論文 内 容の 要旨
F i g. 1 . A n n u a l t r a ns it io n o f c la r it h r o my c i n - s us c e p t i b le s t r a i ns i n B LN AR H . i n f l u e n z a e T a b le 1 . M I C s o f C AM - r e s is t a n t B L N AR a nd C AM - s us c e p t ib le B L N AR H . i n f l u e n z a e と し て 分 離 さ れ た 304 株 を 用 い た 。各 種 薬 剤 感 受 性 は 、微 量 液 体 希 釈 法 に よ り 測 定 し 、 最 小 発 育 阻 止 濃 度 (MIC) か ら 判 定 し た 。
い ず れ の 年 度 に 分 離 さ れ た 株 も 、 meropenem や tebipenem、 levofloxacin (LVFX)、 tosufloxacin (TFLX) に 対 し て 、良 好 な 感 受 性 を 示 し て い た 。一 方 で 、macrolide 系 薬 で あ る clarithromycin (CAM) に 対 し て 、 低 度 耐 性 株 (MIC = 16 g/mL) と 耐 性 株 (MIC ≥32 g/mL) が 認 め ら れ た 。CAM 低 度 耐 性 株 と 耐 性 株 の 割 合 を 年 次 で 解 析 し た と こ ろ 、 azithromycin (AZM) 小 児 細 粒 導 入 後 (2009 年 )、CAM の 感 受 性 率 は 、2010 年 を 境 に 減 少 し 、 2012 年 に は 、 52.9%に 低 下 し て い た (Fig. 1)。ま た 、2007 年 か ら 2009 年 と 2010 年 か ら 2012 年 の 3 年 間 を 比 較 す る と 、感 受 性 率 が 有 意 に 低 下 し て い た (P < 0.05)。 さ ら に 、CAM 耐 性 株 の 出 現 が 認 め ら れ た (n = 12)。 次 に 、 CAM 耐 性 株 の 遺 伝 学 的 背 景 を multilocus sequence typing (MLS T) 法 で 解
析 し た と こ ろ 、9 種 の 異 な る 遺 伝 子 型 が 認 め ら れ た 。従 っ て 、CAM 耐 性 株 は 特 定 の 株 が 流 行 し て い る わ け で は な く 、 遺 伝 学 的 多 様 性 が あ る こ と が 示 さ れ た 。 本 章 よ り 、 BLNAR に お い て 、 CAM 低 度 耐 性 株 が 増 加 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。 加 え て 、 CAM 耐 性 株 も 出 現 し て い た 。 こ れ は 、 市 中 感 染 症 に 対 し て macrolide 系 薬 の 使 用 頻 度 が 上 が っ た た め 、 こ の 選 択 圧 を 受 け た こ と に 起 因 す る と 考 え ら れ る 。 ま た 、CAM 耐 性 株 は 、特 定 の ク ロ ー ン の 株 が 流 行 し て い る わ け で は な く 、独 立 し て 出 現 し て い る た め 、 ど の 株 で も CAM に 対 し て 耐 性 化 し 得 る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。 第 2 章 : Macrolide 耐 性 の 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 析
第 1 章 に お い て 、 BLNAR の CAM 耐 性 株 の 出 現 を 見 出 し た 。 そ こ で 、 こ の CAM 耐 性 の 分 子 メ カ ニ ズ ム を 研 究 し た 。 菌 株 は 、 2010 年 か ら 2012 年 の 間 に 分 離 さ れ た 7 株 の CAM 耐 性 BLNAR を 用 い た 。 ま ず 、 既 知 の macrolide 耐 性 遺 伝 子 mef(A) と erm(B) の 検 出 及 び リ ボ ソ ー ム タ ン パ ク L4 と L22 の 変 異 を 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 mef(A) と erm(B) は 検 出 さ れ ず 、L4 と L22 中 に ア ミ ノ 酸 置 換 を 伴 う 変 異 も 認 め ら れ な か っ た 。次 に 、 排 出 タ ン パ ク に よ る macrolide 耐 性 を 調 べ た 。 排 出 ポ ン プ 阻 害 剤 を 添 加 し 、 MIC を 測 定 し た と こ ろ 、 CAM 耐 性 株 の CAM 及 び AZM の MIC は 、 排 出 ポ
Year 0 20 40 60 80 100 2007 (n = 55) 2008 (n = 53) 2009 (n = 41) 2010 (n = 68) 2011 (n = 53) 2012 (n = 34) % of C A M -s us ce pt ibl e st ra in s 70.9 71.7 80.5* 70.6 50.9 52.9 *) P < 0.05, 2007 ~ 2009 vs. 2010 ~ 2012 Strain 0.75 1.5 0.75 1.5 2010-124 32 16 1 4 2 0.13 2011-54 32 16 4 4 2 0.5 2011-70 32 16 4 4 1 0.25 2011-72 32 16 1 4 1 ≤0.06 2011-82 32 16 0.5 4 2 0.13 2012-42 32 16 4 8 4 1 2012-46 32 16 4 4 2 0.5 2011-130 1 1 1 0.13 ≤0.06 ≤0.06 ATCC49247 2 2 1 0.25 0.25 ≤0.06 H. influenzae Rd 8 4 0.25 0.5 0.5 ≤0.06 H. inf Rd42acr 32 16 2 8 4 0.5 CAM MIC + CCCP (μg/mL) AZM MIC + CCCP (μg/mL) CAM AZM
