魚介類・海水から分離される腸炎ビブリオの季節的変動並びにその溶血性と薬剤耐性について-香川大学学術情報リポジトリ

魚介類・海水から分離される腸炎ビブリオの季節的変動

並びにその溶血性と薬剤耐性について

田川 清・宮西幸一＊・土岐美佐子・ 北村香代・水口ルミ

SEASONAL DISTRIBUTION OF VIBRIO PARAHAEMOL，YT［CUS

IN FISHES AND SHELLFISHES ORIN SEAWATER，AND

HEMOLYTIC PROPERTY AND DRUG SENSITIVITY

OF THE ORGANISMS

KiyoshiTAGAWA，KouichiMIYANISHI＊，Misako ToKI， Kayo KI・TAMURA，RumiMIZUGUCHI

The seasonal distribution of Vibrio par・ahaemolyticusin fishes and shellfishes orin SeaWater WaSStudiedlrom Apri11984toMarch1987The occurrence of this organism was restricted to the months fIOmJune to NovemberThe totall，063 V parahaemolyticus isolates were examined for their hemolytic activity on blood cellcontainlng Wagatuma medium and thermostable direct hemolytic toxin productivity by reversed passive latex agglutination test

0nly8strains showed Kanagawa phnomenon positive reaction and7strains out of them Significantly produced the toxinAllof theisolates excepting 4 strains，Which showed

resistanCe tO StreptOmyCln Or trimethoprim，Were SuSCeptible severely to rifampicin， tetracycline，Chloramphenicol，nalidixic acid，and moderately to erythromycin，gentamicin， trimethoprim，neOmyCin，StreptOmyCin，kanamycin，1incomycin，but they were resistant to Sulfisoxazole There was no possibility of the existence of drug−reSistanCe plasmidsin the isolates

Key words：VibYio♪arahaemolyticus，Kanagawa phenomenon，Drug resistance

腸炎ビブリオは海水中に棲息する細菌で，魚介類を多量に摂取する我が国においては最も重要な 食中毒原因細菌となっている。そして，本菌による食中毒の発生率は化学物質や琴，フグ等細菌以

外による食中毒を含めた総発生率の約40％を占めている1）。

本菌株にはヒトやウサギの赤血球を含む我妻寒天平板上での生育により，溶血性を示す神奈川現 象陽性株と溶血性を示さない陰性株とがある。神奈川現象陽性株は主として患者から分離されるの

に対して，陰性株は推定原因食品や魚介類，海水などから分離されている2）3）。坂崎ら2）は愚老由来

の2，720菌株の96．5％に当たる2，655株が神奈川現象陽性であったのに対し，魚由来の650株の内陽 性であったのは僅か7株（11％）に過ぎなかったと報告した。 ＊現在徳島市川内町大塚製薬㈱勤務

