実験材料・方法

本実験計画は、ファイザー株式会社 名古屋研究所及び帝人ファーマ株式会社 生物医学総 合研究所の動物実験委員会にて審査された。その後、承認されたプロトコールに基づいて本 研究が実施された。

2.1.1 実験動物

雄性SD系ラット（251-293 g、日本チャールスリバー）及び雄性ddy系マウス（第一章と 同じ）を用いた。ラットは、実験に使用するまで明暗サイクル 12 時間（明期 7:00-19:00）、

室温 23±2℃、湿度 55±15%の一定環境下で動物を飼育した。飼養中の動物には水及び固型飼

料を自由に摂取させた。

雄性ddy系マウスは、第一章と同様の環境下で飼育した。

2.1.2 被験薬

選択的 TRPV1 チャネル遮断薬の BCTC（N-(4-tertiarybutylphenyl)-4-(3-chloropyridin-2-yl)

tetrahydropyrazine-1(2H)-carbox-amide）はファイザー株式会社 名古屋研究所で合成あるいは

ENZO^® Life Science（Farmingdale、NY、USA）から購入した。カプサイシン誘導体である

resiniferatoxin（RTX）はSigma（St Louis、MO、USA）から購入した。BCTCは、0.5%メチル

セルロース溶液／Tween80（95:5 v/v）に懸濁させ経口投与した。Resiniferatoxinは、エタノー ル／Tween80／生理食塩液（10/10/80 v/v/v）に溶解させ皮下投与した。

2.1.3 神経障害性疼痛モデルの作製

2.1.3.1 坐骨神経絞扼モデルの作製

神経障害性疼痛モデルでのTRPV1チャネルの分布を調べるため、ラットで文献報告の多い 坐骨神経絞扼モデル（chronic constriction injury、CCI モデル）を作製した⁴³⁾。ラットを、ペ ントバルビタールナトリウム（60 mg/kg）腹腔内投与で麻酔した。左側大腿部中央の皮膚を 切開し、坐骨神経束を露出させた。4-0絹糸を用いて、当該神経束を4回結紮し、その後皮膚 を縫合した。偽手術（sham）は坐骨神経剥離まで行い、神経束を結紮せずに皮膚を縫合した。

2.1.3.2 PSLモデルの作製

第一章と同様に、マウスを用いて作製した。

2.1.4 疼痛行動の評価

CCIラットの疼痛行動の評価は、Fieldらの方法⁴⁴⁾に従って実施した（Figure 17）。ラット を床面が格子状になった実験架台上に乗せ、約1 時間実験環境に馴化させた。その後、直径 の異なる12本のVFフィラメント（0.16、0.4、0.6、1、1.4、2、4、6、8、10、15及び26 g）

を用いてラット後肢足底を刺激した。刺激は、最も細い VF フィラメントから順に行った。

VFフィラメントをラットの後肢足底に約6秒間押し当て、逃避行動の有無を観察した。逃避

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行動が認められた最小の VF フィラメント刺激を、そのラットの疼痛閾値（paw withdrawal

threshold、PWT）とした。疼痛閾値が2 g以下のラットを神経障害性疼痛発症と判定し、本実

験で疼痛モデルとして使用した。

PSLマウスの疼痛行動の評価は、第一章と同様に行った。

Figure 17 Schematic of measurement of paw withdrawal threshold (PWT) using von Frey (VF) filaments in rats.

2.1.5 免疫染色用組織標本の作製

CCIラットをペントバルビタールナトリウム（70-80 mg/kg）腹腔内投与により麻酔し、200

mLの100 mmol/L PBS（pH7.4）で経心的に灌流することにより、組織内の血液を除去した。

続いて、300 mLの4%パラホルムアルデヒド含有PBSで灌流固定した。灌流固定後、腰部脊 椎を切り出し、第四及び第五腰椎部（L4及びL5）の後根神経節（DRG）を単離し、4%パラ ホルムアルデヒド含有 PBS で一晩固定した。次に、10、15 及び 20%のスクロース含有 PBS の順に、組織を浸漬させた。水溶性包埋剤のOCT compoundを用いて、液体窒素下で組織ブ ロックを凍結させ、凍結ブロックを作製した。この凍結ブロックからクリオスタットを用い て、8 μm の薄切切片を作製した。

