【解説】
地球温暖化，化石資源の枯渇から世界的に低炭素化社会の実 現が求められており，太陽光，風力，地熱発電などの自然エ ネルギーが注目されている．その中で，セルロース系バイオ マスは，バイオ燃料などのエネルギー源としての利用だけで はなく，将来の脱石油社会の中で化成品のカーボン原料とし て利用可能な炭素循環型の原料として期待されている．アメ リカでは，セルロース系バイオマスからの「糖」を原料とし た化成品を作る体系を「バイオリファイナリー構想」として 進めており，EUにおいては，「ホワイトバイオテクノロジー 構想」が展開されている．そのような背景のなか，日本にお ける「バイオリファイナリー構想」においてキーとなるセル ロ ー ス 分 解 酵 素 生 産 微 生 物「ト リ コ デ ル マ・リ ー セ イ
（ ）」 の 開 発 は，約30年 前 の オ イ ル シ ョ ッ ク 後 か ら 進 め ら れ て い る．最 新 の 次 世 代 シ ー ク エ ン サーを駆使した比較ゲノム解析によって，古典的な変異処理 によって改良されてきた「トリコデルマ・リーセイ」の日本 型系統樹進化の謎が解明されつつある．
トリコデルマ・リーセイ研究の歴史
最近の10年間にわたり，世界規模でセルロース分解 微生物の探索がなされた．その結果，これまで最強のセ ルロース分解微生物として研究されてきたトリコデル マ・リーセイの能力を超える微生物は発見されなかっ た．トリコデルマ・リーセイ野生株QM6aは米国陸軍ナ ティック研究所で分離され，その後，世界的標準株と なっているQM9414が開発された．当初，トリコデル マ・リーセイは，トリコデルマ・ビリデ （
） と呼ばれていたが，他のトリコデルマ属と比較 し，セルラーゼ生産性が高い，硝酸態窒素資化性がない ことから，発見者のReese博士の名前にちなんで，トリ コデルマ・リーセイと名づけられた（1）
．驚くことに世界
的な系統樹において，トリコデルマ・リーセイと呼ばれ る微生物はすべて野生株QM6aを親株としている（図1
）．米国のラトガス大学のグループでは，カタボライト
リプレッション解除株Rut C-30と呼ばれる世界的に有 名な菌株を開発している．トリコデルマ・リーセイは，親株QM6aから世界中の系統樹へと分岐し，各国独自の 選抜法によって開発がなされている（2）
．日本において
比較ゲノム解析によるセルロース分解微 生物「トリコデルマ・リーセイ」日本型
系統樹進化の謎の解明とさらなる進化
小笠原 渉，志田洋介
Comparative Genomic Analysis of the Japanese Phylogenetic Tree of Cellulolytic Microorganism Mutants Wataru OGASAWARA, Yosuke SHIDA, 長岡技術科学大学・生 物系
は，「新 燃 料 油 開 発 技 術 研 究 組 合」（以 下，RAPAD）
が，第二次オイルショック後の昭和55年に設立され，
石油9社，発酵4社，プラント7社，化学3社の計23社 が7カ年計画のバイオマス利活用研究を目的とした大型 国家プロジェクトを推進した．この中で，協和発酵（株）
を中心とし，トリコデルマ・リーセイの菌株改良がなさ れた（3）
．開発された日本型系統樹は，その後，長岡技科
大において森川 康博士（現 長岡技科大名誉教授，バ イオインダストリー協会顧問）を中心として約30年に わたり研究が続けられている．オイルショック時代から 時を経て，低炭素化社会，再生可能エネルギー，バイオ リファイナリーといった時代の流れ，要請によって，こ の日本型系統樹のポテンシャルが評価され，近年，世界 から注目を浴びている．しかし，日本型系統樹がどのよ うな変異によって進化がもたらされたのかについては，これまで明らかにされていない．
日本型系統樹の比較ゲノム解析
野生株QM6aのゲノムは，アメリカエネルギー省
（DOE） の予算によって解読され，2005にJGIによって 公開された（4）
．時を同じくして，次世代シークエンサー
