α-/β-シクロデキストリンとリマプロストの 3 成分包接複合体形成による

(1)

α-/β-シクロデキストリンとリマプロストの 3 成分包接複合体形成による

リマプロストアルファデクス錠の安定化と機構解明

２０１６

井上靖雄

Ternary inclusion complex formation and stabilization of limaprost, a prostaglandin E

₁

derivative, in the presence of α- and β-cyclodextrins

Yasuo Inoue

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諸言 ... 1

第1章リマプロストアルファデクス錠の安定性に及ぼす β-シクロデキストリン（β-CD）の影響 ... 6

第1節序 ... 6

第2節 β-CD によるリマプロストアルファデクス凍結乾燥体の安定化 ... 8

第3節 β-CD を含むリマプロストアルファデクス凍結乾燥体の物理化学的性質 .... 15

第4節 β-CD によるリマプロストアルファデクス錠の安定化 ... 19

第5節打錠用添加剤としての β-CD の影響（固体 ²H-NMR 法） ... 23

第6節加湿下におけるリマプロストアルファデクス錠の安定性 ... 25

第7節小括 ... 27

第2章水溶液中におけるリマプロストと各種シクロデキストリン（CD）との相互作用 ... 28

第1節序 ... 28

第2節水溶液中におけるモデル化合物プロスタグランジンF_2α （PGF_2α）の各種 CD による包接様式 ... 29

第 1 項 ¹³C-NMR スペクトル法を用いた α-シクロデキストリン（α-CD）または β-CD による PGF_2α の包接部位の推定 ... 30

第2項 2次元NMRスペクトル法を用いた α-CD または β-CD による PGF_2α の包接部位の推定 ... 37

第3節水溶液中のリマプロストの分解機構に及ぼす各種 CD の影響 ... 40

第4節溶解度法 ... 46

第1項 α-CDまたは β-CDとリマプロストの溶解度相図 ... 46

第 2項 α-CD/リマプロスト系に及ぼす β-CD の影響あるいは β-CD/リマプロスト系に及ぼす α-CD の影響 ... 47

第5節小括 ... 49

第3章リマプロストと各種 CD との固体状態における相互作用 ... 50

第1節序 ... 50

第2節リマプロスト CD 複合体の固体状態における包接様式（固体 ¹³C CP/MAS NMR スペクトル法） ... 51

第3節リマプロスト CD 複合体の固体状態における物性評価 ... 55

第1項赤外吸収スペクトル法 ... 55

第2項ラマン分光法 ... 56

第3項粉末X線回折法 ... 61

第4項ラマンマッピング ... 63

(3)

第4節リマプロスト CD 複合体の固体状態における安定性評価... 65

第5節リマプロストと各種 CD との複合体形成機構 ... 69

第6節小括 ... 71

総括 ... 72

謝辞 ... 75

実験の部 ... 76

参照文献 ... 81

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本論文で使用した主な略語一覧表

CD Cyclodextrin シクロデキストリン

PG Prostaglandin プロスタグランジン

11-deoxy-Δ¹⁰ 17S,20-Dimethyl-trans-Δ²-PGA1 17エス，20-ジメチル-トランス-Δ²-ピージーエー１

8-iso 17S,20-Dimethyl-trans-Δ²-8-iso-PGE1 17エス，20-ジメチル-トランス-Δ²-8- イソ-ピージーイー１

PTP Press through package プレススルーパッケージ

IR Infrared spectroscopy 赤外分光法

T1 Spin-lattice relaxation time スピン格子緩和時間

NMR Nuclear magnetic resonance 核磁気共鳴

R.H. Relative humidity 相対湿度

SEM Scanning electron microscope 走査型電子顕微鏡

CP/MAS Cross polarization/magic angle spinning

交差分極/マジックアングルスピニング

K Stability constant 安定度定数

ROESY Rotating frame nuclear Overhauser enhancement spectroscopy

回転座標系NOE

k Decomposition rate constant 分解速度定数

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本論文は学術雑誌に収載された以下の論文を基礎とするものである．

(1) Stabilizing effect of β-cyclodextrin on Limaprost, a PGE1 derivative, in Limaprost alfadex tablets (Opalmon^) in highly humid conditions.

Y. Inoue, N. Sekiya, K. Katayama, S. Narutaki, M. Yamamoto, D. Iohara, F. Hirayama, and K.

Uekama

Chem. Pharm. Bull., 62, 786-792 (2014).

(2) Formation of the ternary inclusion complex of limaprost with α- and β-cyclodextrins in aqueous solution.

Y. Inoue, N. Sekiya, M. Yamamoto, D. Iohara, F. Hirayama, and K. Uekama Chem. Pharm. Bull., 63, 318-325 (2015).

(3) Ternary inclusion complex formation and stabilization of limaprost, a prostaglandin E1

derivative, in the presence of α- and β-cyclodextrins in the solid state.

Y. Inoue, D. Iohara, N. Sekiya, M. Yamamoto, H. Ishida, Y. Sakiyama, F. Hirayama, H. Arima, and K. Uekama

Int. J. Pharm., 509, 338-347 (2016).