香川大学農学部学術報賃 第45巻 第2号（1993） 88

このことから，本菌食中毒原因物質に関してほ，神奈川現象陽性菌について検討され，善養寺

ら4），桜井ら5），宮本ら6），本田ら7）8）により耐熱性毒素が単離された。彼らは様々な試験法により本

毒素の生理溶性を調べた結果，本毒素は細胞障害性をもつ神経毒であるが，本菌食中毒の主症状で

ある下痢起因性は認められなかったと報告している。

一九神奈川現象陰性菌株による食中毒事例も報告されており9￣12），本田ら13）は陰性菌株から耐

熱性のない溶血毒素を精製して，マウスに対する致死活性があることを証明し，西渕ら14）は本毒素

遺伝子が耐熱性溶血毒素遺伝子と関連があることを述べている。

しかし，現在までの研究において本菌による下痢が何によるか充分胡らかにされたとは言いきれ

ない。 腸炎ビブリオ†食中毒の治療に当っては，ストレプトマイシン，テトラサイクリソ，エリスロマイ

シン，カナマイシソ等の抗生物質が使われているようであるが15），本菌の各種抗菌製剤に対する感

受性について調べられた報告は少ない。Josephら16），新井ら17）ほクロランフユニコ1−ル，テトラサ

イクリン等数種の抗生物質に対する感受性について報賃している。しかし，多数の菌株を使用した

統計的データではない。

我々ほ魚介類や海水から腸炎ビブリオを分離し，その季節的変動や神奈川現象および耐熱性溶血

毒素生産性について検討するとともに，各種薬剤に対する感受性について調べたので報質する。

実験材料および実験方法 試料：菌分離の試料としては，香川県東部地区の鮮魚店から購入した養殖魚，近海魚介類，ならび に，高松市屋島海岸で採取した海水を用いた。 菌の分離培養：以下菌の培養は全て37℃で行った。 魚介類試料ほ滅菌綿（3cmX3cm）で体表面約10cm2を拭き取り，その綿を食塩ポリミキシ∵／B

培地18）100mヱ中に入れ，18時間増菌培養した。海水の場合には拭き取り綿の代わりに10m∠の海水を用

いた。増菌した培養液1，2滴をコンラージ棒により，TCBS寒天平板（日水製薬）に塗布し，20時 間培養した。現れた直径2∼3皿の線色コロニ・−を1試料につき4個釣菌し，それぞれを0．5mZの 生理食塩水に懸濁，再度TCBS寒天平板に劃線塗布，15∼20時間培養して鈍化を行った。分離菌の 同定は2％NaCl加TSI培地（日水製薬）上での生育によるグルコース・ラクトース・シュクロース

の利用能およびH2S生成能試験，2％NaCl加SIM培地（日水製薬）での生育による運動性とイン

ドール生成試験，2％NaCl加リジン培地（日水製薬）中での生育によるリジン脱炭酸試験，0， 3，7，10％NaCl加ペプトン水中での培養による食塩要求性ならびに耐塩性試験，2％NaC伽グル コ・−ス・リン酸塩培地中での生育によるアセチール・メチル・カルビノール生成試験，および，生 菌体を使用した3％H202分解ならびにチトクロームオキシダ、−ゼ試験紙（日水製薬）を用いたオキ シダーゼ産生試験により行った。 腸炎ビブリオと同定された分離菌株は2％NaC伽普通寒天斜面培地，または保存培地（0．4％

Yeastextract，l％Bactcasitone，2％NaCl，04％Bactagar）に培養して以下の実験に供した。

神奈川現象検査：ヒトまたほウサギ赤血球浮遊液を7％に含む我妻培地に一蔵前培養した菌を接種 し，20時間培養した時，生育菌叢周辺にできる溶血環の有無を観察することによった。なお，対称 には神奈川現象陽性の標準菌株を用いた。

耐熱性溶血毒素生産性試験：逆受身ラテックス凝集反応19）により行った。即ち，被検菌を5％

NaCl加マンニット・ペプトン培地に接種し，18時間培養を行い，遠心分離により上澄をとる。この 上澄25／Jlをマイクロプレートに加え，更に毒素抗体を感作させたラテックス樹脂（デソカ生研） 25〃1を加え混合して，室温に20時間静置後の凝集の有無を観察した。