の登場によって，高速，高精度，低価格でのゲノム解読 が可能となっている．トリコデルマ・リーセイと呼ばれ る微生物はすべて野生株QM6aを親株としていることか ら，トリコデルマ・リーセイの系統樹は，まさに比較ゲ ノム解析の対象として最適である．このような背景か ら，われわれはSOLiDを用いたトリコデルマ・リーセ イ日本型系統樹の比較ゲノム解析を開始した．これまでにQM9414を含む9株のゲノム解読を行い，
一塩基多型 （SNP : Single Nucleotide Polymorphism） お よびIn/Del：挿入/欠失に伴う変異を同定した．バイオ インフォマティクス解析については，九州大学の久原 哲教授のグループが担当し，QM6aから最終株CDU-11 までに2,000カ所以上のSNPを見いだした．バイオイン フォマティクス（Dry解析）の情報から，実際に表現型 図1■各国におけるトリコデルマ・リーセイ系統樹
野生株QM6aからすべての株が派生している．研究の世界的な標準株はQM9414とされている．日本型系統樹も30年以上にわたり開発が 進められている．
に影響を与える因子であるかどうかについては親株への 変異導入あるいは変異株における変異復帰による解析
（Wet解析）が必要となる．通常，糸状菌のターゲッ ティングには2 〜3カ月を要するため，日本型系統樹進 化の謎を効率的に解明するためにWet解析のターゲッ ト遺伝子を絞り込む必要がある．
表現型データベース作成とターゲット遺伝子の選抜 ターゲット絞り込みに関しては，これまでに蓄積した 日本型系統樹の表現型の特徴をデータベース化し，「ど の株間で，ある表現型が大きく変化したのか？」を明確 にし，その株間で検出された変異を解析対象として選抜 した．RAPADの開発において，1） セルラーゼ高生産 株，2） カタボライトリプレッション解除株，3）
β
-グル コシダーゼ強化株，4） l-ソルボースによるセルラーゼ 誘導可能株の開発がなされた．そのほかにも菌体外タンパク質生産性向上株，プロテアーゼ活性低下株，バイオ マスをC源としてのセルラーゼ高生産株など，いくつか の興味深い表現型を有する菌株が開発されている．これ らの表現型は，現在においても注目に値する表現型であ り，われわれはこれまでに解析した結果から，表現型 データベースを構築した．
われわれは長年，PC-3-7株について研究を続けてお り，多くの表現型を明らかにしている．特に糖質加水分 解酵素ファミリー 10 （GH10） に属するセルラーゼ遺伝 子と同調して発現する唯一のキシラナーゼ （XYNIII）
が，PC-3-7株で発現し，親株QM9414では発現していな いことを明らかにしている（5, 6）
．この発現挙動はたいへ
ん興味深いが，これまでになぜPC-3-7株においてXY- NIIIが発現するようになったかについての原因は，明ら かとなっていない．また，PC-3-7株は，l-ソルボースに よるセルラーゼ誘導能およびセロビオースによるセル ラーゼ生産性が強化された株である．日本型系統樹で独図2■トリコデルマ・リーセイにおけるセルラーゼ誘導生産機構モデル
セルロースおよび関連誘導物質により，Xyr1を中心とした正の調節による各種セルラーゼおよびキシラナーゼ生産が行われる．発現比率 の制御など不明な点が多くある．
自に進化したこれらの多くの興味深い表現型を有する PC-3-7株を日本型系統樹の代表株として，比較ゲノム解 析を開始した．まず，系統樹進化の最大の謎「どのよう にしてセルラーゼ生産能が強化されたのか？」に迫ろう とし，以下に述べる3つの遺伝子変異が日本型系統樹進 化において，極めて重要な因子であることを明らかにし た．
カタボライトリプレッション部分的解除株
トリコデルマ・リーセイにおいて，これまでに予測さ れているセルラーゼ誘導発現機構は，セルロースおよび その関連物質によって正に誘導する Xyr1 （Xylanase regulator 1）, ACEII （Activator of Cellulase Expression II） が報告されており，Xyr1が正に調節する因子として 中心的な役割を担っている（7, 8）
．ACEI （Activator of