本研究で得られた成果については，「オパルモン錠の一包化達成のためのシクロデキストリンによる安定化と高速打錠生産」に関する研究として，2015年5月に公益社団法人日本薬剤学会より日本薬剤学会旭化成創剤開発技術賞を受賞した．

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諸言

オパルモン^®錠は循環器領域における経口投与可能な世界初のプロスタグランジンE1

（PGE1）誘導体製剤であり，「閉塞性血栓血管炎に伴う潰瘍，疼痛及び冷感などの虚血性諸症状の改善」^1-4)及び「後天性の腰部脊柱管狭窄症に伴う自覚症状及び歩行能力の改善」^5-12) の適応症で上市されている．その主薬であるリマプロストアルファデクスは，PGE1 誘導体であるリマプロストと α-シクロデキストリン（α-CD）の包接複合体である．

高齢化の進行する医療現場では，服薬性を向上し，飲み忘れや飲み誤りを防止するためにさまざまな製剤的工夫や調剤が行われている．その中で，一包化は複数の内服用固形剤が処方された際に，その薬剤の種類に関わらず，服薬時点ごとにセロファンやグラシン紙等に分包した状態で患者に渡す調剤行為であり，医療現場で広く行われている．医療機関で一包化する際，錠剤等はプレススルーパッケージ（PTP）包装等の直接包装から取り出す必要がある．このため，直接包装から取り出した後の安定性が低い製剤では，製剤の置かれる温湿度によっては取り扱いに注意が必要となり，一包化により患者に処方するのは困難と考えられる．

プロスタグランジン（PG）類^13-17)とその誘導体は，熱や湿度の影響を受けて分解しやすいことが知られており，¹⁸⁾その医薬品開発のために種々の製剤的検討が行われてい

る．^19-24)PG 類の安定性には pH が影響することが知られており，pH を調整することによ

り安定化し，製剤化されている．例えば，α-CD の添加に加えて pH の調整により安定化した PGE1 凍結乾燥注射剤（プロスタンディン注射用 20 µg^®）がある．またラタノプロストやイソプロピルウノプロストン等の PG 誘導体にポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を可溶化剤として添加し，エチレンジアミン四酢酸や ε-アミノカプロン酸等のキレート化能を有するアミノカルボン酸で pH を調整して薬物を安定化した水性点眼剤（ラタノプロスト PF点眼液 0.005%「日点」^®），同じくラタノプロストやイソプロピルウノプロストン等の PG 誘導体をトロメモール等の有機アミン類で安定化した水性点眼剤（イソプロピルウノプロストン点眼液 0.12%「TS」^®）もある．また，化合物の安定性に糖類の添加が影響することも知られている．多糖類（デキストラン，デキストリン）の添加により，湿度に対する安定性を改善した PGE1 誘導体錠剤（オパルモン^®錠 5 µg）やマルトースの添加により安定化した PGE1 凍結乾燥注射剤（プロスタンディン注射用 20 µg^®）が開発されている．またヒアルロン酸の添加によりプロスタグランジンF_2α（PGF_2α）誘導体を安定化した水性点眼剤も報告されている．更には PG 誘導体を脂肪酸類と組み合わせて安定化する例も報告されている．例えば，グリセリド類の添加により安定化した 11-デオキシ-PG 誘導体カプセル剤（アミティーザカプセル24 µg^®），ポリエトキシ化ヒマシ油の添加により安定化した PG 誘導体の水性点眼剤（トラバタンズ点眼液 0.004%）が開発されている．また，混合脂肪酸の添加により PGE1 あるいは PGE1 誘導体を安定化したカプセル剤も報告されている．そ

-1-

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の他にも，抗酸化作用のあるメチルヘスペリジンを加えることで長期間の室温保存が可能となったプロスタグランジンE2（PGE2）錠剤（プロスタグランジンE2錠0.5mg「科研」^®）も販売されている．

このように，PG 類については安定化を目的とした多くの製剤研究が継続される中，PG 誘導体とシクロデキストリン（CD）類が包接複合体を形成すること^{25, 26)}を利用して，PGE1

の安定性を改善した PGE1･α-CD 製剤が既に上市されている．^27-29)その一つであるリマプロストと α-CD の包接複合体であるリマプロストアルファデクス^{30, 31)}は，湿度の影響を受けない気密状態では室温で安定であるが，湿度の影響を受ける高湿度下では分解が進行し，分解物である17S,20-Dimethyl-trans-Δ²-PGA1（11-deoxy-Δ¹⁰）の割合が増加することが知られている．³²⁾リマプロストの主な分解機構を Fig. 1 に示す．

Fig. 1. Limaprost Decomposition Pathway

オパルモン^®錠は主薬であるリマプロストを α-CD との包接複合体とすることで，水溶性を上げて含量均一性を確保するとともに，アルミ包装中での安定性を確保し，1988年に製造承認を得た（第1世代）．しかし，アルミ包装開封後は，PTP 包装状態でも分解が進行したことから，並行して安定化研究を進め，1989年に処方変更を行い，PTP 状態では安定な製品となった（第2世代）．しかし，PTP 包装から取り出し後は分解が進行し， 25 °C,

75%R.H. では製品規格を維持できる期間は約4日間と非常に短期間であった．その後も製

剤改良を継続し，錠剤コーティングによる防湿，吸湿性の低い糖類の添加，pHの調整，脂肪酸類との組み合わせ等を検討したが，いずれも十分な安定化効果は得られなかった．その後，リマプロストアルファデクスを高吸湿性の多糖類であるデキストラン40とともに凍結乾燥し，錠剤化することで加湿下における安定性が向上することが報告されている．このオパルモン^®錠（デキストラン処方）は，セロファンやグラシン紙等に分包した状態でも

（11-deoxy-Δ¹⁰）

（8-iso）

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25 °C, 75%R.H. における分解物の量は8週間まで規格内である 5.0% 以下を維持することができ，2006年に処方変更を行った（第3世代）．しかし，より高湿度である 30 °C, 75%R.H.