ン プ 阻 害 剤 の 濃 度 依 存 的 に 低 下 し た (Table 1)。そ こ で 、CAM 耐 性 2012-42 株 、 感 受 性 2011-130 株 と ATCC49247 株 の 染 色 体 性 多 剤 排 出 ポ ン プ 遺 伝 子 (yieO 、 ydeA、emrB、norM、acrB) に つ い て mRNA 量 を 半 定 量 的 RT-PCR 法 で 解 析 し た (Fig. 2)。 そ の 結 果 、 CAM 耐 性 株 の acrB 遺 伝 子 の 転 写 量 の み が 、CAM 感 受 性 株 と 比 較 し て 有 意 に 高 か っ た (P < 0.05)。さ ら に 、 耐 性 株 と 感 受 性 株 の acr 領 域 (acrR、acrA、 acrB) の DNA シ ー ケ ン ス を 行 い 、標 準 株 で あ る H. influenzae Rd 株 の acr 領 域 と 比 較 し た 。 全 て の 耐 性 株 で 、 acrAB の 負 の 調 節 因 子 を コ ー ド す る acrR 中 に 遺 伝 子 欠 損 あ る い は 挿 入 が 認 め ら れ 、フ レ ー ム シ フ ト に 伴 い ナ ン セ ン ス 変 異 が 生 じ て い た 。さ ら に 、CAM 耐 性 2012-42 株 の acr 領 域 を 標 準 株 の H. influenzae Rd 株 に 導 入 し た と こ ろ 、 2012-42 株 と 同 じ MIC 値 を 示 し た (Table 1)。 ま た 、 形 質 導 入 株 の acrB 遺 伝 子 転 写 量 は 、 親 株 で あ る H. influenzae Rd 株 と 比 較 し て 有 意 に 高 か っ た (P < 0.05) (Fig. 2)。 加 え て 、 2012-42 株 は 、 AZM に も 低 度 耐 性 を 示 し た こ と か ら 、
acrR に 同 じ 変 異 を も つ CAM 耐 性 AZM 感 受 性 株 (2011-70) の Acr 領 域 と 比 較 解 析 を
行 っ た 。 そ の 結 果 、 2012-42 株 の み 、 AcrB の 327 番 目 の ア ミ ノ 酸 置 換 が 認 め ら れ た 。
H. influenzae Rd 株 に こ れ ら 2 つ の 株 に 由 来 す る Acr 領 域 を 導 入 し 、ア ミ ノ 酸 置 換 の 有
無 に よ る 影 響 を 比 較 し た と こ ろ 、こ の ア ミ ノ 酸 置 換 を 持 つ 株 は 、AZM の MIC 値 が 2.3 倍 高 か っ た 。
以 上 の 結 果 よ り 、 CAM 耐 性 株 は 、 薬 剤 排 出 ポ ン プ acrAB の 調 節 因 子 で あ る acrR 中 の ナ ン セ ン ス 変 異 に よ り 、 負 の 調 節 機 構 が 破 綻 し 、 排 出 ポ ン プ が 亢 進 す る こ と で 耐 性 化 し た こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、 acrR の 変 異 部 位 は 様 々 で あ っ た 結 果 か ら 、 CAM 耐 性 化 は 、抗 菌 薬 の 選 択 圧 に よ っ て 、生 じ 得 る こ と が 示 唆 さ れ た 。さ ら に、acrR 変 異 株 は 、 acrB に 点 変 異 を 獲 得 す る と 段 階 的 に AZM に 対 し て も 低 度 耐 性 を 示 す こ と を 明 ら か に し た 。 第 3 章 : 小 児 由 来 株 に お け る fluoroquinolone 低 感 受 性 株 の 増 加 近 年 、 高 齢 の 患 者 か ら 分 離 さ れ た H. influenzae に お い て 、 fluoroquinolone 系 薬 の 耐 性 株 が 検 出 さ れ て い る 。日 本 で は 、こ れ ま で 小 児 の 呼 吸 器 疾 患 に 対 し て fluoroquinolone 系 薬 は 適 応 さ れ て い な か っ た が 、 2010 年 に 、 TFLX の 適 応 が 小 児 に 拡 大 さ れ た 。 そ こ で 、 対 象 を H. influenzae 全 体 に 広 げ 、 東 京 医 科 大 学 八 王 子 医 療 セ ン タ ー の 小 児 科 由 来 株 に お け る fluoroquinolone 系 薬 の 薬 剤 感 受 性 の 変 化 及 び fluoroquinolone 標 的 遺 伝 子 (gyrA、 parC) の 解 析 を 行 っ た 。 F i g. 2 . T r a ns c r i p t io n le ve l o f a c r B ge ne i n H . i n f l u e n z a e 0 0.5 1 1.5 2 2.5 42 130 ATCC Rd Rd42acr R el at ive in te ns it y 2012-42 2011-130 ATCC49247 Rd Rd42acr Strains * ** * *
2012-42, CAM-resistant strain; 2011-130, CAM-susceptible strain; ATCC49247, CAM-susceptible control strain; Rd, H.