Cellulase Expression I） は，機能は明確にされていない が，これまでのところセルラーゼ誘導条件下における抑 制因子と推察されている（9）．図 2
に示すようにセルロー スおよび可溶性の誘導物質によって，これらの制御因子 を介してセルラーゼ生産が行われていると推定されてい る．一方，グルコースが存在する条件において，CREI を介してなされているカタボライトリプレッションによ り，セルラーゼは完全に抑制される（10）．グルコース存
在下において，CREIがXyr1を抑制し，セルラーゼ遺 伝子発現を抑制していると考えられている（図3
）．世
界的に有名なカタボライトリプレッション解除株Rut C-30は，この がゲノム上から欠失していることが 明らかとなっている（11）．
比 較 ゲ ノ ム 解 析 の 結 果，PC-3-7株 に お い て に SNPが存在していることが明らかとなった．Rut C-30 は，CREIが生産されていないが，PC-3-7は1アミノ酸 が変異したCREIが生産されている点で異なる．ゲルシ フト解析において，変異型CREIが既知のセルラーゼ遺 伝 子 上 流 配 列 に 結 合 し な か っ た こ と か ら，本SNP
（Thr→Pro） は大きな構造変化を引き起こしていると推 察される．さらに，われわれは， において，こ の変異がどのような影響をもたらしたのかをPC-3-7株，
PC-3-7 復帰株 （PCWcre1）, PC-3-7 破壊株 （PC Δcre1） の3株間で評価した．その結果，PC-3-7株はPC- Wcre1株と比較し，グルコースによるカタボライトリ プレッションが大きく解除されていた．また，PCΔcre1 株においては，より強くカタボライトリプレッションが 解除されていたことから，1アミノ酸が変異したCREI が菌体内である程度機能していることが示唆された．
SNPの大きな影響は，プレート培養において顕著 に現れた．RAPADにおける，トリコデルマ・リーセイ の菌株改良における始めの大きな難題は「1プレートに 大腸菌のように菌のコロニーをいかにして小さく形成さ せるか」ということであった．そのため，菌糸が広がら ない変異株の取得がなされてきた．PC-3-7とPCWcre1 は1塩基の違いのみであるが，図
4
に示すようにコロ ニー成長に大きな違いが見られた．この SNPがコ ロニー成長を抑制という表現型に関与し，全ゲノムの中 で1塩基を置換することで，このような大きな表現型の 違いを引き起こしていることが明らかとなった．比較ゲノム解析による
β
-グルコシダーゼを正に調節 する新規転写調節因子BglRの発見PC-3-7株において，これまでに報告がなされていない 転写因子にSNPが同定された．この転写因子は，五味 勝也博士（現 東北大農 教授）らが麹菌より見いだした
α
-アミラーゼを正に制御する転写調節因子AmyRと相 同性を示した（12）．しかし，系統樹解析の結果，AmyR
とは異なる新規な転写因子と推定された．AmyRは，アミラーゼ系酵素生産必須な転写因子であることから，
相同性のあったZn2Cys6タイプのZinc finger motifの新 規転写因子BglR （beta-glucosidase regulator） はトリコ 図3■グルコース存在下におけるCREIを介したセルラーゼ生 産抑制メカニズム
セルロースから生産されるグルコースによって，CREIがセルラー ゼ遺伝子および活性化因子Xyr1遺伝子発現を抑制することで，完 全にセルラーゼ生産を抑制する．
デルマ・リーセイにおいても重要な役割を担う可能性が 期待された．そこで，この変異がどのような影響をもた らしたのかをPC-3-7株， PC-3-7 復帰株 （PCW bglr）, PC-3-7 破壊株 （PCΔbglr） の3株間で評価した．そ の結果，転写レベルの解析でPCW bglrがセロビオース 存在下において，菌体内の
β
-グルコシダーゼ遺伝子発 現量を増加させていた．このことから，BglRは菌体内β
-グルコシダーゼ遺伝子を中心にセロビオース（おそら くセロオリゴ糖）存在下において，正に転写調節する因 子と推定している（13）．一方，セロビオース培養におい