では分解物の量が規格を満たすのは4週間までとなり，安定な期間は短くなる．このため，

患者に提供後の環境によっては製品規格を超える懸念があり，また医療機関で必要性の高いボトル包装品は開閉が繰り返されることを考えると，高湿度下でのさらなる安定化が課題であった．このような状況を鑑み，オパルモン^®錠のPTP包装取り出し後の高湿度下における安定性をさらに改善することを目的として，30 °C, 75%R.H. で3カ月間安定な製剤を目標に，リマプロストの安定性を改善する製剤処方を検討した．

リマプロストアルファデクス錠の製造工程は，いわゆる直打法である．すなわち，原薬であるリマプロストアルファデクスを添加剤とともに溶解した後，凍結乾燥工程により凍結乾燥体を得る．続いて，粉砕工程により凍結乾燥粉末とした後，打錠用の添加剤と混合して打錠する．従来のオパルモン^®錠（デキストラン処方）では，リマプロストアルファデクスとデキストラン40を含む凍結乾燥粉末を調製し，直打法により錠剤化した．

リマプロストの安定性を更に改善する製剤処方を見出すため，リマプロストアルファデクスとデキストラン40を含む凍結乾燥粉末に種々の打錠用添加剤を加えた錠剤を製造し，

30 °C, 75%R.H. 下における安定性を比較した．その結果，Table 1 に示すように β-シクロデ

キストリン（β-CD）を打錠用添加剤に用いた製剤処方において，リマプロストの安定性が顕著に向上した．しかしながら，分解物の量は1カ月で 4.4% であり，更なる安定性の改善が必要であった．そこで，安定化効果の認められた β-CD を凍結乾燥工程にも加えること，すなわちリマプロストアルファデクスとデキストラン40に β-CD を加えた凍結乾燥体を製造し，更に打錠用添加剤としても β-CD を加えることを検討した．

Table 1. Effects of Additives for Tableting on the Stability of Limaprost

11-deoxy-Δ¹⁰ (％)

Additive Initial 2 weeks 1 month

Lactose 0.9 6.6 13.9

Anhydrous dibasic calcium phosphate 0.5 4 7.6 Hardened oil rapeseed oil 1.3 3.8 7.4

Stearic acid 0.9 4.2 8.2

Dextran 70 0.6 3.8 6.8

Aspartic acid 1.7 4.3 8.6

α-CD 1.8 4.8 9.9

β-CD 1.8 2.6 4.4

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CD はデンプンに CD生成酵素（CD glycosyltransferase）を作用させて得られる環状のマルトオリゴ糖であり，これまでに D-glucopyranose が α-1,4グリコシド結合で環状に連なった同族体として単離されている．これら同族体の中で構成グルコースが 6，7，8個のものはそれぞれ α-，β-，γ-CD （Table 2）と呼ばれてよく知られている．分子内の疎水性空洞内に種々の疎水性ゲスト分子を取り込んで複合体を形成することが知られている CD

類^33-35)については，様々な薬物との複合体形成が研究されており，^36-39)薬剤学・製剤学領

域では，医薬品の可溶化，安定化といった製剤改良に応用されている．^40-48)また，天然 CD の他にも種々の CD 誘導体が開発されており，CD の水溶性を高めたメチル化体，ヒドロキシアルキル化体，スルホブチル化体，分岐 CD 等の親水性誘導体は難水溶性薬物の溶解性改善を目的として実際に医薬品にも利用されている．例えば，アイスランドでは抗炎症薬ヒドロコルチゾンの2-ヒドロキシプロピル-β-CD（HP-β-CD）含有液剤（Dexocort^®）が上市されており，日本においてもスルホブチルエーテル-β-CD（SBE-β-CD）を含む抗真菌薬ボリコナゾールの注射剤（ブイフェンド^®200mg 静注用）が上市されている．

Table 2. Characteristics of Cyclodextrins

Characteristics α-CD β-CD γ-CD

Number of Glucose 6 7 8

Molecular weight 973 1135 1297

Solubility in water (g/dL, 25 °C ) 14.5 1.85 23.2 Usage rate in drug product⁴⁰⁾ 9.6 % 54.8 % none

この中でも，β-CD は日本の医薬品添加物規格，米国，欧州の薬局方に収載されており，

経口投与製剤にも使用されている．一方，リマプロストアルファデクスはリマプロストの α-CD による包接複合体であり，ここに β-CD を添加することにより，2種類の CD がリマプロストと共存することになる．特に凍結乾燥工程では，リマプリストと α-CD 及び β-CD を溶解した後，凍結（固定化）し，乾燥により水分を除去して凍結乾燥体を得ることから，リマプロストと各 CD との相互作用が期待される．

