摂食エネルギー調節による腹腔内脂肪量の変化と骨格筋特性の適応との関連性 [ PDF

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(1)摂食エネルギー調節による腹腔内脂肪量の変化と骨格筋特性の適応との関連性キーワード：肥満，腹腔内脂肪，骨格筋線維組成，骨格筋酵素活性，高脂肪食，食事制限，レプチン所属行動システム専攻健康科学コース氏名１．背景と目的社会の近代化に伴い、肥満の発症率は増え続け、主要な社会的な健康問題となってきた。肥満と過体重は男女ともに各年代に発症する。. 鄒歩浩. 血管形態、酸化系・解糖系酵素活性などの骨格筋特性と肥満との関係についての研究が主に行われてきた。骨格筋線維はそれぞれの生理学的な収縮特性により、遅筋（タイプ I）線維と速筋（タイプ II）線維に分類さ. 肥満は単純性肥満と症候性肥満に区分される。前者は. れる。この収縮特性の違いは収縮蛋白ミオシン重鎖の. 生活習慣病の重要な危険因子であることから、本研究で. ATPase 活性に起因する。最近、タイプ II 線維は免疫組. は前者について論じる。. 織染色またはミオシン ATPase 染色により、さらにラット. 肥満は単なる過体重ではなく、標準体重をやや超えた. でタイプ IIA、IIX、IIB に、ヒトでタイプ IIA、IIX に区. 肥満者でも種々の臨床症状を保有しやすい。体脂肪率は. 分された。筋毛細血管密度は栄養成分の吸収だけではな. 体重より重要な指標である。これらの肥満に起因する、. く、インスリンの作用にも影響するため、インスリン抵. もしくは肥満により悪化する疾患には、インスリン非依. 抗性と糖の取り込みの重要な因子である。ヒトの毛細血. 存性糖尿病、高血圧、動脈硬化、冠動脈疾患、脳出血な. 管と筋線維の比は安静時およびインスリン刺激時の筋血. どが含まれる。特に、内臓脂肪型肥満は皮下脂肪型肥満. 流量ともに相関する。タイプ IIX 線維はタイプ I 線維に. に比べ、これらの慢性疾患とインスリン抵抗性症候群、. 比べ、毛細血管一本あたりの供給面積は 20%-30%ほど広. 代謝性症候群などと強く関連することが指摘されている。. い。これは筋線維のインスリン抵抗性の程度と一致し、. さらに、スリム志向の現代社会にあって、代謝的な異常. 各筋線維のインスリン感受性の違いを反映していると考. の他、肥満者への社会的な偏見とそれに伴う心理的な負. えられている。一般的に、タイプ I 線維の周囲にはより. 担も無視できない。. 多くの毛細血管が存在する。Andersen らの報告によると、. 「肥満； obesity 」という言葉はギリシャ語の. ヒトのタイプ I と IIX 筋線維の平均面積はほぼ同じであ. 「ob-edere」から変化したものである。もともとの意味. るが、筋線維周囲毛細血管数はタイプ I=IIA>IIX の順に. は過食であった。しかし、近代化にともなう座りがちな. なる。. ライフスタイルへの変容による身体活動不足などの要因. ヒトの骨格筋酸化能について、筋サイズで調整した安. も無視できない。すなわち、過食だけではなく、摂取さ. 静時酸素消費量はタイプ II 線維の割合と正の相関を、一. れるカロリーが消費されるカロリーを上回った場合、肥. 方タイプ I 線維の割合と負に相関することが報告された。. 満となる。. 骨格筋酸化系酵素活性はヒトではタイプ I>IIA>IIX の順. 