 理 の あ ん か け な ど に 約 7 g 使 用 し た 場 合 と 同 量 で あ り ， 高 齢 者 が 1回 の 食 事 に 使 用 す る と ろ み 調 整 剤 と ほ ぼ 同 等 の 量 で あ る 。 各 濃 度 に 調 製 し た と ろ み 調 整 剤 を ， ゾ ン デ を 用 い て マ ウ ス に 経 口 投 与 後 ，血 糖 値 を 測 定 し た 。経 口 投 与 直 前(0 分)，投 与 後 15，30，60，120分 と 経 時 的 に 尾 静 脈 を 20 G の 注 射 針 で 穿 刺 に よ り 出 血 さ せ ，実 験 動 物 用 グ ル コ ー ス 測 定 器(ラボグルコ，リサーチ・アンド・イノベーション ジャパン株 式 会 社 ， 千 葉)で 血 糖 値 を 測 定 し た 。 な お ， コ ン ト ロ ー ル 群 に は 同 量 (10 µL/g)の 生 理 食 塩 水 を 経 口 投 与 し た 。 ま た ， ス ト レ ス に よ る 血 糖 値 へ の 影 響 を 考 慮 す る た め ， 経 口 投 与 15 分 前 に 尾 静 脈 を 20 Gの 注 射 針 で 穿 刺 し た 。
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表 11 と ろ み 調 整 剤 の 原 材 料 と マ ウ ス へ の 経 口 投 与 量
分 類 原 材 料 投 与 濃 度
デンプン系 デキストリン，加 工 デン プン 0.71 g/kg グァーガム系 デキストリン，でん粉 ，増 粘 多 糖 類 0.3 g/kg
キサンタンガム系 デキストリン，キサンタンガム，
0.3 g/kg 乳 酸 カルシウム，クエン酸 三 ナトリウム
4.2.6 糖 尿 病 マ ウ ス へ の と ろ み 調 整 剤 投 与 に よ る 血 糖 値 へ の 影 響
Shimizuら の 方 法 に 従 い 3 8 )，一 晩 (20 時 間)絶 食 さ せ た マ ウ ス に ，ス ト レ プ ト ゾ ト シ ン(STZ)を 腹 腔 内 投 与(200 mg/kg)し ，そ の 後 固 形 飼 料 や 水 を 自 由 に 摂 取 で き る 環 境 に お い た 。STZ 投 与 6 日 後 に マ ウ ス の 尾 静 脈 よ り 採 血 し ， 血 糖 値 が 400 mg/dL以 上 の 個 体 を STZ誘 発 糖 尿 病 マ ウ ス と し て 使 用 し た 3 9 , 4 0 )。
STZ誘 発 糖 尿 病 マ ウ ス へ の と ろ み 調 整 剤 の 投 与 量 ， 絶 食 時 間 ， 溶 液 の 調 製 方 法 お よ び 投 与 方 法 は ， 先 の 健 常 マ ウ ス と 同 様 に 行 っ た 。STZ誘 発 糖 尿 病 マ ウ ス に 経 口 投 与 す る 直 前 に 採 血 し(0 分)， 投 与 後 30，60 分 と 経 時 的 に 尾 静 脈 か ら 採 血 し た 。 採 血 は 測 定 時 間 ご と に 尾 静 脈 に カ ミ ソ リ で 傷 を 入 れ ， ヘ パ リ ン を 通 し た ピ ペ ッ ト で 約 100 µL の 血 液 を 採 取 し ，3,000 rpm，4˚C で 10 分 間 遠 心 分 離 後 ， 血 漿 を 回 収 し 試 料 と し た 。
4.2.7 酵 素 反 応 に よ る 血 糖 値 の 測 定
Glucose Colorimetric Assay Kit (Cayman Chemical Company，MI，USA)を 用 い ， グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ 法 に よ り 血 糖 値 を 測 定 し た 。96 wellプ レ ー ト に Sodium Phosphate Assay Buffer を 85 µLず つ 添 加 後 ，Sodium Phosphate Assay Buffer で 40 倍 希 釈 し た 血 漿 サ ン プ ル を 15 µL ず つ 加 え ，Glucose Colorimetric Enzyme Mixture を 各 well に 100 µLず つ 添 加 し 反 応 を 開 始 し た 。37˚C で 10 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し ，Sunrise(TECAN Austria，Austria)を 用 い て 492 nm の 吸 光 度 を 測 定 し た 。
51 4.2.8 統 計 解 析
各 実 験 項 目 の 測 定 値 は 平 均 値±標 準 偏 差 で 示 し ， 有 意 差 の 検 定 に は Student’s t-test あ る い は Dunnet の 多 重 検 定 法 を 用 い た 。検 定 の 有 意 水 準 は 5%と し ，p値 が 5%未 満 の 時 を 有 意 と し た 。