このような背景のもと，β-CD を利用したリマプロストアルファデクス錠の安定化と機構解明を目的として，以下の検討を行った．

第1章では，30 °C, 75%R.H. におけるリマプロストアルファデクス錠の安定性を改善す -4-

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る製剤処方を見出すため，凍結乾燥工程と打錠工程について，それぞれの工程で加えた β-CD がリマプロストの安定性に及ぼす影響を評価した．また，打錠用添加剤として加えた β-CD がリマプロストの安定性を改善する機構を解明するため，固体 ²H-NMR 法を用いて，

添加剤中の水の分子運動性を評価した．第2章では，凍結乾燥工程で加えた β-CD とリマプロスト及び α-CD との相互作用を調べるため，水溶液中におけるリマプロストと各種 CD との相互作用を検討した．凍結乾燥工程では，一旦，これら3成分を水に溶解した後，

凍結（固定化）し，乾燥により水分を除去することから，水溶液中におけるリマプロストと各種 CD との相互作用を検討することで，α-CD と β-CD の共存下におけるリマプロストの包接様式を推定できると考えた．なお，リマプロストは水溶液中では不安定であるこ

とから，¹³C-NMR 法，2次元 NMR 法を用いた検討では，リマプロストのモデル化合物と

して PGF_2α を用いて各種 CD との相互作用を検討した．また，リマプロストの溶解度相図の検討から，リマプロストと α-CD 及び β-CD が水溶液中に共存する場合の3成分包接複合体の形成を調べた．第3章では，凍結乾燥工程で加えた β-CD とリマプロスト及び α-CD との固体状態における相互作用を検討するため，リマプロストと各種 CD の複合体を凍結乾燥により調製し，ラマン分光法，粉末X線回折を用いてそれぞれの物性を評価した．また，固体 ¹³C CP/MAS NMR スペクトル法を用いて，リマプロストと α-CD 及び β-CD を含む固体複合体中におけるリマプロストの包接様式を調べた．さらに，それぞれの凍結乾燥体について，30 °C, 75%R.H. 下におけるリマプロストの安定性を評価し，α-CD 及び β-CD によるリマプロストの包接様式を明らかにするとともに，リマプロストの安定化機構を検討した．

以下に本研究で得られた知見を詳述する．

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第1章リマプロストアルファデクス錠の安定性に及ぼす β-CD の影響

第1節序

リマプロストについては，α-CD と包接複合体を形成することにより，安定性が顕著に向上することが報告されており，リマプロストアルファデクスとして日本薬局方にも収載されている．Fig. 2 には，リマプロストアルファデクス錠の製造工程を示す．原薬であるリマプロストアルファデクスを添加剤とともに溶解した後，凍結乾燥工程により凍結乾燥体を得る．続いて，粉砕工程により凍結乾燥粉末とした後，打錠用の添加剤と混合して打錠する，いわゆる直打法である．従来のオパルモン^®錠（デキストラン処方）は，リマプロストアルファデクスとデキストラン40を含む凍結乾燥粉末を調製し，種々の打錠用添加剤と混合した後，直打法により錠剤化した．リマプロストアルファデクス錠の更なる安定性改善を目的として，複数の打錠用添加剤を評価した結果，β-CD が顕著な安定化効果を示すことを見出したが，その安定化効果は十分ではなく，30 °C, 75%R.H. では，1カ月で 4.4% の分解物が生成した（Table 1）．本剤の製造法は凍結乾燥粉末を用いた直打法であることから，

打錠前の混合工程の他には，凍結乾燥工程しか添加剤を加える工程はない．そこで，打錠用添加剤として安定化効果の認められた β-CD を凍結乾燥工程にも添加することを検討した．

本章では，30 °C, 75%R.H. におけるリマプロストアルファデクス錠の安定性を改善するため，凍結乾燥工程と打錠工程について，それぞれの工程で加えた β-CD がリマプロストの安定性に及ぼす影響を評価した．すなわち，第2節では，β-CD をリマプロストアルファデクスとデキストラン40から成る凍結乾燥工程に加え，凍結乾燥体中におけるリマプロストの安定性を詳細に評価した．第3節では，凍結乾燥体の物理化学的性質を評価することで，β-CD が凍結乾燥体中のリマプロストの安定性に与える影響を考察した．第4節では，

第2節で検討した β-CD を含む凍結乾燥体に更に打錠用添加剤として β-CD を加えて錠剤化することで，顕著にリマプロストの安定性が向上することを明らかとした．第5節では，

打錠用添加剤として加えた β-CD が，リマプロストの安定性を改善する機構を解明するた

め，固体 ²H-NMR 法を用いて，添加剤中の水の分子運動性を評価した．

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Fig. 2. Manufacturing Process of Limaprost Alfadex Tablet Milling

Limaprost alfadex (Limaprost/α-CD)

Freeze-drying

Blending Tableting Drying

Additives for freeze-drying

Freeze-drying process

Tableting process Additives for

tableting

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第2節 β-CD によるリマプロストアルファデクス凍結乾燥体の安定化

従来のオパルモン^®錠（デキストラン処方）では，凍結乾燥工程においてリマプロストアルファデクスとデキストラン40を含む凍結乾燥体を調製した．本節ではリマプロストアルファデクスとデキストラン40に更に β-CD を添加した凍結乾燥体（凍結乾燥体（with β-CD））を調製し，凍結乾燥体中のリマプロストの安定性を検討した．Table 3に凍結乾燥体の処方を示す．凍結乾燥体（with β-CD）は，リマプロストアルファデクスとデキストラン40に β-CD を添加した凍結乾燥体を示し，凍結乾燥体（without β-CD）は，リマプロストアルファデクスとデキストラン40のみからなる凍結乾燥体を示す．

