化学の 窓
Plipastatin と Fengycin における構造混乱終結
物質の生理活性や物理的特性を決定する最大因子は，
分子内の置換基や電荷の空間的広がりを決定する分子構 造である．一方，これまでに多くの天然物の構造が決定 されてきたが，その構造が訂正されてきた例も決して少 な く な い （1） ．Plipastatin A1（以 下 plipastatin） （2） と fengycin X1（以下 fengycin） （3） も構造混乱が長く続い た例と言える．これら天然物は多くの論文で別の構造を もつと報告されてきたが，複数の知見から同一物質の可 能性も示唆されてきた．最近筆者らは，これら天然物は 同一物質であり，その構造は plipastatin のそれに収斂さ れることを実験的に証明した （4） ．
Plipastatin は，1986 年梅澤濱夫先生らによって食中毒 原 因 菌 の 一 つ バ シ ラ ス 属 セ レ ウ ス 菌（
BMG302-fF67 株） か ら 単 離 さ れ た （2） ．一 方，fengycin は Vanittanakom らによって同年にバシラス属の枯草菌
（ F-29-3 株）から単離された．興味深いこと に，これらは 誌 （3） の同一号に報 告された．Plipastatin を報告した梅澤らは連続する 4 報 の論文のなかで詳細に構造を議論し，環状デプシペプチ ド構造 1 を提出した（ 図1 ）．一方，Vanittanakom らは fengycin の構造について plipastatin と同一の構成アミノ 酸を報告したにとどまっていた．Fengycin の全体構造 は，1999 年，Budzikiewicz-Deleu らによって plipastatin の L -Tyr4 と D -Tyr10 が入れ替わったジアステレオマー 2 として報告された．彼らは fengycin をクロム酸処理後，
酸加水分解したところ L -Tyr の消失を確認し， L -Tyr10 と決定した （5） ．また，plipastatin と fengycin では生理活 性が大きく異なるとも述べている．後に か らも plipastatin が単離報告されているが，当初は生産菌 が異なっており，別構造を考えたことにさほど矛盾がな かったと言える．さらに，両者の NMR スペクトルは異 なると報告されるなど，両者が別物質であるという考え 方は定着した．
Fengycin は広い抗菌スペクトルを示す．生産菌であ る枯草菌 （ ） はいわゆるナットウ菌 （
var. ） を含むように，枯草菌の安全性は経験的 に証明されている．以上のことから，菌自身をフィール ドに散布する生物農薬としての応用も期待されてい る （6） ．このような背景の下，これまでに 200 を超える学 術論文が報告されてきた．生合成研究もその一つで，多 くのグループにより非リボソーム生合成の詳細が報告さ れている．その生合成酵素クラスター中，ラセマーゼと 考えられる配列はむしろ plipastin の構造を支持するも のであったことなどから，構造について矛盾・混乱が発 生した．これら化合物について依然ジアステレオマーと 記述する論文も少なくないが，矛盾回避のためか， L - Gln8 を L -Glu8 としたもの や 同一物質 といった記 載するものなど （7） ，さらに 非常に類似した物質 と いった曖昧な表現をする論文も見られた （8） ．ケアレスミ スと思われるものを含めると 5 種類以上の構造が存在す る．構造の混乱を記述した論文も複数存在する．しか し，前述の構造決定の論文以降，MSMS 解析によりア ミノ酸配列を確認したものを除いて，天然物を用いた構 造確認を行った報告は全くなかった．
さて，筆者らは新規有用生理活性二次代謝物の探索研 究を展開している．その一環で本学植物病理学教室の糸 状菌ライブラリーから紫紋羽病菌を恵与いただき培養し たところ，その培養液に強い抗菌活性を観察した．実際 には紫紋羽病菌ではなくコンタミした枯草菌 H336B を培養していたのだが，微生物培養に疎い筆者 は，紫紋羽病菌の培養は容易ではないことを知らず，培 養ろ液残渣の形態が通常の糸状菌とは異なるとか，抽出 液にブタノール臭があるなど違和感を覚えながらも，目 的菌を培養したと信じて疑わず単離構造決定を行った．