influenzae Rd; Rd42acr, Rd strain transformed with the acrR
菌 株 は 、2013 年 か ら 2014 年 に 小 児 科 で 分 離 さ れ た 計 96 株 の H. influenzae を 用 い た 。 成 人 に 汎 用 さ れ る LVFX と 小 児 適 応 の あ る TFLX に つ い て 詳 細 に 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、 全 て の 株 が 感 受 性 を 示 し た (Fig. 3)。し か し 、 2014 年 に は LVFX の 感 受 性 ピ ー ク か ら 外 れ た MIC 0.063 g/mL 以 上 を 示 す 明 ら か な 低 感 受 性 株 が 認 め ら れ た 。 こ れ ら の 菌 株 に つ い て 、GyrA と ParC の fluoroquinolone 耐 性 決 定 領 域 に お け る ア ミ ノ 酸 置 換 の 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、LVFX 低 感 受 性 株 で は 、GyrA の 84 番 目 の Ser が Leu に 置 換 (S84L) し て い た (Table 2) 。 GyrA の S84L を 保 有 す る LVFX 低 感 受 性 株 は 、2013 年 で は 認 め ら れ な か っ た が 、2014 年 で は 、 14%と 有 意 に 増 加 し て い た (P < 0.05)。そ こ で 、 こ の S84L の ア ミ ノ 酸 置 換 を 検 出 で き る よ う に プ ラ イ マ ー を 設 計 し 、PCR に よ る 検 出 法 を 開 発 し た 。本 手 法 の 感 度 と 特 異 度 は 、そ れ ぞ れ 100% と 98.9%で あ り 、 本 手 法 の 有 用 性 が 示 さ れ た 。 こ れ ま で の 報 告 か ら 、S84L に 加 え 、も う 一 つ ア ミ ノ 酸 置 換 が 入 る と 耐 性 株 と な る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 つ ま り 、 小 児 領 域 で は 、 fluoroquinolone 耐 性 化 の 初 期 段 階 で あ る H. influenzae が 増 加 し て い る こ と を 示 し て い る 。 従 っ て 、 更 な る 耐 性 化 を 防 ぐ た め に は 、抗 菌 薬 の 適 正 使 用 と 低 感 受 性 化 の 状 況 の 把 握 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る 。ま た 、 そ の 際 、 本 研 究 で 開 発 し た 簡 易 検 出 法 は quinolone 系 薬 を 適 正 に 選 択 す る 上 で 、 有 用 な ツ ー ル と な り 得 る こ と が 示 さ れ た 。 第 4 章 : 外 来 性 遺 伝 子 を 保 有 す る 多 剤 耐 性 H. influenzae の 出 現 と そ の 遺 伝 学 的 特 徴 第 3 章 の 薬 剤 感 受 性 に 関 す る 疫 学 解 析 に お い て 、2014 年 に 小 児 科 で 喀 痰 か ら 分 離 さ れ た 株 中 に 、penicillin、macrolide、tetracycline 系 薬 に 高 度 耐 性 を 示 す 2014-102 株 を 見 出 し た 。 2014-102 株 は 、 第 1 章 及 び 第 2 章 で 分 離 及 び 解 析 し た acrR 変 異 に よ る CAM 耐 性 株 と は 異 な り 、 全 て の macrolide 系 薬 に 高 度 耐 性 を 示 し た 。 そ こ で 、 macrolide 耐 性 機 構 の 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、2014-102 株 は 、macrolide 排 出 ポ ン プ を コ ー ド す る mef(A) 遺 伝 子 を 保 有 し て い た 。mef(A) 遺 伝 子 周 辺 領 域 の 塩 基 配 列 を 解 析 し た と こ ろ 、
tetracycline 耐 性 に 関 与 す る tet(M) 遺 伝 子 が mef(A) 遺 伝 子 の 近 傍 に 存 在 し て い た 。 こ