Table 3. Formulations of Lyophilized Composites with or without β-CD Additive Lyophilized Composite

without β-CD (mg) (Dextran Formulation)

Lyophilized Composite with β-CD (mg) (β-CD Formulation)

Limaprost alfadex 50 50

Dextran 40 350 50

β-CD - 50

Purified water 1875 1875

Total 400 150

なお，凍結乾燥体（without β-CD）におけるリマプロストアルファデクスとデキストラン 40の処方比率は，従来のオパルモン^®錠（デキストラン処方）の処方比率をそのまま採用した．一方，β-CD を添加した凍結乾燥体（with β-CD）におけるリマプロストアルファデクス，デキストラン40及び β-CD の処方比率は，β-CD の溶解性及び Table 4 に示す安定性試験の結果に基づいて選定した．凍結乾燥工程では，リマプロストアルファデクス，デキストラン40及び β-CD を一旦溶解する必要がある．β-CD の溶解度が α-CD よりも極めて小さいことから溶解工程の操作性も考慮して，また α-CD と β-CD のモル比がほぼ 1:1 になることから，リマプロストアルファデクスと β-CD の処方比率は 1:1 と設定した．

Table 4 に示す40 °C の安定性試験は，凍結乾燥体を防湿した状態で 40 °C に2カ月間保存し

た後の分解物 11-deoxy-∆¹⁰ の量を示す．デキストラン40の添加量が増加するにつれて，リマプロストの安定性が向上した．一方，30 °C, 75%R.H. の安定性試験は，凍結乾燥体を無包装の状態で 30 °C, 75%R.H. に2.5カ月間保存した後の分解物 11-deoxy-∆¹⁰ の量を示す．防湿状態とは

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異なり，加湿下ではデキストラン40の添加量が増加するにつれて，リマプロストの安定性が減少した．本剤については，最終包装形態である PTP/アルミ包装での安定性と PTP 包装開封後の加湿下での安定性の両方を満たす必要がある．そこで，2つの安定性試験における分解物の合計量が最小（5.3%）となる処方，すなわちリマプロストアルファデクス： β-CD ：デキストラン40が 1:1:1 になる処方比率を選定した．

Table 4. Stability Study of Lyophilized Composite of Limaprost with Dextran 40 and β-CD

Formulation rate

Limaprost alfadex : β-CD :Dextran 40

40 °C 2 months

30 °C, 75%R.H.

2.5 months

1:1:0 1.7 4.3

1:1:0.5 1.3 4.1

1:1:1 1.1 4.2

1:1:2 0.9 5.3

1:1:4 0.8 5.5

1:1:6 0.7 6.8

製剤中でリマプロストが分解する機構としては，吸湿により α-CD によるリマプロストの包接が解離し，その結果，生成したリマプロスト非包接体が分解する機構が報告されて

いる．^{49, 50)}そこで，凍結乾燥体（with β-CD）と凍結乾燥体（without β-CD）について，各凍

結乾燥体中におけるリマプロストの分解機構を解明するため，CD に包接された状態，若しくは非包接体として存在するリマプロスト及び 11-deoxy-∆¹⁰の量を算出した．30 °C,

75%R.H. の条件下に保存した凍結乾燥体を経時的に採取し，酢酸エチルを加えて遠心分離

した後，上清中のリマプロストをHPLCで定量した．CD から解離したリマプロストは酢酸エチル層に移行することから，非包接体として存在するリマプロスト及び分解物

11-deoxy-∆¹⁰の量を測定することができる．続いて遠心分離した後の残さに精製水を添加し，

溶解した水溶液中のリマプロストを HPLC で定量した．CD に包接された状態のリマプロストは酢酸エチル層に移行せず，残さを溶かした水溶液中に含まれることから，CD に包接された状態のリマプロスト及び 11-deoxy-∆¹⁰の量を測定することができる．リマプロスト

及び 11-deoxy-∆¹⁰について，CD への包接状態を算出するための計算式を以下に示す．

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Free-form content (%) = (a + b) / (a + b + c + d) × 100 Eq. 1 Total 11-deoxy-∆¹⁰ content (%) = (b + d) / (a + b + c + d) × 100 Eq. 2 Free-form content of 11-deoxy-∆¹⁰ (%) = b / (a + b + c + d) × 100 Eq. 3 Inclusion-form content of 11-deoxy-∆¹⁰ (%) = d / (a + b + c + d) × 100 Eq. 4

a: Content of Limaprost in the free-form (Limaprost (µg) extracted by ethyl acetate) b: Content of 11-deoxy-∆¹⁰in the free-form (11-deoxy-∆¹⁰(µg) extracted by ethyl acetate)

c: Content of Limaprost in the inclusion form (Limaprost (µg) obtained from the remaining residue after extraction)

d: Content of 11-deoxy-∆¹⁰ in the inclusion form (11-deoxy-∆¹⁰ (µg) obtained from the remaining residue after extraction)

Fig. 3 はリマプロストの分解物である 11-deoxy-∆¹⁰の生成量を表しており，Eq. 2 により CD 包接された分解物 11-deoxy-∆¹⁰及び CD 非包接体としての分解物 11-deoxy-∆¹⁰の合計量を示す．凍結乾燥体（without β-CD）を 30 °C, 75%R.H. で8週間保存した場合，