コンタミが判明したのは，活性成分がバクテリアの生産 物 plipastin あるいは fengycin であると判明，さらに本
菌の提供者である原田幸雄弘前大学名誉教授から「あの 菌，培養難しかったよね」と言われた後であり，結果的 にこれが功を奏したとはいえ，あまりにもお粗末な培養 であった．
説明の都合上，われわれの単離した化合物を A と呼 ぶこととする．単離した A の分子式は質量分析計によ り C 72 H 110 N 12 O 20 を候補分子式とし，NMR スペクトルの プロフィールよりペプチド性化合物であると推定した．
A は塩基性条件下容易にメタノール付加体 3 を与えた．
このことにより，本化合物はラクトン構造，すなわち環 状デプシペプチド（デプシペプチド：エステルやチオエ ステルを有する分子内に有するペプチド化合物）である と判断した（直鎖構造であればフラッグメント化，分子 量は減少する）．次に A を酸加水分解，生じたアミノ酸 混合物に Marfey 法により不斉補助基を導入後，続いて LCMS を 用 い た 解 析 各 ア ミ ノ 酸 の 絶 対 配 置 を 決 定 し た （9） ．ペプチドの酸加水分解で Gln 残基は Glu となって しまうが，推定分子式の窒素数を考慮することにより，
構成アミノ酸を L -Glu（×2）, L -Gln, L -Orn, D - -Thr, D - Ala, L -Pro, L -Ile と，両鏡像体の Tyr と決定した．未帰属 の 16 炭素については二次元 NMR スペクトルの解析によ り，3-ヒドロキシヘキサデカン酸ユニット （Acyl1） を 推定した．本ユニットは塩基性アルコリシスを受けな かったことから，アミド結合によりペプチド部と結合し ていると判断した．これによりすべての炭素を帰属する ことができ，水素不飽和指数から単環式化合物であると 決定した．以上の情報を基に文献を検索したところ， A は plipastatin，あるいは fengycin のいずれかであると判 明した．NMR スペクトルを文献値と比較したところ，
fengycin とほぼ一致したが，plipastatin とは明確な違い が見られた．
筆者らの精製では，最終段階で 0.1% トリフルオロ酢 酸を用いた逆相 HPLC 分取を用いており，精製後の A は遊離酸，あるいはトリフルオロ酢酸塩である．文献に おける fengycin の精製も同様であった．一方，梅澤ら の plipastatin の精製最終段階では，酢酸‒酢酸カリウム 図1■Plitastatinおよびfengycinの旧構造と収斂した構造，および文献で見られるfenzycin生合成酵素クラスター
図2■活性成分Aの 1 H NMR スペ ク ト ル（DMSO- 6 , 500 MHz, 下：
TFA含有条件でODSカラムで精製 したもの，上：酢酸カリウム／ゲル ろ過によりK ＋ に変換したもの）
緩衝液を用いた逆相 HPLC 分取，その後ゲルろ過により 脱塩を行っており，精製された plipastatin はその構造か らカリウム塩といえる．筆者らは A が plipastatin でない ことを確認する目的で，精製した A を酢酸カリウム水 溶液で希釈した後，梅澤らの文献の最終段階と同じ手法 で脱塩を行い， 1 H NMR を測定したところ，スペクト ルは劇的に変化し，plipastatin のそれとほぼ完全に一致 することが判明した（ 図2 ）．上記操作で異性化など構 造変化が起きていないことは，処理前後の LCMS を比 較 し て 確 認 し た．こ れ ら の 実 験 か ら，plipastatin と fengycin は同一物質であることが初めて実験的に証明さ れた．言い換えると，plipastatin と fengycin のいずれか
（あるいは両方）の構造に間違いがあることになる．そ こで，筆者らは今回単離した A を演繹的に構造決定し，
構造混乱の収斂を目指すこととした．
