論文 内 容の 要旨
ア ク ネ 菌 Cutibacterium acnes は 嫌 気 性 グ ラ ム 陽 性 桿 菌 で 、 ヒ ト の 皮 膚 常 在 菌 で あ る 。脂 肪 酸 を 産 生 す る こ と で 皮 膚 機 能 の 維 持 を 担 っ て い る が 、面 皰 内 で 異 常 増 殖 す る こ と に よ り 痤 瘡 (ニ キ ビ ) の 増 悪 因 子 と な る こ と が 知 ら れ て い る 。痤 瘡 は 、世 界 中 の 多 く の ヒ ト が 思 春 期 か ら 青 年 期 に か け て 経 験 す る 炎 症 性 の 慢 性 皮 膚 疾 患 で あ る 。顔 や 胸 背 部 に 好 発 し 、さ ら に 、瘢 痕 が 形 成 さ れ る と 治 癒 が 難 し く な り 、患 者 の quality of life を 大 き く 低 下 さ せ る た め 、 痤 瘡 治 療 の 重 要 性 は 高 ま っ て い る 。 痤 瘡 の 急 性 炎 症 期 に は 、増 悪 因 子 で あ る C. acnes を 標 的 と し た 抗 菌 薬 治 療 が 行 わ れ 、 日 本 で は 外 用 薬 と し て リ ン コ マ イ シ ン 系 の clindamycin や キ ノ ロ ン 系 の nadifloxacin、ozenoxacin が 使 用 さ れ る 。中 等 症 以 上 の 患 者 に は 、経 口 薬 と し て テ トラ サ イ ク リ ン 系 の doxycycline や minocycline、マ ク ロ ラ イ ド 系 の
に 、clindamycin 耐 性 C. acnes が 流 行 し て い る 要 因 を 明 ら か に す る た め 、 薬 剤 耐 性 因 子 と そ の 伝 達 機 構 に つ い て 研 究 し た 。 第 1 章 日 本 に お け る 痤 瘡 由 来 C. acnes の 薬 剤 耐 性 調 査 日 本 に お け る 痤 瘡 由 来 薬 剤 耐 性 C. acnes の 流 行 状 況 を 明 ら か に す る た め 、 2013-2015 年 に 、痤 瘡 専 門 外 来 を 有 す る 病 院 を 受 診 し た 痤 瘡 患 者 か ら 分 離 さ れ た 70 株 の C. acnes に つ い て 研 究 し た 。薬 剤 感 受 性 を 測 定 し た 結 果 、β-ラ ク タ ム 系 薬 や テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 薬 に 耐 性 を 示 す 菌 株 は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た (Table 1)。 一 方 、 マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 お よ び clindamycin に 対 し 、そ れ ぞ れ 、44.3%お よ び 38.6%の 菌 株 が 耐 性 を 示 し た 。マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 に 耐 性 を 示 し た 31 株 の 耐 性 因 子 を 解 析 し た と こ ろ 、23S rRNA 遺 伝 子 変 異 株 が 17 株 、 erm(X)保 有 株 が 6 株 認 め ら れ た 。 加 え て 、 既 知 の 耐 性 因 子 が 検 出 さ れ な い 菌 株 が 8 株 認 め ら れ た 。 患 者 の 抗 菌 薬 使 用 歴 を 解 析 す る と 、マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 ま た は clindamycin を 使 用 し て い た 患 者 で 耐 性 菌 分 離
率 が 著 し く 高 か っ た (55.3%, P <0.05)。 C. acnes が 有 す る housekeeping gene の 塩 基 配 列 で 分 類 す る single-locus sequence typing (SLST) を 用 い て 痤 瘡 由 来 C. acnes の
遺 伝 子 型 を 決 定 し た と こ ろ 、健 常 者 の 皮 膚 で 最 も 多 く 認 め ら れ る clade A の 菌 株 が 最 も 多 か っ た が 、 そ の 一 方 で 、 健 常 者 で は ほ と ん ど 認 め ら れ な い clade F の 菌 株 が 32.4%を 占 め た 。 以 上 の 結 果 よ り 、 日 本 の 痤 瘡 患 者 か ら マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 お よ び clindamycin 耐 性 C. acnes が 分 離 さ れ 、 耐 性 株 の 分 離 に 抗 菌 薬 の 使 用 が 関 連 し て い る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。加 え て 、一 部 の 痤 瘡 患 者 か ら 分 離 さ れ る C. acnes の 遺 伝 子 型 は 、 健 常 者 か ら 分 離 さ れ る C. acnes の 遺 伝 子 型 と は 異 な る こ と が 示 さ れ た 。 第 2 章 C. acnes に お け る erm(X)の 伝 播 機 構 の 解 析 マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 お よ び clindamycin に 対 す る 耐 性 率 と 耐 性 因 子 の 変 化 を 明 ら か に す る た め 、 第 1 章 と 同 一 施 設 で 2016-2017 年 に 分 離 さ れ た 34 株 の 痤 瘡 由 来 C. acnes に つ い て 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 耐 性 株 の 分 離 率 は 2009-2010 年 と 比 べ 、 著 し