薬剤感受性試験こ：日本化学療法学会設定の寒天平板希釈法20）に準じて行った。被検菌を2％NaCl加

ペプトン水に−・夜前培養し，同培地で100倍に希釈してから，その1白金耳を，2倍希釈濃度系列の

薬剤含有2％NaC伽Mueller−Hinton培地（Difco），または，2％NaCl含有半合成培地にマルチプル

イノキュ．レークーを用いて接種し，24時間培養後菌の生育を観察した。

薬剤耐性伝達試験：上記試験において耐性と判定された菌株について，プラスミドの接合伝達試験

を行った。受容菌としてはVibrioparahaemolyticusMK19（03：K29，KP∴Rifr，plasmid￣）を

使用した。被検菌，受容菌のそれぞれを2％NaCl含有ペプトン水に−・夜培養後，同培地0・5m∠にそ

れぞれの培養菌液1白金耳を接種し，20時間混合培養した。混合培養菌液1白金耳を被検菌のもつ

耐性薬剤とリファンピシン25Flg／mlを含む2％NaCl含有Mueller−Hinton培地に劃線し，24時間培養

後に出現するコロニーを釣菌し，生理食塩水に懸濁，同混合薬剤含有平板に割線培養して受容菌へ

の耐性伝達の確認を行った。

プラスミドの分離確認：被検菌を2％NaCl含有Brainheartinfusion培地（Difco）で7時間振塗培

養した菌体より，BirnboimJ）01yの方法21）を改変し7：1プラスミドの抽出を行った。即ち，培養液2ml

を遠心分離して菌体を集め，125FLlのSTE緩衝液（20％sucrose，lM Tris−HCl（pH8；0），0‖5

MEDTA）を加えて懸濁し，これに300ノノ1の溶菌液（0．2MNaOH，1％SDS）を加えて混合，溶菌

する。次に3M酢酸ナトリウム溶液（pH4。8）200〃1を加え混合して，20分間氷上に保った後∴遠

心分離（15，000rpm，10分）して上澄を取る。上澄にRNase A溶液（OhO5M 酢酸緩衝液（pH

5．0）に1mg／m招こ溶かし，100℃，10分間加熱処理）10〃lを加え，室温で20分間酵素反応させる。

反応液に等量のクロロフォルムーイソアミルアルコ・−ル混合液（24：1）を加え混合後，遠心分離

（15，000rpm，5分）して上澄せ取る。上澄に等量のイソプロパノ・−ルを加え混合後，氷上に10分間

保ってから遠心分離して沈殿を集める。沈殿を冷70％エタノールで洗源後，真空乾燥（5分間）を

行い，10plのTE緩衝液（10mMTris−HCl（pH8，0），1mMEDTA）に溶解させてプラスミド試

料とした。

プラスミドの確認は0．8％アガロースゲルを用い，0．04M Tris−Acetate緩衝液によるサブマリン

電気泳動を行った。加電圧は5mV／cm，泳動時間は6時間である。泳動終了後のゲルは0．5〃g／mz

のエソジウムブロマイド溶液に1時間浸して染色後，UV照射下で写真撮影した。使用フィルムは

Trix−pan（Kodak），赤色フィルタ・−を使用，絞り28，5秒間露光である。

また，塩化カルシウム法22），酢酸リチウム法23），ポリェチエン・グリコ、−ル法24）によるV

ParahaemolyticusMK19の形質転換を行うとともに，ElectroCellManipulator600（BM機器）を

用いてエレクtロボレーションによる形質転換を行った。 結 果

1984年4月から1987年3月にかけて，魚介類試料から腸炎ビブリオの分離を行い，分離率（腸炎

ビブリオ検出試料数／被検試料数）の季節的変動をみたのがFiglAである。なお，Fig1Bには香

川県水産試験場から提供された屋島沖の定点観測資料に基づき作成した海水温の変化を示した。ま

た，Tablelほ月毎における分離率を纏めたものである。

これらの結果が示すように，腸炎ビブリオは8月をピークとする夏期に多く検出され，12月以降

5月までの冬期には検出されなかった。これを海水温との関係で見てみると明らかな相関が示さ

れ，15℃以下の海水温の時には検出されないが，15℃を越えると検出されてくることが窺われた。

更にこのことを確かめるため，1986年4月から1987年3月の1年間海水に存在する腸炎ビブリオ

の検出を行ったところ，分離率は低い（30％以下）ものの魚介類におけるとほぼ同様の傾向を示

し，6月から11月の期間にのみ検出される結果が得られた。

香川大学農学部学術報告 第45巻 第2号（1993）

（B）

︵衣︶hO宕き巴︸已○⋮ld︻0∽H

FiglSeasonalchangeinisolation frequency of V parahaemolyticus from fishes

andshellfishes（A）withspecialre壬erencetoseawatertemperature（B）

TablelIncidence of V parahaemplγticusinsamples of fishes and

shellfishes ●

Month

．．． ●・

ApIil

0／ 60

0

May

0／ 60

0

June

31／120

25．．8

July

77／135

570

August

74／110

67．3

September

24／ 85

28．2

October

36／100

36い0

November

10／100

10‖0

December

0／ 55

0

January

0／ 20

0

February

0／ 20

0

MarCh