まず，ペプチド配列の解析から検討を開始した（ 図 3 ）． 13 C NMR スペクトルにおける A のカルボニルシグ ナルの分離は悪く，HMBC 解析からペプチド配列決定 することはできなかった．そこでメタノールおよび水で 環開裂させた 3 および 4 を用いて，MSMS 解析によりペ プチドの配列を決定した．原理的に b イオン（N 末端 側）は 3 , 4 とも同一質量であるのに対し，y イオン（C 末端側）では，メチルエステルである 3 のほうがカルボ ン酸である 4 に比較して 14 u 大きく現れることを利用し て フ ラ ッ グ メ ン ト イ オ ン 帰 属 を 確 実 に し た．ま た，
Pro8‒Gln9 間のペプチド結合が開裂した b 8 および y 3 イ オンはいずれも観測されなかったが，ESI 法におけるペ プチドの CID（衝突誘起解離）ではアミド水素の存在が 必要であるというフラッグメント化機構に矛盾しな い （10） ．また， 3 は Ile11 のメチルエステルであることか ら Ile11 のカルボン酸部がラクトン環形成に関与してい ることも判明した． 3 および 4 の 1 H NMR スペクトルで は，天然物と比較して一対のチロシン芳香環シグナルが 有意に低周波シフトしたことからチロシンのフェノール 性水酸基がラクトン環を形成していると予想した．分子 内には 2 つのチロシン残基が存在するが，Ile11 の隣に位 置する Tyr10 とのラクトン形成は構造的に不可能なた め，Tyr4 とラクトン環を形成していると判断した．
次に Acyl1 部の絶対配置を検討した．梅澤らは分解生 成物 5 を精製しその比旋光度 （−35°, CHCl 3 ） から （ ）- 体と結論している．最近の報告では，化合物 5 は光学純 度 が 高 い も の で も そ の 比 旋 光 度 は 小 さ く［（ ）-体：
−6° CHCl 3 ］（11） ，信頼性のある被旋光度を測定するには 10 mg 量程度のサンプルが必要となる．今回のケースに 当てはめると，分解反応の収率が良いと仮定しても貴重 な天然物を 100 mg 近く分解する必要があり現実的とは 言えない．そこで適切な発色団を導入することにより微 量でキラリティー判別が可能となる円二色性 （CD） ス ペクトルを用いることとした （12） ． A （10 mg） を酸性メ タノール分解して 5 とした後，カルボン酸をアルコール 図3■ 筆 者 ら が 行 っ たplipastatin/
fengycinの構造決定
へ還元，CD スペクトルにおける高感度を期待して 2-ナ フ ト イ ル 基 を 導 入 し て 天 然 分 解 物 6 を 得 た．標 品 の
（ ）-体 6 は 1-pentadecene より確実な方法で合成した．
天然分解物 6 は 0.9 mg （UV 吸光度より算出）と微量で あったが，合成 （ ）-体 6 と 1 H NMR, HPLC 保持時間を 比較することによって確認することができた．次に CD スペクトルを測定したところ，両者ともに明瞭な同一の 負の分裂型コットン曲線を示したことから，Acyl1 部の 水酸基は（ ）-配置であると決定した．なお， 6 の CD ス ペクトルは極めて高感度で，実際の測定では天然分解物
6 を 100 倍希釈するが必要であった．
これまでの知見は，plipastatin, fengycin いずれの構 造にも矛盾しない．残る可能性は，Tyr4, Tyr10 のキラ リティーの違いのみである．Budzikiewicz-Deleu らによ る fengycin の Tyr 残基の絶対配置決定については前述 したが，その議論を否定はできないものの構造決定法と しては釈然としない．一方，梅澤らは遊離のチロシン フェノール部にジニトロフェニル基を導入し，その後分 解反応と組み合わせて D -Tyr10 を決定している．その一 方，加水分解体 4 をカルボキシペプチダーゼで処理し，
質量スペクトルでオクタペプチド Acyl1-Pro8 に相当す るイオンを検出したとも述べている．カルボキシペプチ ダーゼは L -アミノ酸を厳密に認識してペプチド鎖の C 側 から加水分解することを考慮すると， D -Tyr10 を有した ならばこの位置で反応は停止し，デカペプチド Acyl1- Tyr10 より小さなフラッグメントペプチドを与えないは ずある．したがって，plipastatin の構造にも疑問がない わけではなかった．