Table 1. Antimicrobial susceptibility of C. acnes isolated from patients with acne vulgaris in 2013 to 2015
Antimicrobial 2013 (n = 32) 2014 (n = 20) 2015 (n = 18) Total (n = 70)
agent MIC90 R MIC90 R MIC90 R MIC90 R
Amoxicillin 0.13 0 0.13 0 0.13 0 0.13 0 Cefdinir ≤0.06 0 ≤0.06 0 ≤0.06 0 ≤0.06 0 Faropenem ≤0.06 0 ≤0.06 0 ≤0.06 0 ≤0.06 0 Levofloxacin 16 12.5 16 15.0 1 5.6 8 11.4 Nadifloxacin 8 - 16 - 1 - 8 -Clarithromycin ≥256 46.9 ≥256 55.0 ≥256 27.8 ≥256 44.3 Roxithromycin ≥256 46.9 ≥256 55.0 ≥256 27.8 ≥256 44.3 Clindamycin ≥256 37.5 ≥256 50.0 ≥256 27.8 ≥256 38.6 Doxycycline 2 0 2 5.0 4 0 2 4.3 Minocycline 1 0 0.5 0 2 0 1 0
Resistance breakpoint of nadifloxacin was not defined.
く 増 加 し て い た (P <0.05, Fig. 1)。耐 性 因 子 を 比 較 し た と こ ろ 、23S rRNA 遺 伝 子 変 異 株 の 分 離 率 に 有 意 な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。 一 方 で 、erm(X) 保 有 株 が 有 意 に 増 加 し て い た (P <0.05) 。 C. acnes で は 、 遺 伝 子 転 移 因 子 transposon Tn5432 上 に コ ー ド さ れ た erm(X)を 保 有 し て い る こ と が 報 告 さ れ て お り 、C. acnes 間 で の erm(X)の 水 平 伝 播 が 推 測 さ れ た 。そ こ で 、erm(X)保 有 株 が 増 加 し た 要 因 を 明 ら か に す る た め 、菌 株 間 に お け る erm(X)の 伝 達 実 験
を filter mating 法 を 用 い て 行 っ た 。 erm(X)供 与 株 と し て 痤 瘡 由 来 Tn5432 保 有 C.
acnes TP-CU411 株 を 、 erm(X) 受 容 株 と し て 遺 伝 子 型 が 異 な る 3 株 の C. acnes
ATCC11828 株 (SLST, K9)、 ATCC6919 株 (SLST, A1)、 TP-CU459 株 (SLST, F4) を
使 用 し た 。伝 達 実 験 の 結 果 、試 験 し た 全 て の 菌 株 で 、Tn5432 と し て erm(X)が 伝 達 し て い た (Table 2)。 得 ら れ た 伝 達 株 は 、 供 与 株 と 同 様 に マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 お よ び clindamycin に 対 し て 高 度 耐 性 を 示 し た 。 伝 達 頻 度 は 菌 株 の 遺 伝 子 型 に よ っ て 異 な り 、 痤 瘡 患 者 で 多 く 認 め ら れ る clade F の 菌 株 が 他 の 菌 株 と 比 較 し 、 高 い 傾 向 を 示 し た 。 ま た 、 供 与 株 と し て TP1654 株 を 使 用 し 、 Tn5432 の 再 伝 達 実 験 を 行 っ た と こ ろ 、 再 伝 達 株 が 得 ら れ 、 そ の 頻 度 は 先 述 の 伝 達 実 験 と 同 等 で あ っ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、erm(X) が C. acnes 間 を 水 平 伝 播 す る こ と が 明 ら か と な り 、transposon に よ る 伝 達 が erm(X)保 有 C. acnes の 増 加 に 寄 与 し て い る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。 第 3 章 新 規 clindamycin 耐 性 因 子 の 探 索 第 1 章 お よ び 第 2 章 で 分 離 さ れ た clindamycin 耐 性 C. acnes に お い て 、 未 知 の 耐
性 株 (Not determined) の 出 現 お よ び 増 加 が 認 め ら れ た (Fig. 1)。本 章 で は 、 こ れ ら
の 菌 株 の 耐 性 機 構 を 明 ら か に す る た め 、C. acnes TP-CU389 株 の 全 ゲ ノ ム 配 列 を 解
析 し た 。 そ の 結 果 、 染 色 体 以 外 に 新 規 の 環 状 plasmid pTZC1 を 見 出 し た 。 染 色 体