0／ 30

0

Total

252 ／895

28．2

全分離菌株について，ウサギ赤血球を使用した我妻平板による神奈川現象を試験するとともに逆 受身ラテックス凝集反応による耐熱性溶血毒素生産性を試験した。結果をTable2に示す。被検菌の うち神奈川現象陽性と認められたものは8菌株（0．78％）であった。しかし，これらの菌株の示す 溶血環の大きさ，透明度を患者由来の神奈川現象陽性標準菌株が示すそれと比較すると明らかな差 がみられた。また，ラテックス凝集反応においてもこれらの菌株の示す反応は標準菌株よりかなり 劣るものであった。そして，1菌株は神奈川現象擬陽性と判定された菌株と余り変わらない弱い反 応を示した。

Table2Hemolytic activity and toxin productivity among V ≠，arahaemolγticus

strains

Gradeof

Kanagawaphenomenon

Reversed passive latex

reactlOna）

test

agglutinationtestb）

＋＋ O strain（ 0％） O strain（ 0％）

＋ 8 ／／（0．75／／） 7 ／／（0小66／／）

± 29 ／／（2．73／′） 52 ／／（4．89／／）

1026 ／／（96．52／／） 1004 ／／（94．45／／）

a）＋＋：Reacted as strongly asKP十standard strains；＋：Reacted weeklybut clearly；±：Reacted doubtfully；−：Notreacted

b）The test for detectingthermostable direct hemolytic toxin

︵訳︶扇A写−n∽

Fig2−1Survivalcurves of Vparahaemolyticusin various concentrations of

drugs

Rif：Rifampicin；TC：Tetracycline；CM：Chloramphenicol； EM：Erythromycin；TM：Trimethoprim；SM：Streptomycin

香川大学農学部学術報告 第45巻 第2号（1993）

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︵訳︶召人州已nS

Concentration（FLg／ml）

Fig2−2Survivalcurves of V parahaemol．yticusin various concentrations of

drugs

NA：Nalidixic acid；GM：Gentamicin；NM：Neomycin； KM：Kanamycln；LM：Lincomycln （B） T︺p溜pS已眉︼∽−〇．〇之 ︵⊥pぎ叫A︼nの岩層︸のー〇・〇之 100（朋／mg） 0 1 2 3 4 DrugConcentrationrange 50 DrugConcentration（inlogscale）

Fig 3 Critical MIC value determination

腸炎ビブリオの各種抗菌性薬剤に対する感受性についての資料は殆どない。それ故1984年4月か ら1985年3月にかけて分離された314菌株について，100〃g／mヱを基本濃度とする2倍増加または2 倍頑釈系列の薬剤濃度における感受性を測定した。Fig2−1および2−2に示すように，スルフィ ソキサゾールを除く全ての薬剤において，対数濃度備に対する分離菌株の生残率は逆S字型曲線を 措いた。そしてトリメトプリンを除く全ての薬剤において最小生育阻止濃度（MIC）は4濃度段階 の範囲内（最も感受性の低い菌株のMIC億は最も感受性の高い菌株のMIC値の16倍以内）にあった。 これらのことから各濃度差段階における死滅菌株の割合をプロットすると，正規分布に近い曲線 が描かれた。Fig3Aはストレプトマイシンの場合について示したものであり，Fig3Bは濃度段階 を単純な数値にして，平均値（〃）および平均値わ信頼限界（〃＋3α）を求めることを示したも のである。 このようにして，各薬剤に対するMIC平均値および耐性菌判別の臨界濃度を求めた結果をTable 3に示した。

Table3Sensitivityof Vparahaemolγticus strains to various drugS and critical

drug concentrations for distinguishing resistant stIains among them

Minimuminhibitoryconcentration Average value

Critical value

range （FLg／ml） （FLg／ml） （FLg／ml）

RifampICln

Tetracycline

ChloramphenicoI

Nalidixic acid

Erythromycln

Gentamicin

Trimethoprlm

Neomycln

Streptmycin

Kanamycln

Lincomycin

Sul壬isoxazole 5 5 6 1 1 2 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 0 1 3 3 6 1 2 5 1 1 1 4 00 ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ＞