そこで，筆者らは， A （1.0 mg）を DNS［5-（dimethyl- amino）naphthalene-1-sulfonyl］化して Tyr-10 に DNS を 基フラッグとして導入した．実際には Orn3 も DNS 化さ れた bisDNS 誘導体 7 が得られた．DNS 基は強い UV 吸 収をもち，さらに DNS 基は ESI イオン化に有利なジメ チルアミノ基を有するため LCMS 分析では高感度が期 待できる．議論を複雑化させないため，この段階で HPLC を用いて精製した．そののち酸加水分解，得られ たアミノ酸混合物に Marfey 法により不斉補助基を導入 した．LCMS により分析したところ，Marfey 不斉補助 基が結合した L -Tyr，および （ -DNS）- D -Tyr 誘導体を検 出した．すなわち A において遊離のフェノール性水酸 基をもつのは D -Tyr，フェノール部がエステル化されて いるのは L -Tyr，すなわち L -Tyr4, D -Tyr10 を帰属するこ とができた．
以 上 の 実 験 結 果 か ら， A は 梅 澤 ら の 報 告 し た pli- pastatin と同一構造である．Plipastatin/fengycin が同一
物質という筆者らの結果を考え合わせると，ジアステレ オマーと考えられてきた fengycin の構造は間違いであ り，plipastatin のそれに収斂されると結論した．この構 造は fengycin 生合成酵素クラスターのラセマーゼの位 置にも矛盾せず，今後の生合成研究においても重要な知 見 で あ る と い え る．最 近，M. Deleu（fengycin を pli- pastatin のジアステレオマーと論じた論文著者の一人）
は，筆者らの結果を踏まえたうえで，その名称について は構造の正しい plipastatin に統一されるのではなく，論 文 数 が 圧 倒 的 に 多 い fengycin に 統 一 す る と 述 べ て い る （13） ことにも触れておく．
以上，長年続いた plipastatin/fengycin の構造混乱に 終止符を打つことができた．これら化合物は，いくつか の不幸な偶然が重なり，別物質という考えが定着してし まった．また，多くの研究者が確実な方法で構造を確認 することなく，近年急速に発達した LCMS などの比較 のみで構造を結論したことが，混乱に拍車をかけたと言 える．単離した物質の構造帰属では，文献との答え合わ せではなく，スペクトルなどの解析による構造の確認が 大切であると，改めて認識した経験であった．
謝辞：本研究を行うに当たり，新学術領域研究「生合成マシナリー研究」
により助成を受けました．また，菌の同定をいただきました弘前大学の 田中和明准教授，有用なご助言を多数いただきました弘前大学の原田幸 雄名誉教授，生合成機構について多くの情報をいただきました慶応大学 の柘植謙爾博士，MSMS スペクトル解析についてご教授いただきました 富山大学の紺野勝弘先生に深く感謝申し上げます．
文献
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（ 橋本 勝 ，弘前大学農学生命科学部）
プロフィル
橋 本 勝（Masaru HASHIMOTO）
＜略歴＞1985 年北海道大学理学部化学科 卒業／1989 年日本学術振興会特別研究員
（北海道大学白濱研究室）／1990 年 3 月北海 道大学大学院理学研究科博士後期課程修 了，理学博士取得／同年 4 月相模中央化学 研究所嘱託研究員／1997 年米国コロンビ ア大学化学科博士研究員（中西香爾研究 室）／1998 年弘前大学助教授（農学生命科 学部）／2005 年同大学教授（農学生命科学 部）＜研究テーマと抱負＞天然物有機化 学，生物の不思議を分子の言葉で説明でき ることを目標にしています．天然物の構造 多様性にロマンを感じます＜趣味＞わけの わからない NMR スペクトルをああでもな いこうでもないと独り言を言いながら眺め ること