(2,494,387 bp) 上 に は 、 薬 剤 耐 性 に 寄 与 す る 遺 伝 子 変 異 や 耐 性 遺 伝 子 は 認 め ら れ な
か っ た 。 一 方 、pTZC1 (31,440 bp) 上 に 、 23S rRNA methylase を コ ー ド す る 新 規 の
erm 遺 伝 子 お よ び テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 遺 伝 子 tet(W)を 見 出 し た 。新 規 erm 遺 伝 子
Table 2. Characteristics of conjugated C. acnes strains acquiring erm(X)
Strain erm(X) IS1249 SLST MIC (μg/mL)
(Tn5432) CAM CLDM TP-CU411 (D) + + A2 ≥256 ≥256 ATCC6919 (R) - - A1 ≤0.06 ≤0.06 Transconjugant + + A1 ≥256 ≥256 TP-CU459 (R) - - F4 ≤0.06 ≤0.06 Transconjugant + + F4 ≥256 ≥256 ATCC11828 (R) - - K9 ≤0.06 ≤0.06 Transconjugant + + K9 ≥256 ≥256 TP1654 (D)* + + F4 ≥256 ≥256 LV4-1 (R) - - K9 ≤0.06 ≤0.06 Retransconjugant + + K9 ≥256 ≥256
(D), donor; (R), recipient; *, TP1654 and LV4-1 are transconjugant of TP-CU459 and fluoroquinolone-resistant mutant of ATCC11828, respectively.
SLST, single-locus sequence typing; MIC, minimum inhibitory concentration CAM, clarithromycin; CLDM, clindamycin
0 20 40 60 2009-2010 (n = 69) 2013-2015 (n = 70) 2016-2017 (n = 34) Not determined erm(X) 23S rRNA mutation 23S rRNA mutation
Fig. 1. Distribution of macrolides-clindamycin resistance factors in C. acnes.
は 、 既 知 の erm 遺 伝 子 の ア ミ ノ 酸 配 列 と の 相 同 性 が 80%未 満 で あ っ た こ と か ら 、 新 規 の clindamycin 耐 性 遺 伝 子 erm(50)と 命 名 さ れ た 。ま た 、こ れ ま で に 分 離 さ れ た す べ て の 未 知 の 耐 性 株 は 、pTZC1 を 保 有 し て い た 。そ の た め 、同 一 菌 株 が 流 行 し て い る と 推 測 し 、pTZC1 保 有 株 の 近 縁 性 を 解 析 し た と こ ろ 、 同 一 菌 株 で は な い こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 2)。し た が っ て 、pTZC1 が 菌 株 間 を 伝 播 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。そ こ で 、pTZC1 保 有 株 を 用 い て 伝 達 実 験 を 行 っ た と こ ろ 、試 験 し た 全 て の 組 み 合 わ せ に お い て pTZC1 伝 達 株 が 得 ら れ た 。 伝 達 株 は 、 マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 お よ び clindamycin に は 高 度 耐 性 を 示 し た が 、テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 薬 は pTZC1 供 与 株 に よ っ て 異 な っ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、C. acnes に お い て 新 規 の clindamycin 耐 性 遺 伝 子 erm(50)が 、 伝 達 性 plasmid pTZC1 上 に コ ー ド さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。本 plasmid の 伝 播 が clindamycin 耐 性 率 の 上 昇 に 寄 与 し て お り 、加 え て 、pTZC1 上 に は テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 遺 伝 子 tet(W)も コ ー ド さ れ て い た こ と か ら 、多 剤 耐 性 株 が 増 加 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 総 括 本 研 究 で は 、 日 本 に お け る 痤 瘡 由 来C. acnesに お い て 、 マ ク ロ ラ イ ド 系 薬 お よ び clindamycin耐 性 株 が 増 加 し て お り 、 耐 性 菌 の 出 現 に は 抗 菌 薬 の 使 用 が 関 連 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。 加 え て 、 耐 性 因 子 の 解 析 に よ り 、erm(X) 保 有 株 お よ び