11-deoxy-∆¹⁰の生成率は 14.8% であった．一方，凍結乾燥体（with β-CD）では 7.1% と小さく，β-CD の添加によって高湿度下におけるリマプロストの安定性が顕著に向上した．CD に包接されたリマプロストは，CD に包接されていないリマプロストに比べて安定性が向上することが報告されている．⁵¹⁾そこで，凍結乾燥体（with β-CD）と凍結乾燥体（without β-CD）

について，CD 非包接体として存在するリマプロスト及び分解物 11-deoxy-∆¹⁰の量をそれぞれ測定した．結果を Table 5 に示す．30 °C, 75%R.H. の条件下で8週間保存した場合，凍結乾燥体中のリマプロスト CD 非包接体の生成率は，凍結乾燥体（without β-CD）で 0.57% ，凍結乾燥体（with β-CD）で 1.67% と低く，両凍結乾燥体間でほとんど差がなかった．また，

リマプロスト CD 非包接体中に含まれる分解物 11-deoxy-∆¹⁰の割合は，β-CD の有無に関わらず 0.25% 以下と極めて低く，両凍結乾燥体間でほとんど差がなかった．

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Fig. 3. Degradation Product (11-deoxy-Δ¹⁰) in Lyophilized Composites with or without β-CD at 30 °C, 75%R.H.

◇: Lyophilized Composite without β-CD, □: Lyophilized Composite with β-CD.

Each point represents the mean ± S.E. of three experiments.

11-deoxy-Δ10 , %

-11-

(17)

Table 5. Free-form Contents in Lyophilized Composites with or without β-CD at 30 °C, 75%R.H.

Free Form Content (%)

Lyophilized Composite without β-CD Lyophilized Composite with β-CD

0 week 0.57（0） 1.67（0）

1 week 0.43（0） 1.61（0）

2 weeks 0.50（0） 1.43（0）

3 weeks 0.51（0） 1.30（0.07）

4 weeks 0.36（0.25） 1.13（0.07）

8 weeks 0.42（0） 0.78（0.06）

Free form content of 11-deoxy-Δ¹⁰ is shown in parentheses.

Fig. 4 は Eq. 4 により算出した CD 包接された分解物 11-deoxy-∆¹⁰の量を示す．分解物の生成量は，Fig. 3 で示した CD 包接体及び CD 非包接体としての分解物 11-deoxy-∆¹⁰ の合計量とほぼ同じ値を示している．つまり，凍結乾燥体（with β-CD）と凍結乾燥体（without β-CD）において，ともにリマプロストの分解物は CD に包接された状態であるにも関わらず，β-CD を添加した凍結乾燥体（with β-CD）のみでリマプロストの安定性が顕著に向上したことから，リマプロスト CD 包接体の形成において β-CD が安定化に寄与していることが示唆された．プロスタグランジンEタイプの CD による包接部位については，α-CD がそのアルキル基であるのに対し，β-CD では五員環であることが知られている．⁵²⁾リマプロストの主分解物が五員環部分の脱水反応により生成する 11-deoxy-∆¹⁰であることから，凍結乾燥体（with β-CD）において，β-CD がリマプロストの五員環部分を包接することで安定性が向上した可能性が考えられる．各 CD によるリマプロストの包接様式については，第 2章及び第3章で詳細に検討する．

-12-

(18)

Fig. 4. Degradation Product (11-deoxy-Δ¹⁰) in the Inclusion form in Lyophilized Composites with or without β-CD at 30 °C, 75%R.H.

◇: Lyophilized composite without β-CD, □: Lyophilized composite with β-CD.

Each point represents the mean ± S.E. of three experiments.

凍結乾燥体中におけるリマプロストの安定性は β-CD の添加により大きく向上した．そこで，β-CD の添加量がリマプロストの安定性に与える影響をより詳細に検討した．Table 6 は凍結乾燥体を 30 °C, 75%R.H. の条件下で2週間保存した場合について，β-CD の添加量を増加させた際のリマプロストの分解物 11-deoxy-∆¹⁰の生成量を示している．リマプロストアルファデクスと β-CD の重量比が 1:0.4，1:1，1:2，1:3 と増加するにつれて，分解物である 11-deoxy-∆¹⁰の生成量はそれぞれ 2.5，2.0，1.9，1.8% と減少した．しかしながら，

重量比が 1:1 以上の場合においても，安定化効果の顕著な改善が認められなかったこと，

また β-CD の溶解度が α-CD よりも極めて小さく溶解工程に長時間を要することから，上述したようにリマプロストアルファデクスと β-CD の重量比は 1:1 を選択した．

11-deoxy-Δ10 , %

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(19)

Table 6. Formulations of Lyophilized Composites with various amounts of β-CD and their Stability at 30˚C, 75%R.H.