1 2 4 4 8 丘U 6 1 5 5 5

2 0 0 0 0 0 1 1 3 2 2 1 1 0 0 1 1 3 4 7 2 4 1 31 31 6．25 6。25 12．5 50 100 100 200 00 208〇一 なお，スルフィソキサゾールの場合全ての菌株が800〟g／mヱの濃度で生育したので，本薬剤ほ腸 炎ビブリオには無効なものと見倣し，それ以上の濃度における感受性は試験しなかった。 分離全菌株について，供試薬剤に対する耐性の有無を検討した結果，1984年7月にイワシから分 離された33−D−8株と，1985年10月にイカから分離された18−15−4株の2菌株がストレプトマイシン 耐性であり，1985年7月にイワシから分離された10−9−6株と1985年9月にカレイから分離された 14−4−8株の2菌株がトリメトプリンに対して耐性であると判定された。 これらの菌株の薬剤耐性がプラスミドによるか否かをみるため，V如γαんαemO如壱c祝5MK19へ の接合伝達を行ったところ，いずれの菌の場合も伝達は確認できなかった。また，アクリジンオレ ジ，エチジウムブロマイド，SDS処理による耐性の脱落を試験したが，脱落株を得ることほでき なかった。

香川大学農学部学術報告 第45巻 第2号（1993）

94

Photographl．Agarose gelelectrophoresis SM or TM resistant strains．

D−8：plasmid DNA sample from

15−4： ／／ from

4劇8： ／／ from

9−6： ／／ fl・Om

PrOfiles of plasmid DNAs detectedin

SM−reSistant strain33pD¶8， SM…reSistant strain18−15−4， TMpresistant strain14−4p8， TM−reSistant strainlO…9−6， 更に，それぞれの菌株からプラスミドDNA区分を抽出し，アガロース・ゲル電気泳動に付して検 討した。 Photographlに示すように，ストレプ1、マイシン耐性の33−D−8株と18−15椚4株からほ40Mdal付近 に1本のプラスミドDNAバンドが，トリメトプリン耐性の14−4∼8株からは30Mdal付近と15Mdal付 近の2本のバンドが観察されたが，10−9【6株にほプラスミドとみられるDNAのバンドは認められ なかった。これらのプラスミドDNAが薬剤耐性をコ…ドする遺伝子をもつか否かについて，塩化カ ルシウム法等により薬剤感受性でプラスミド非保有菌に対して形質転換を行う他，種々なる条件下 でェレクトロボレーショソによる形質転換を試みたが形質転換体を得ることほできなかった。これ らの結果から，ストレプトマイシソおよびトリメトプリン耐性はプラスミドによるものでないと判 断された。 考 察 Fig．1およびTablelに示されたように，東讃地区での海産魚介類から腸炎ビブリオが検出される のほ，海水温度が15℃を越える6月から11月迄であることが分かった。

この結果ほ1984年度に香川県環境保健部が行った調査25），および，1983年から1984年にかけて行

われた植山ら26）の調査結果とよく一致していた。BradshawらZ7）は加工魚介類中での腸炎ビブリオの

増殖について検討し，12．8℃が増殖の限界温度であると報告している。したがって，本菌は海水温

が低下するに従って減少し，KanekoandCoIwell28）やWatkinsら29）が指摘するように海水中のブラ

ンクトンに寄生して越冬するものと考えられる。 魚種による該菌の分離頻度，または，天然であるか養殖であるかによる分離頻度の差は殆ど認め

ることはできなかった。

次に，腸炎ビブリオによる食中毒が神奈川現象陽性の菌による割合が高いとすることから2）3），魚

介類中での神奈川現象陽性菌または耐熱性溶血毒素生産菌の分離頻度を調べた結果はそれぞれ

075％および0．66％であり，坂崎ら2）の報告に近い数値であった。SaI血ら30）は1982年から1983年に

かけてCalcuttaの魚介煩から分離された腸炎ビブリオには，神奈川現象陽性株はなかったと報告

し，Molitorisら31）ほ1972年から73年にかけてJakaItaで分離された菌の神奈川現象陽性率は12％で

あったと報告している。これには漁猿域の環境汚染が影響しているものと考えられる。本研究にお いて，神奈川現象陽性と見られた菌株の中に溶血現象の原因物質とみられている耐熱性溶血毒素の 生産が低いものがあったこと，そして，対照として用いた患者由来の神奈川現象陽性殊に匹敵する はどの溶血活性をもつ菌株が得られなかったことは，海洋等に存在する菌と患者由来の菌の間に溶