骨格筋でのエネルギー消費は、総エネルギー消費のう. に、ラットでは IIA>IIX>I>IIB の順に高い。解糖系酵素. ち安静時で約 4 割、運動中ではそれ以上の割合を占めて. 活性はヒトでも、ラットでも IIB> IIX>IIA> I の順であ. いることから、骨格筋特性は肥満の発症や進展に影響を. る。介入研究により、骨格筋特性と肥満との関連性につ. 及ぼすことが予想される。骨格筋の中でも、遅筋線維の. いてのより詳細な検討が可能となる。変化しないという. 割合が体脂肪率と負に相関すると報告されて以来、肥満. 報告もあったが、骨格筋酵素（特に酸化系）活性が高脂. と骨格筋特性の関係についての多くの研究が行われてき. 肪食や食事制限により変化するという報告から、摂食エ. た。体重・体脂肪調節に関する介入研究方法は主に 2 つ. ネルギーの変化による体脂肪の変化が骨格筋に影響する. ある。ひとつは食による、もうひとつは運動によるエネ. 可能性が想定される。エネルギーバランスを調節し、脂. ルギーバランス調節に伴う骨格筋の適応を調べることで. 肪の蓄積・減少および骨格筋の変化を観察すれば、骨格. ある。. 筋にある肥満の関連要因を解明できるかもしれない。. 骨格筋は糖と脂肪酸を利用し、エネルギー代謝の大役. 先行研究において、いくつかの異なった研究結果が存. を担っていることから、骨格筋特性は肥満の発症に関連. 在している。これは研究プロトコルの違いに起因すると. していると予測される。これまでに、筋線維組成、毛細. 考えられる。骨格筋の酸化系酵素活性は筋の種類や部位.

(2) により異なる。この点を考慮し、ヒトの研究で用いられ. た筋組織はすぐに液体窒素で凍結し、分析まで-80℃で保. るニードルバイオプシー法ではなく、動物実験で用いら. 存した。切り口はステンレススチール製クリップで閉め. れるオープンバイオプシー法を用いることとした。この. られ、外側広筋に 2.5mg/kg のペニシリンを筋注射した。. 方法は同じ筋の同一部位の組織を採取でき、方法論的に. バイオプシー後の 2 週間は回復期とし、普通餌（成分は. は、より精密的である。また、身体活動は骨格筋を使い、. 12.9%脂肪、26.6%蛋白質、60.5%炭水化物、総エネルギー. エネルギーを消費し、骨格筋の酵素活性にかなり影響す. は 360kcal/100g）を与えた。その後、ラットに高脂肪食. ることから、もう一つの重要な交絡要因となっている。. （40％脂肪）を 5 週間負荷した。高脂肪食は普通餌にラ. 一般的に、ヒトに比べ、せまいケージで飼われる動物の. ードを加え、成分は 39.7%脂肪、18.5%蛋白質、41.9%炭. 身体活動量はコントロールしやすいと考えられる。その. 水化物で、総エネルギーは 439kcal/100g であった。餌と. 他、摂食量に大きい差がないことも重要である。骨格筋. 水とも自由摂取であった。体重と摂食量は 2 日に一回測. 代謝についての検討には、同じレベルのエネルギー摂取. 定した。. という前提は不可欠である。以上のことを考え、本研究. 5 週間の高脂肪食負荷後、12 時間の絶食をさせた体重. では方法論的により精密なプロトコルを実施した。小型. を測定した。その後、50mg/kg のペントバルビタールナ. ケージに 1 匹ずつ飼われたラットを用い、食による体脂. トリウム腹膜内注射で麻酔した。左下肢の腓腹筋、ヒラ. 肪蓄積に対する骨格筋の適応（特に筋酵素活性と筋線維. メ筋、長指伸筋および腹腔内脂肪（腸間膜脂肪、精巣周. 