Additive

Lyophilized Composite with β-CD

2

with β-CD 3

with β-CD 4

with β-CD 5

Limaprost Alfadex (mg) 50 50 50 50

β-CD (mg) 20 50 100 150

Total (mg) 70 100 150 200

Limaprost Alfadex : β-CD (w/w) 1:0.4 1:1 1:2 1:3

11-deoxy-Δ¹⁰(%) 2.5 2.0 1.9 1.8

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(20)

第3節 β-CD を含むリマプロストアルファデクス凍結乾燥体の物理化学的性質

前節で示したように，リマプロストアルファデクスとデキストラン40を含む凍結乾燥体に β-CD を添加することで，リマプロストの安定性が顕著に向上した．そこで，β-CD によるリマプロストの安定化機構を解明するため，凍結乾燥体（without β-CD，with β-CD）の結晶性，性状，重量変化について検討した．

Fig. 5 は凍結乾燥体の粉末 X 線回折パターンを示す．β-CD の有無に関わらず両凍結乾燥

体（without β-CD，with β-CD）は halo （ハロー）を呈し，8週間後においても変化がなく非晶質状態を維持していることが示唆された．

Fig. 5. Powder X-ray Diffraction Patterns of Freeze Dried Composite with or without β-CD at 30˚C, 75%R.H. after 1, 2, 3, 4, 8 weeks

without β-CD with β-CD

0 week 2 weeks 3 weeks 4 weeks 8 weeks

1 week

0 week 2 weeks 3 weeks 4 weeks 8 weeks

1 week

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(21)

Fig. 6 は，30 °C, 75%R.H. で8週間保存した際の凍結乾燥体の外観を示す．β-CD の有無により凍結乾燥体の外観が異なり，β-CD を含む凍結乾燥体（with β-CD）は8週間後でも外観に変化がなかったが，β-CD を含まない凍結乾燥体（without β-CD）は1週間で顕著に収縮した．そこで，凍結乾燥体の重量変化を調べることで，凍結乾燥体が吸湿した水分量を予測できると考えて，経時的に重量を測定した．Fig. 7 は凍結乾燥体の重量変化を示す．

凍結乾燥体の重量は30 °C, 75%R.H. に保存した直後から増加し，凍結乾燥体（without β-CD）

は約 22% ，凍結乾燥体（with β-CD）は約 17% の時点で定常状態を示した．

Fig. 6. Appearance of Lyophilized Composites with or without β-CD at 30 °C, 75%R.H.

after eight weeks

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(22)

Fig. 7. Increased Weight % of Freeze Dried Composite with or without β-CD at 30˚C, 75%.R.H.

◇: Lyophilized composite without β-CD, □: Lyophilized composite with β-CD.

Each point represents the mean ±S.E. of three experiments.

Fig. 8 は走査型電子顕微鏡（SEM）による凍結乾燥体の表面観察の結果を示す．凍結乾燥

体（without β-CD）は，吸湿による粉末の凝集とみられる表面形態の変化が観察されたのに対して，β-CD を含む凍結乾燥体（with β-CD）では変化は認められなかった．凍結乾燥体

（without β-CD）は凍結乾燥体（with β-CD）よりも重量増加が大きく，また凍結乾燥体の表面には凝集とみられる変化が生じており，これらはいずれも凍結乾燥体が吸着した水分の影響であると推察される．β-CD を含まない凍結乾燥体（without β-CD）では，吸湿した水分により凍結乾燥体が構造を維持できずに外観も収縮したと考えられる．一方，凍結乾燥体（with β-CD）は，β-CD を添加したことで高湿度下においても凍結乾燥体が構造を維持しており，このことがリマプロストの安定化に寄与した可能性が考えられた．

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(23)

Fig. 8. SEM Images of Lyophilized Composites with or without β-CD at 30 °C, 75%R.H.

after eight weeks

Initial 8 weeks

Initial

8 weeks

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(24)

第4節 β-CD によるリマプロストアルファデクス錠の安定化

前節までの結果から，β-CD をリマプロストアルファデクスとデキストラン40から成る凍結乾燥工程に加えることで，凍結乾燥体中のリマプロストの安定性が顕著に向上することが明らかとなった．本節では，本剤の剤形が錠剤であることを踏まえて，第2節で検討した β-CD を含む凍結乾燥体に更に打錠用添加剤として β-CD を加えて錠剤化することで，打錠工程における β-CD の効果を検討した．

2種類の凍結乾燥体（with β-CD，without β-CD）について，打錠用添加剤として β-CD を添加した錠剤と添加しない錠剤を製造し，計4種類の錠剤について30 °C, 75%R.H. における安定性を比較した．なお，β-CD を添加しない錠剤では，対照として乳糖水和物を打錠用添加剤に用いた．結果を Table 7 に示す．凍結乾燥工程及び打錠工程ともに β-CD を全く含まない Formulation A（−，−）では，分解物 11-deoxy-∆¹⁰の生成率は2週間で 4.4% であった．また，打錠用添加剤のみに β-CD を含む Formulation B（−，+）で 3.4% ，凍結乾燥体のみに β-CD を含む Formulation C（+，−）では 4.5% であった．これに対し，凍結乾燥工程及び打錠工程の両方に β-CD を含む Formulation D（+，+）では，分解物 11-deoxy-∆¹⁰ の生成率は 1.2% にまで減少した．1カ月保存後では，他の処方の錠剤中における分解物 11-deoxy-∆¹⁰ の生成量は 5.0% を超えたのに対して，Formulation D（+，+）の錠剤においては，わずかに 2.0% であった．

Table 7. Contents of Degradation Product in Tablet Formulations with or without β-CD at 30˚C, 75%R.H. after one month storage

Presence or Absence of β-CD

Formulation A B C D

Lyophilized Composite − − + +

Tablet Formulation − + − +

11-deoxy-Δ¹⁰ (%)