T a b le 2 . M I C fo r f l u o r o q u i n o lo ne s a nd a mi n o a c id s ub s t i t ut io ns i n G y r A a nd P a r C F i g. 3 . M I C d is t r i b ut i o n o f t w o f l u o r o q u i no l o ne s i n c l i n i c a l H . i n f l u e n z a e is o la t e s ATCC49247 0.008 0.004 0.004 0.008 0.032 ≤0.002 - -Rd 0.008 0.004 0.004 0.004 0.032 ≤0.002 - -2014-46 0.5 0.25 0.25 0.25 1 0.016 S84L -2014-68 0.125 0.063 0.125 0.125 0.125 0.016 S84L N138S 2014-72 0.063 0.063 0.063 0.125 0.25 0.004 S84L S133A, N138S 2014-74 0.125 0.125 0.125 0.125 0.5 0.016 S84L N138S 2014-88 0.125 0.125 0.125 0.125 0.25 0.008 S84L -2014-90 0.25 0.125 0.125 0.25 0.25 0.032 S84L -2014-96 0.25 0.125 0.125 0.25 0.5 0.016 S84L -LVFX TFLX CPFX MFLX NFLX STFX GyrA ParC Strain QRDR* substitution MIC (g/mL)
の 遺 伝 子 領 域 は 、 Streptococcus pneumoniae の Tn916-family transposon 上 の 配 列 と 99% の 相 同 性 を 示 し た (Fig. 4)。以 上 の 結 果 よ り 、同 じ 上 気 道 に 存 在 す る S. pneumoniae か ら 水 平 伝 播 に よ っ て 、 mef(A) 遺 伝 子 及 び tet(M) 遺 伝 子 を 獲 得 し た 多 剤 耐 性 H. influenzae が 出 現 し た こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。 総 括 近 年 、 薬 剤 耐 性 (AMR) は 、 グ ロ ー バ ル な 社 会 問 題 と し て 重 要 視 さ れ て い る 。 本 邦 で は 、cephem 系 薬 、fluoroquinolone 系 薬 及 び macrolide 系 薬 の 不 適 切 な 使 用 が AMR の 一 因 と し て 考 え ら れ る 。 本 研 究 で は 小 児 科 領 域 に お け る 抗 菌 薬 の 新 規 導 入 や 適 応 拡 大 が 、H. influenzae の 薬 剤 感 受 性 に 影 響 し 、fluoroquinolone や macrolide 系 薬 に 対 す る 低 感 受 性 株 や 低 度 耐 性 株 の 増 加 に 加 え 、macrolide 系 薬 耐 性 株 の 出 現 を も た ら し て い る 可 能 性 を 示 し た 。 さ ら に 、 こ れ ら の 薬 剤 に 対 す る 耐 性 機 構 は 主 に 関 連 遺 伝 子 の 変 異 に よ る こ と を 明 ら か と し た 。 ま た 、 mef(A) 及 び tet(M) を 内 包 す る ト ラ ン ス ポ ゾ ン を 獲 得 し た と 考 え ら れ る 多 剤 高 度 耐 性 株 を 初 め て 見 出 し た 。 こ れ ら の 成 果 は 、 小 児 科 領 域 で 多 剤 耐 性 化 が 急 速 に 進 行 し て い る こ と を 示 し て い る 。
市 中 で 分 離 さ れ る H. influenzae の 多 く が -lactam 系 薬 に 耐 性 を 示 す た め 、 macrolide 系 薬 や fluoroquinolone 系 薬 の よ う な 代 替 薬 の 感 受 性 低 下 は 、適 応 薬 が 限 ら れ る 小 児 に お い て 治 療 上 深 刻 な 問 題 で あ る 。 本 研 究 で 得 ら れ た H. influenzae の 経 時 的 な 薬 剤 感 受 性 サ ー ベ イ ラ ン ス や 薬 剤 耐 性 機 構 の 解 明 は 、 新 規 抗 菌 薬 開 発 の 手 が か り に 加 え 、 H. influenzae 耐 性 菌 の 出 現 及 び 伝 播 を 抑 制 す る た め の 抗 菌 薬 適 正 使 用 に 有 益 な 情 報 を 付 与 し 、 国 際 的 問 題 で あ る AMR 対 策 に 貢 献 す る こ と が で き る と 考 え る 。 【 研 究 成 果 の 掲 載 誌 】
(1) J Glob Antimicrob Resist. 6: 22-26. (2016)
(2) Antimicrob Agents Chemother . 60: 3207-10. (2016) (3) Antimicrob Agents Chemother . 61: e01337-17. (2017) (4) Pediatr Infect Dis J. 36: 263-266. (2017)
論文審査の結果の要旨