組成）を調べた。体脂肪指標は体重指標よりも重要であ. 囲脂肪、腎臓周囲脂肪）を摘出した。得られた各筋組織. るため、先行研究で用いられた体重変化量の分類基準の. と腹腔内脂肪の重量を測定した。. 代わりに、本研究では腹腔内脂肪量を分類基準として採. 高脂肪食負荷の前後に、同一個体の腓腹筋表層部から. 用した。比較される介入群の間に摂食量の差はなかった。. 採取した筋組織において、先行研究で確定された方法に. 筋組織は同一個体の介入前後に行われたオープンバイオ. 従い、hexokinase （HK）、β-HAD と CS の活性を測った。. プシー法で同じ筋の反対脚の同じ部位から採取されたた. 測定は温度調整可能の 6 連セルホルダー付き UV/Vis 分光. め、組織の比較可能性は保証されている。本研究の目的. 測光器（日本分光 JAS V-530）を用い、30℃で行った。. は、バイアスの少ないプロトコルを用いて、摂食変化に. 測定の変動係数は同一標本での反復測定により算出した. よる腹腔内脂肪の蓄積および減少傾向と骨格筋特性との. ところ、HK は 1.8%、β-HAD は 1.2％、CS は 1.7％であっ. 関連性を検討することである。. た。. 課題 1. 高脂肪食負荷後の腓腹筋の深層部、ヒラメ筋および長. 短期間（5 週間）の高脂肪食による腹腔内脂肪の蓄積. 指伸筋を用いて、ミオシン ATPase の染色度により、Suwa. 傾向と骨格筋の代謝特性、組織化学的特性との関連性を. らの方法で筋線維をタイプ I、IIA、IIX、IIB と IIC に分. 調べること。. 類し、筋線維組成を算出した。腓腹筋の深層部で分析に. 課題 2. 用いた筋線維数は 500 本以上であった。ヒラメ筋と長指. 短期間（4 週間）の食事制限による腹腔内脂肪の減少傾向と血清レプチンおよび骨格筋の代謝適応との関連性を調べること。. 伸筋では横断切片にあるすべての筋線維を数えた。筋毛細血管も ATPase 染色法で染色した。各筋横断切片を室温の環境で、4％ホルムアルデヒドを含む 0.1M リン酸バッファー（pH7.4）で処理した後、pH10.3 のプレ. ２．方法. インキュベーションを行った。その後、筋線維タイプ分. 課題１. 類と同じインキュベーションで処理した。. 被検動物としては、 Wistar 系 10 週齢雄性ラット（n=24）. 統計解析：腹腔内脂肪量（腸間膜、精巣周辺、腎臓周. を用いた。飼育室は 12 時間毎の明暗サイクルで、室温は. 辺）に基づき、腹腔内脂肪が多かったラット. 20℃に設定された。ラットは小型ケージに 1 匹ずつ飼育. （ obesity-prone, OP, n=12 ）と少なかったラット. された。. （obesity-resistant, OR, n=12）の 2 群に分けた。すべ. 実験の手順：1 週間の予備飼育後、ラットの体重を量. てのデータは平均値±標準誤差で表示した。体重、骨格. り、50mg/kg のペントバルビタールナトリウム腹腔内注. 筋酵素活性および酵素活性の比の変化量は二元配置分散. 射で麻酔した。次に、右下肢の外側部を除毛し、70%のエ. 分析により解析した。有意差が認められた場合、Fisher. タノールで消毒した。カミソリで皮膚を 1cm ほど開き、. の PLSD 分析を行った。体重増加量、総エネルギー摂取量、. 腓腹筋表層部から約 100mg の筋組織を採取した。得られ. 筋重量、腹腔内脂肪量、腹腔内脂肪量/体重比、筋酵素活.