30 °C, 75%R.H., 2 weeks 4.4 3.4 4.5 1.2

30 °C, 75%R.H., 1 month 9.7 Not tested 7.8 2.0

−: absence, +: presence

-19-

(25)

打錠用添加剤として β-CD を加えて錠剤化することで，リマプロストの安定性が向上することが確認できた．そこで，打錠用添加剤として加えた β-CD の効果をより詳細に評価するため，リマプロストアルファデクスの安定性改善効果が報告されているデキストラン，

及び β-CD の誘導体である Hydroxypropyl-β-CD （HP-β-CD）についても，リマプロストの安定性に及ぼす影響を検討した．すなわち，β-CD を含まない凍結乾燥体（without β-CD）

に，打錠用添加剤としてと HP-β-CD （Formulation E）またはデキストラン（Formulation F）

を加えた錠剤を製造し，30 °C, 75%R.H. における安定性を評価した．結果を Table 8 に示す．30 °C, 75%R.H. で2週間後の分解物 11-deoxy-∆¹⁰の生成量は，Formulation E で 4.7% ， Formulation F で 3.8% であった．分解物 11-deoxy-∆¹⁰の生成量は Formulation E ＞ Formulation A ＞ Formulation F ＞ Formulation B であり，リマプロストに対する安定化効果の高さは β-CD ＞デキストラン＞乳糖水和物＞ HP-β-CD の順であった．β-CD に比べて

HP-β-CD の安定化効果が低かった原因の一つとして，吸湿特性が考えられる．25 °C,

98%R.H. における β-CD の吸湿曲線は速やかに飽和に達して，2時間以降の含水率は 19%

を保持するのに対して，高水溶性である HP-β-CD の6時間後の含水率は55%に達し，その後も増加傾向があると報告されている．⁵³⁾そこで，β-CD，デキストラン，HP-β-CD の粉末を 30 °C, 75%R.H. で1週間保存した後の外観を確認した．その結果，β-CD は保存開始時と同じく粉末状態を維持したのに対して，デキストランは一旦潮解した後，固化した状態であった．また，HP-β-CD についても，粉末が凝集して固化する傾向が認められた．したがって，吸湿による影響は，デキストラン＞ HP-β-CD ＞ β-CD の順に大きいことが示唆された．今回のような加湿条件では，吸湿した水によって添加剤の分子が溶解し，固体状態を維持して水を保持できなくなったため，水がリマプロストに接触しやすくなり安定性の低下を生じたと推察している．このため，β-CD に比べて HP-β-CD の安定化効果が低くなったと考えられる．なお，HP-β-CD はヒドロキシプロピル基の置換基数が異なる分子の混合物であることから，置換基数の違いも考慮した上で，水分を吸湿した状態での HP-β-CD の物理化学的性質，吸湿した水の運動性等を今後より詳細に検討する必要がある．

Table 8. Contents of Degradation Product in Tablet Formulations with tableting additives at 30 ˚C, 75%R.H. after two weeks storage

Presence or Absence of β-CD

Formulation A B E F

Lyophilized Composite − − − −

Tableting Additives Lactose

hydrate β-CD HP-β-CD dextran 11-deoxy-Δ¹⁰ (%)

30 °C，75%R.H., 2 weeks 4.4 3.4 4.7 3.8

−: absence

-20-

(26)

凍結乾燥工程及び打錠工程の両方に β-CD を含む Formulation D （+，+）の錠剤では，

30 °C, 75%R.H. における分解物の生成量が低下し，リマプロストの安定性が顕著に向上し

た．そこで，第2節と同じく，錠剤中に CD 非包接体として存在するリマプロストの量を比較するため，上述の計算式 Eq. 1 を用いて Formulation A （−，−）と Formulation D （+，

+）中に含まれるリマプロスト非包接体の量を測定した．その結果，Fig. 9 に示すように，

製造直後の錠剤に含まれるリマプロスト非包接体の量は約 3.0% であり，30 °C, 75%R.H.

に8週間保存した後は 1.5% に減少した．これは保存中に錠剤が吸湿した水分が，酢酸エチルによるリマプロストの抽出に影響を与えたことが原因の一つと推察される．しかしながら，保存後のリマプロスト非包接体の量は 1.5% であり，両錠剤間でほとんど差が無かった．またリマプロスト非包接体中には，分解物 11-deoxy-∆¹⁰ は検出されなかった．

一方，Table 7 に示したように，30 °C, 75%R.H. に1カ月保存後では，Formulation A で

9.7% ，Formulation D で 2.0% の分解物が各錠剤中に検出されていることから，第2節で

示した凍結乾燥体中におけるリマプロストの分解機構と同様の機構が示唆された．すなわち，Formulation A 及び Formulation D ともに，にリマプロスト及び分解物は CD に包接された状態であるにも関わらず，凍結乾燥工程及び打錠工程の両方に β-CD を含む

Formulation D のみでリマプロストの安定性が顕著に向上した．したがって，β-CD の有無

によってリマプロストの CD 包接様式は異なっていると推察され，この CD 包接様式の違いが Formulation A と Formulation D におけるリマプロストの安定性の差に反映されたと考えられる．

Fig. 9. Free Form Contents in Limaprost Alfadex Tablets at 30 °C, 75%R.H.

◇: Formulation A, □: Formulation D

◇

0.0 1.5 3.0 4.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Limaprost free form, %

Time, Weeks