て，PCW bglr株 がPC-3-7株 お よ びPCΔbglr株 に 対 して，セルラーゼ活性が1/3程度まで低下していた．この 結果は，本来，野生株において，セロビオースによって BglRを介して菌体内
β
-グルコシダーゼが誘導生産され，その酵素によって菌体内でセロビオースがグルコースに 分解されることでカタボライトリプレッションが引き起 こっていると推察される（図
5
）．
菌体内
β
-グルコシダーゼの新たな機能（誘導物質X生産）
トリコデルマ・リーセイは，菌体内外に10個の
β
-グ ルコシダーゼを有すると推定されている．その中で，菌 体外に存在するβ
-グルコシダーゼI （GH3） は，セロオリ ゴ糖からグルコースを生産する中心的な酵素として考え られている．また，菌体内においては，その発現量からβ
-グルコシダーゼII （BGLII, GH1） が菌体内においてセ ロオリゴ糖を分解していると考えられている．SNP解 析の結果，PC-3-7株においてBGLIIに変異が見いだされ た．PC-3-7株，PC-3-7 復 帰 株 （PCWbgl2）, PC-3-7破壊株 （PCΔbgl2） の3株間で評価した結果，菌体 内
β
-グルコシダーゼ活性はPC-3-7株およびPCΔbgl2株 で低く，PCWbgl2株においてその約4倍の値を示した．また，BGLIIは高濃度のセロビオース条件で，ソフォ ロースを生産する糖転移活性を示すことが知られている が，その活性はPCWbgl2株のみで確認された．以上の ことから， におけるSNPは，分解活性および糖転 移活性を消失させる変異であることが示唆された（「
SNP
＝
破壊」）．しかし，セルロースあるいはセロ
ビオースを炭素源とした培養において，PC-3-7株がPC Δbgl2株よりも高いセルラーゼ活性を示した．この結果 は，「 SNP＝
破壊」という結論と矛盾する結果 であった．そこで，セルラーゼ遺伝子発現量を解析した 図4■CREI変異によるコロニー形 態への影響PC-3-7株とPC-3-7 復帰株 （PCW- cre1） は全ゲノムで1塩基のみの違い であるが，大きな形態変化を引き起 こしている．CRE1は，セルラーゼ発 現調節のほかの機能を有することが 推定される．
図5■新規転写因子BglRの推定機能モデル
セロビオースを中心としたセロオリゴ糖によって，BglRが β-グル コシダーゼ遺伝子発現を正に調節している．生産された β-グルコ シダーゼによってセロオリゴ糖が分解され，グルコースが生産さ れ，CREIを介したセルラーゼ生産の抑制が引き起こしている．す なわち，BglRは間接的にセルラーゼ生産を抑制している．
結果，発現量はPC-3-7株＞PCWbgl2株＞PCΔbgl2株で 高発現していることが明らかとなった．以上の結果は，
「 におけるSNP（PC-3-7株）は，何らかのセルラー ゼ誘導物質（誘導物質X）生産能を向上させる変異であ る」という結論を導き出している．この結論について
は，BGLIIが本来，セロオリゴ糖分解のみならず，「誘 導物質Xのある程度生産する能力を有していたのでは ないか？」という疑問を新たに導く結果でもある（図
6
）．この点に関して，BGLIIおよび変異BGLIIの機能評
価，構造比較などを進めており，この表現型をもたらし ている原因を明らかにしていく予定である．この結果 は，セロオリゴ糖分解活性を消失しているが，誘導物質 Xを生産する機能を向上させている点で， のSNP は，前述の および におけるSNPと異なり，欠 損株とは異なる表現型を示している．すなわち，この bgl2SNP解析の結果は，「SNP＝遺伝子破壊ではない」
という例を示した．現在， における進化分子工 学は盛んに行われているが，古典的な変異処理による微 生物開発が，遺伝子破壊ではなく，タンパク質の機能向 上を導き出している点で， における進化分子工 学が行われていたと言える．30年前に開発された系統 樹進化が，現在の における進化分子工学を超え る における進化分子工学によってもたらされて いた．
日本型系統樹の進化とは？
われわれの日本型系統樹解析は，いまだ途中段階では あるが，進化の謎の手がかりが明らかとなってきてい る．今回は，カタボライトリプレッション関連因子