血活性に変化があったか，耐熱性溶血毒素以外の溶血素の関与が考えられる。Sarkarち32）は神奈川

現象陰性菌株を換り返し我妻血液平板で植え継ぎすると溶血性の増加がみられると報告しており， 逆に神奈川現象陽性菌の保存培地での植え継ぎによって溶血性を失う菌株が得られることが観察さ

れている33）・34）。更に，本田ら13）は神奈川現象陰性菌から溶血性蛋白質を精製し耐熱性毒素と比較

している他，西渕ら14）はこの蛋白質をコー・ドする遺伝子は耐熱性溶血性毒素のそれに類似している

ことを報告している。これらのことを総合すると，腸炎ビブリオの溶血性ないし下痢起因性につい てはなお不明な点が多い。 養殖魚場では魚の疾病治療ないし予防の目的で，抗生物質等抗菌性薬剤が使用されていると考え られる。青木ら35）は養殖池の魚から分離されるAeγOmO乃αS属やV去あγ壱0属菌にサルファ剤やテトラサ イクリン，クロランフユニコ・−ル等に対する耐性菌株の分離頻度が高いこと，ならびに，これらの 耐性はプラスミドにより伝達されることを報賃している。本研究において，海水養魚から分離され る腸炎ビブリオには薬剤耐性株が極めて少なく，薬剤耐性プラスミドを確認することができなかっ た。このことは入江や湾の−・部を仕切って養魚する形体では，池や湖と違って，魚に感染もしくは 付着した菌株が投与薬剤に耐性化させられる程長期に留まらないし，また，海中では投与薬剤は急 速に希釈され，耐性菌の選択的増殖効果を失うことが考えられる。

Josephら16），新井ら17）36）は腸炎ビブリオの薬剤耐性と耐性プラスミドについて報告している。し

かし，彼らの使用した菌株はいづれも患者から分離されたものであり，ヒト腸内での耐性獲得と判 断される。 要 約 1984年4月から1987年3月にかけて魚介煩ならびに海水から腸炎ビブリオを分離し，そ の季節的変動を調べた結果，本菌が検出されるのは6月から11月までの間に限られていた。 分離1，063菌株の我妻血液平板上での溶血性，ならびに，逆受身ラテックス凝集反応によ る耐熱性溶血毒素生産性を試験した結果，8菌株が神奈川現象陽性と認められ，そのうち の7菌株に毒素の生産が認められた。 スヤレプトマイシンまたはトリメトプリン耐性であった4菌株を除く全ての菌株は，リ ファンピシン，テトラサイクリソ，クロランフユニコ、−ル，ナリジキ・ン酸に強い感受性をも ち，エリスロマイシン，ゲンタマイシン，トリメトプリン，ネオマイシン，スヤレプトマイ シン，カナマイシソ，リソコマイシソに対して中程度の感受性であった。しかし，スルフィ ソキサゾールには抵抗性であった。 分離菌株中に薬剤耐性プラスミドの存在する可能性はなかった。

96 香川大学農学部学術報告 第45巻 第2号（1993） 謝 _辞 本研究に当たり，貴重な海水温測定資料を提供下さいました香川県水産試験場場長合田 理氏に厚くお礼申し上げます。また，息老由来の神奈川現象陽性標準菌株を分譲下さいま した香川県衛生研究所香西淑行主幹ならびに十川みさ子主席研究員に心からお礼申し上げ ます。 引 用 文 献 （1）厚生省環境衛生局食品衛生課：食中毒発生状 況，食品衛生研究，34，54−80（1984），35， 48−74（1985），36，62−88（1986），37，50− 76（1987） （2）Sakazaki，R，Tamura，K，Kato，T，Obara， Y，Yamai，Sand Hobo，K：Studies on the

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