(3) 性の変化量、筋線維組成、毛細血管インデックスの比較. 群及び中間群（Medium 群, n=10）に群分した。腹腔内脂. には対応のないｔ-検定を用いた。最終体重と腹腔内脂肪. 肪量が明らかに異なる MF 群、 LF 群と CL 群の 3 群の間に、. との関係は相関分析を用いて相関係数を計算した。全て. 体重、体重減少量、腹腔内脂肪、腹腔内脂肪/体重比、レ. のデータ解析は Statview5.0（SAS Institute, Cary, NC）. プチン、レプチン変化量、骨格筋酵素活性、骨格筋酵素. で行い、統計の有意水準は 5%未満とした。. 活性変化量について、一元配置分散分析を用い解析した。. 課題 2. 有意差が認められた場合、Tukey-Kramer の Post-hoc テ. 被検動物は Wistar 系 15 週齢雄性ラット（n=31）であ. ストを行った。腹腔内脂肪の Medium 群のデータは食事制. った。飼育室は 12 時間毎の明暗サイクルで、室温は 20℃. 限群内の介入前後の比較（対応ある t-検定）に用いられ. に設定された。ラットは小型ケージに 1 匹ずつ飼育され. た。相関分析は腹腔内脂肪の Medium 群を含むすべてのラ. た。. ットで行った。食事制限開始時の相関分析にはすべての. 実験の流れ：1 週間の予備飼育後、ラットの体重を量. ラットのデータを用いた。介入後の相関分析は食事制限. り、50mg/kg のペントバルビタールナトリウム腹腔内注. 群と CL で別々に行った。本実験のすべてのデータは平均. 射で麻酔した。尾部の先端を切断し、約 4ml の血液を採. 値±標準誤差の形で表示した。データ解析は. 集し、圧迫止血した。右下肢の外側部を除毛し、70%のエ. Statview5.0（SAS Institute, Cary, NC）を用い、統計. タノールで消毒した。カミソリで皮膚を 1cm ほど開き、. 的な有意水準は 5%未満とした。. 腓腹筋表層部から約 100mg の筋組織を採取した。得られた筋組織はすぐに液体窒素で凍結し、分析まで-80℃で保. ３．結果. 存した。切り口はステンレススチール製クリップで閉め、. 課題 1. 外側広筋に 2.5mg/kg のペニシリンを筋注射した。バイオ. 高脂肪食負荷後、OP ラットは OR ラットより有意に腹. プシー後の 2 週間は回復期とし、普通餌（成分は 12.9%. 腔内脂肪が多く、体重が重いが、2 群の総エネルギー摂. 脂肪、26.6%蛋白質、60.5%炭水化物、総エネルギーは. 取量には差がなかった。高脂肪食負荷後、OP の骨格筋β. 3.6kcal/g）を与えた。その後、24 匹のラットにベース. -HAD と CS 活性が有意に上がった（図 1）。OR では同じ結. ライン摂食量の 60%の食事制限（18g/d, 64.8kcal/d）を. 果が得られなかった。OP のβ-HAD 活性の変化量は OR よ. 4 週間負荷した。残りの 7 匹のラットはコントロール（CL）. り有意に大きかった（図 2）。脂質代謝の割合を表示する. 群とし、自由摂食させた。水の摂取は 2 群とも自由であ. β-HAD/CS は OP のみに増えた。しかし、骨格筋腺維組成. った。体重は週 1 回測定し、記録した。4 週間の食事制. と毛細血管指標には有意差が認められなかった。. 限負荷後、12 時間の絶食をさせ、50mg/kg のペントバルビタールナトリウム腹腔内注射で麻酔した。尾部の先端を切断し、約 4ml の血液を採集した。バイオプシーの対称部位、すなわち左下肢の腓腹筋表層部の筋組織および腹腔内脂肪（腸間膜脂肪、精巣周囲脂肪、腎臓周囲脂肪）を採取した。得られた筋組織と腹腔内脂肪はそれぞれの重量を測り、記録した。実験前後に採取された血液サンプルから、レプチンは Rat Leptin RIA キット（ Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA）、血糖は YSI 2300STAT 血糖分析器、遊離トリヨードサイロニン（FT3）は Advia Centaur 測定. 図 1．高脂肪負荷前後の酵素（HK、β-HAD、CS）活性。. システム、遊離脂肪酸は Bio Majesty JCA-BM1650 測定器. *は同じ群の高脂肪食負荷前との有意差（p<0.05）を示す。. により分析した。介入前後に、同一個体の腓腹筋表層部から採取した筋. 課題 2. 組織で、HK、β-HAD と CS の活性を測った。測定方法は. 介入によって、制限群の腹腔内脂肪量は普通食群に対し. 課題 1 と同じであった（63-65）。. て有意に低値を示した。また、LF 群と MF 群の腹腔内脂. データの解析：腹腔内脂肪量（腸間膜、精巣周辺、腎臓. 肪量にも有意差が観察された。介入前の骨格筋酵素活性. 周辺）に基づき、食事制限ラットを腹腔内脂肪が多かっ. 及び血清レプチン濃度は LF、MF、CL 群の間に有意差が認. た群（MF 群, n=7）と少なかった群（LF 群, n=7）の 2. められなかった（図 3）。しかし、レプチン濃度とβ-HAD.