（CREI）, セロオリゴ糖誘導性菌体内
β
-グルコシダーゼ 図6■BGLIIの推定機能モデルBGLIIは，菌体内において中心的にセロオリゴ糖分解を担ってい る．さらに，ソフォロース以外の誘導物質Xの生産する能力を有 していると推定している．
図7■日本型系統樹の代表株PC-3-7 の進化
1） CREI遺伝子SNPによるカタボラ イトリプレッション解除，2） BglR遺 伝子SNPによる β-グルコシダーゼ遺 伝子発現抑制とそれに伴うグルコー ス生産抑制，3） BGLII遺伝子SNPに よるグルコース生産抑制と誘導物質 X生産能保持（強化？）．
遺 伝 子 制 御 因 子 （BglR）, 菌 体 内
β
-グ ル コ シ ダ ー ゼ（BGLII） にアミノ酸変異がもたらされ，その結果，野 生株とは大きく異なる表現型を示していることを明らか にした．
QM9414株は，菌体外のセロオリゴ糖が菌体に取り込 まれ，BglRを介した菌体内
β
-グルコシダーゼ遺伝子発 現が起こる（図6）．発現した菌体内 β
-グルコシダーゼ は，BGLIIを中心とし，セロオリゴ糖は効率的にグル コースに分解され，栄養源として効率的に利用され，一 方で，CREIを介してセルラーゼ遺伝子発現抑制がなさ れる（図6）．また，BGLIIのセルラーゼ遺伝子発現に対
する誘導物質X生産能は弱いと推定される．これらの ことが総合的に関連し，セルラーゼ生産性はあるレベル で自制的に制御されている．一方，PC-3-7株は，菌体外のセロオリゴ糖が菌体に取 り込まれ，BglRを介した菌体内
β
-グルコシダーゼ遺伝 子発現はbglrSNPのため起こらない．その結果，菌体 内β
-グルコシダーゼ発現量は減少し，セロオリゴ糖は グルコースに分解されずに存在する．また，ある程度発 現しているBGLIIは，セロオリゴ糖の分解活性を消失 し，誘導物質X生産能力を強化している．さらに，一 部生成したグルコースが存在しても，CREIが変異して いるためカタボライトリプレッションは大部分が解除さ れており，セルラーゼ遺伝子発現がなされる．PC-3-7株 は，CREI, BglR, BGLII に変異を有することで，セル ラーゼ生産性能力を高める進化に成功したと推定してい る．具体的には，セロオリゴ糖からグルコースを生産す る流れを退化させ，より長時間菌体内にセロオリゴ糖が 存在し，誘導物質X生産能力を強化している（図7
）．
その結果，自制的なセルラーゼ生産性制御が失われ，セルラーゼ生産能を向上させていると推定される．イメー ジするならば，野生株は水道の水（セルラーゼ）が必要 であるかないかを判断し，節度ある生活をしているのに 対して，進化株は常に蛇口を開いたままに水を出しっぱ なしにしている節度のない生き方をしているようである
（図
8
）．
日本型系統樹は，タンパク質生産量増強，XYNIII特 異的発現，l-ソルボースによるセルラーゼ誘導性増加な ど，いまだに多くの表現型の謎が存在している．われわ れは，次世代シークエンサー，バイオインフォマティク ス解析など最新のDry解析を駆使し，これまでのWet 解析で培った表現型データベースと融合させることで，
日本型系統樹進化の謎を解明すべく，研究を進めてい る．その知見は，日本独自の新たな系統樹を進化につな げていきたいと日々研究を進めている．
文献
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図8■日本型系統樹進化のイメージ 野生株は，自然界で生きるために
「無駄に酵素生産する」ことを抑制す るためにいくつかの手段を有してい るが，日本型系統樹は「無駄に酵素 生産する」する進化を歩んできた．
このような菌株開発において，CREI 変 異 は 世 界 的 に 知 ら れ て い る が，
BglRについては世界的に例がない．
また，BGLII変異による誘導物質X 生産能については，現在解析中であ る．
8） N. Aro, A. Saloheimo, M. Ilmén & M. Penttilä : , 276, 24309 （2001）.