erm(50)と tet(W)を コ ー ド す る pTZC1保 有 株 の 増 加 が 、clindamycin耐 性 率 の 上 昇 に 寄
与 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。 こ れ ら の 耐 性 因 子 はC. acnes間 を 伝 播 す る た め 、
患 者 の 抗 菌 薬 使 用 の 有 無 に か か わ ら ず 耐 性 菌 が 出 現・増 加 す る 可 能 性 が あ る 。薬 剤 耐 性C. acnesの 流 行 状 況 お よ び 耐 性 因 子 の 伝 達 機 構 を 明 ら か に し た 本 研 究 成 果 は 、
痤 瘡 治 療 に お け る 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 お よ び 増 加 の 抑 制 を 目 的 と し た 抗 菌 薬 適 正 使
用 の た め の 有 益 な 情 報 と な る 。 ま た 、 本 研 究 で 初 め て 見 出 し た 伝 達 性plasmidの 解
析 は 、C. acnesで応 用 可 能 な 組 換 えDNA実 験 系 に お け る遺 伝 子 導 入vectorの 構 築 と い
っ た 基 礎 細 菌 学 の 発 展 に も 貢 献 で き る 。 Strain SLST MIC (μg/mL) CAM CLDM TC DOXY TP-CU414 F4 ≥256 ≥256 2 1 TP-CU390 F4 ≥256 ≥256 1 0.5 TP-CU405 F4 ≥256 ≥256 1 0.5 TP-CU384 F1 ≥256 ≥256 4 2 TP-CU389 F1 ≥256 ≥256 1 0.5 TP-CU426 F1 ≥256 ≥256 8 8 TP-CU437 F1 ≥256 ≥256 16 8 TP-CU73 C1 ≥256 ≥256 32 32 ATCC11828 K9 ≤0.06 ≤0.06 0.25 0.13 Similarity (%) PFGE pattern 100 90 80 70 60
Fig. 2. Molecular epidemiological analysis and antimicrobial susceptibility for C. acnes carrying pTZC1. PFGE, pulsed-field gel electrophoresis; SLST, single-locus sequence typing;
【 研 究 結 果 の 掲 載 】
1. J Dermatol, 44, 1248-1254, (2017) 2. J Med Microbiol, 68, 26-30, (2019)
論文審査の結果の要旨 Cutibacterium acnes はヒトの皮膚常在菌で、通常は皮膚機能の維持を担っている。一方 で、痤瘡の増悪因子となることが知られている。痤瘡は、思春期から青年期にかけて顔や胸 背部に好発し、患者のQOL を大きく低下させることから、近年ではC. acnes を標的とした 抗菌薬治療が行われている。しかし、薬剤耐性C. acnes の出現が報告され、特にマクロライ ド系薬および clindamycin 耐性株の増加が認められている。痤瘡治療では、抗菌薬が単剤で 長期にわたって処方されるなど、不適切な使用が薬剤耐性C. acnes の出現および増加の原因 となっていることが推測される。そこで本研究では、日本の痤瘡患者由来C. acnes における 薬剤耐性菌の流行状況と薬剤耐性因子の伝達機構について研究した。 第1 章では、痤瘡患者における薬剤耐性C. acnes の流行状況を調査した。その結果、マク ロライド系薬およびclindamycin 耐性株の著しい増加が認められた。マクロライド耐性株の 耐性因子を解析したところ、従来の標的部位の変異だけでなく、外来性の耐性遺伝子である erm(X)保有株の増加が認められた。また、既知の耐性因子が検出されない新規の耐性株を見 出した。次に、患者の抗菌薬使用歴を解析したところ、マクロライド系薬またはclindamycin を使用していた患者において、耐性菌の分離率が著しく高いことが分かった。さらに、健常 者ではほとんど認められない遺伝子型の菌株が高頻度に認められた。以上、第 1 章の結果よ り、日本の痤瘡患者において、マクロライド系薬およびclindamycin の使用によって、薬剤 耐性 C. acnes が増加していることが強く示唆された。加えて、痤瘡患者から分離されるC. acnes は、健常者とは異なる遺伝子型を有することが示された。 第2 章では、外来性の耐性遺伝子である erm(X)保有株が顕著に増加していることを受け、 その伝播機構について研究した。その結果、erm(X)は試験した全ての菌株において、トラン スポゾンとして伝達し、マクロライド系薬および clindamycin に高度耐性を付与した。伝達 頻度は菌株の遺伝子型によって異なり、痤瘡患者で多く認められた遺伝子型の菌株は、他の 菌株よりも高い傾向を示した。以上、第 2 章の結果より、薬剤耐性遺伝子であるerm(X)が、 C. acnes 菌株間を水平伝播することを初めて明らかにした。 第3 章では、新規 clindamycin 耐性因子について研究した。既知の耐性因子が検出されな いclindamycin 高度耐性株の全ゲノム配列を解析した結果、新規のプラスミドを見出した。
このプラスミドには、23S rRNA methylase をコードする新規のerm遺伝子およびテトラサ