(4) ギー過剰と不足により、実験動物の骨格筋酸化系酵素活性が腹腔内脂肪量の変化とともにパラレルに適応することが本研究のデータから明らかとなった。エネルギー摂取の過剰もしくは不足による腹腔内脂肪が多く蓄積もしくは減少したラットは骨格筋酵素活性の変化も大きかった。骨格筋酵素活性におけるこの適応の違いは内臓脂肪型肥満あるいは減量傾向をもつ個体の代謝特徴かもしれない。の現象はレプチンの作用で説明できる。課題 2 で観察された介入後レプチンと骨格筋図 2．高脂肪負荷による筋酵素（HK、β-HAD、CS）活性. 酸化系酵素活性とのパラレルな変化およびレプチンと. の変化量。 *はOP 群とOR 群との有意差（p<0.05）を示す。. 腹腔内脂肪、レプチンと骨格筋酸化系酵素活性との有意な正相関はレプチン関与の仮説を支持している。レ. （図 4A）、CS 活性との間に正相関、一方、HK/β-HAD と. プチンのこの脂肪蓄積への抑制的な作用は生体のエネ. の間に負の相関が認められた。介入後、 LF 群の HK、 β-HAD、. ルギーバランスを維持しようとするポジティブの作用. CS 活性及び血清レプチン濃度は CL 群と比べて有意に低. を果たす。本研究のデータはレプチンと骨格筋酵素活. かった（図 3）。食事制限ラット(n＝21)において、腹腔. 性との関連性についてのはじめての報告である。. 内脂肪量及び血清レプチン濃度とβ-HAD（図 4B）、CS 活. ヒトの研究でも、血中レプチンレベルと骨格筋酸化. 性、β-HAD/CS との間に有意な正相関が認められた。更. 系酵素活性は体重および体脂肪の変化とパラレルに適. に、β-HAD 活性とレプチン濃度の変化量の間にも有意な. 応することが報告されている。したがって、本研究で. 相関が認められた（図 4C）。. 見られた現象はヒトでも起こると考えられる。. ４．考察課題 1 のデータから、骨格筋線維組成および毛細血管形態が肥満傾向の規定要因である仮説は否定された。短期間の HFD 介入による腹腔内脂肪量の多かったラットと少なかったラットの筋線維組成の違いは 3 種類の骨格筋で認められなかった。肥満者で見られた高いタイプ II 線維の割合は肥満傾向の規定要因というより、むしろ肥満とともに生じた変化の結果かもしれない。エネルギー摂取量変化の初期段階において、エネル. 図 3．CL 群、MF 群、LF 群の介入前後の骨格筋酵素活性＊. は食事制限後の CL 群との有意差（p<0.05）を示す。. 図 4．A 介入前全てのラットのレプチンと骨格筋β-HAD 活性との相関（n=28）;B 介入後食事制限ラットのレプチンと骨格筋β-HAD 活性との相関（n=24）;B 食事制限ラットのレプチン及び骨格筋β-HAD 活性の変化量との相関（n=21）.

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