2.1.6 免疫染色

一次抗体の非特異的反応を抑制するために、10% normal goat serum及び0.3% Triton X-100 を含むCAS BLOCK（ZYMED Laboratories、South San Francisco、CA、USA）（以下、blocking

buffer）で2時間処置した。その後、免疫蛍光染色を行った。下に示す一次抗体をblocking buffer

で希釈し、それぞれ室温で一晩反応させた。反応後、切片をPBSで洗浄した。その後、blocking

buffer で希釈した二次抗体を、室温で2時間反応させた。切片を PBSで洗浄後、カバーガラ

スで封入した。組織切片の観察は共焦点レーザー顕微鏡（LSM5 PASCAL; CarlZeiss、 Őberkochen、Germany）を用いて行った。

一次抗体

 goat anti-TRPV1 N-terminus（100倍希釈; Santa Cruz Biotech. Inc.、Santa Cruz、CA、USA）

 mouse anti-NF200（3000倍希釈; Sigma, St. Louis、MO、USA）

29 二次抗体

 rhodamine red-X conjugated donkey anti-goat immunoglobulin G（3 μg/mL; Jackson ImmunoResearch Lab. Inc.、West Grove、PA、USA）

 Alexa Fluor 488 conjugated donkey anti-mouse immunoglobulin G（3 μg/mL; Molecular Probes Inc.、Eugene、OR、USA）

2.1.7 組織学的解析

組織標本のTRPV1チャネル及びNF200（A線維マーカー）陽性細胞数を測定した。個々の 細胞径も測定し、後根神経節の神経細胞を、小型（< 25 μm）、中型（25-45 μm）及び大型（>

45 μm）に分類した⁴⁵⁾。

2.1.8 実験プロトコール

本章での実験プロトコールをFigure 18に示す。

Protocol 5： TRPV1チャネルの分布を調べるため、CCIラットを作製し、その2週間後に、

結紮側の腰部（L4-L5）後根神経節を採取した。

Protocol 6： BCTCの神経障害性疼痛に対する効果を調べるため、神経障害性疼痛を発症し

た結紮2週間後のCCIラットあるいはPSLマウスにBCTCを経口投与し、その1、2及び4 時間後に疼痛閾値を測定した。

Protocol 7： Resiniferatoxin（RTX）の神経障害性疼痛に対する効果を調べるため、神経障害

性疼痛を発症した結紮2週間後のCCIラットにRTXを皮下投与し、その1、4及び7日後に 疼痛閾値を測定した。

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Figure 18 Experimental protocols of TRPV1 ligands treatment for the neuropathic pain.

CCI; chronic constriction injury of sciatic nerve, PSL; partial sciatic nerve ligation, RTX;

resiniferatoxin, PWT; paw withdrawal threshold, p.o.; per os, s.c.; subcutaneous injection

2.1.9 統計処理

疼痛閾値は各群の中央値で示した。また、25及び75%反応値を算出した。神経障害性疼痛 の発症確認のため、Sham/溶媒対照群と CCI/溶媒対照群あるいは PSL/溶媒対照群の比較を、

Mann-Whitney’s U-test（Figure 20及びFigure 22）あるいはWilcoxon’s test（Figure 24）で行っ た。BCTCの評価は、溶媒対照群とBCTC投与群で、Dunn’s test（Figure 20及びFigure 21）

あるいはDunnett’s test（Figure 22及びFigure 23）で行った。Resiniferatoxinの評価は、溶媒対 照群とresiniferatoxin群で、Mann-Whitney’s U-testで行った（Figure 24及びFigure 25）。いず れの検定も有意水準は5%とした。

1 h CCI or PSL or sham 0

4 h 2 h

BCTC, p.o.

Protocol 6: Effects of BCTC on neuropathic pain in rats with CCI or mice with PSL.

PWT measurement 2 weeks

Day 1

CCI or sham RTX, s.c. Day 4 Day 7

PWT measurement 2 weeks

Protocol 7: Effects of RTX on neuropathic pain in rats with CCI.

CCI 2 weeks

Protocol 5: Histopathological examination of dorsal root ganglion neurons in rats with CCI.

Sampling

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