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13） M. Nitta, T. Furukawa, Y. Shida, K. Mori, S. Kuhara, Y.
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河 本 宏（Hiroshi Kawamoto） ＜略 歴＞1986年京大医学部卒／1989年京大第 一内科大学院／1994年京大胸部研（現 再 生研）で血液細胞の系列決定過程およびT 細胞初期分化についての研究を開始／2001 年京大医学部助手／2002年理研免疫セン ターチームリーダー／2012年京大再生研 教授，現在に至る＜研究テーマと抱負＞最 近は胸腺上皮細胞分化の研究や，免疫細胞 を用いた再生医療の研究も行っている＜趣 味＞絵や漫画を描くこと，バンド演奏など 桂 義 元（Yoshimoto Katsura） ＜略 歴＞1963年京大理学部物理学科卒／ 1967 年京大結核胸部研（現 再生研）助手／
1977年同教授／ 2002年退官／同年日大医 学部客員教授，理研免疫センター客員研究 員，現在に至る＜研究ターマと抱負＞T 細胞分化の研究の他，がん治療への免疫の
利用に関する研究を行なっている＜趣味＞
碁，ゴルフ
小 山 泰 二（Yasuji Koyama） Vol. 46, No. 10, p. 735参照
志田 洋介（Yosuke Shida） ＜略歴＞平 成19年長岡技術科学大学大学院工学研究 科博士後期課程情報・制御工学専攻修了／
平成20年博士（工学）／同年同大学生物系 博士研究員／平成23年同特任助教，現在 に至る＜研究テーマと抱負＞糸状菌トリコ デルマ・リーセイの糖質加水分解酵素遺伝 子群の転写制御メカニズムの解明，糸状菌 トリコデルマ・リーセイを用いた有用タン パク質生産に関する研究，糸状菌がいかに して菌体外物質を認識しているのか？ ボ ウリングのスコアアップ法＜趣味＞無心に 洗車をすること（たまにアイデアが浮か
ぶ）
金 鋒 杰（Feng Jie Jin） ＜略 歴＞ 2005年東京大学農学部農学生命科学研究 科博士課程修了／同年群馬大学生体調節研 究所COE研究員／ 2006年公益財団法人野 田産業科学研究所，現在に至る＜研究テー マと抱負＞麹菌におけるbHLH転写制御因 子の機能解析＜趣味＞読書，映画鑑賞 早 川 文 代（Fumiyo Hayakawa） ＜略 歴＞1997年お茶の水女子大学大学院博士 課程修了／お茶の水女子大学大学院助手，
小田原女子短期大学助教授，上海水産大学 客員副教授を経て，2004年より現職＜研 究テーマと抱負＞食品の官能評価分野の研 究に従事．国際的に通用し，かつ，日本独 特の事情も反映した，精密な官能評価を目 指している
