メロキシカムの経口吸収性ならびに物性改善を指向した薬剤学的研究

博士学位

メロキシカムの経口吸収性ならびに物性改善を指向した

楽剤学的研究

文

越智

幹記

摂南大学大学院

楽学研究科

論

略語 ASD AUC BCS C叫 Cm飢 DMSO D50 EPO FT・1R HPC HPMC、AS HPLC MEL NMR NSAID PLM POVA PVP SD rat S.D. S.E. rm獣 UV XRPD

Amorphous solid dispersion

1、rea underthe cuNe ofplasma concentration versus ume Biopharmaceutics classi6Cation system

Equilibrium solubility

Maximum concentration

Dimethylsulfoxide

Median diameter

Eudragit EPO

Fourier transform in丑'ared Hydroxypropyl ce11Ulose

Hydroxypropylmethylce11Ulose acetate succinate H喰h・perfonnance liquid C11romatography Meloxicam

Nuclear ma即etic resonance

Non-steroidal anti・inaammatory dNg Polarized light microscopy

Povacoattype F Polyvinylpynolidone Sprague・Dawleyrat

Standard deviation Standard enor

Time to reach maximum concentration

Ultraviolet

第 1部 緒言 総論の部 第1章溶解性及び経口吸収性を改善したナノ粒子化メロキシカム製剤の開発 1-1-1.月月ミ ... 1-1-2.結果及び考察 ... ポリマーのスクリーニング 1-1-2-1 製剤の調製及び解析 1-1-2-2 溶出試験 1-1-2-3 薬物動態プロファイル 1-1-24 ・3.結論 目次 第2章溶解性及び経口吸収性を改善したアモルファス固体分散体化メロキシカム製剤の開発 1-2-1.背景 1-2-2.結果及び考察 製剤の調製及び物理化学的評価 1-2-2-1 安定性試験 1-2-2-2 製剤中における薬物、ポリマー分子間の相互作用 1-2-2-3 溶出試験 1-2-2-4 薬物動態プロファイル 1-2-2-5 1-2-3.糸吉論 ... ・ 18 ・ 31 ・ 32 ・ 34 第3章総括 第2部実験の音ト ・ 41 ・ 42 謝辞 引用文献

第1部総論の部 緒一 近年,新規に上市される薬物の約40%は難水溶性化合物に分類され,医薬品候補化合物に占める難

水溶性化合物の割合が増加する傾向にある[1,2].そのため,難水溶性化合物の溶解性改善は医薬品開

発において重要な位置づけとなっており,種々の研究が盛んに行われている.代表的な溶解性改善の

手法として,塩形成B・刀,共結晶化岡,微細化[9],複合粒子化(固体分散体化)[10],エマルション化

[1U,自己乳化型製剤化[121及びシクロデキストリン包接[13]などがある.難水溶性薬物は血中濃度の

ばらつきやバイオアベイラビリティが制限されるだけではなく,溶解速度が遅い場合は服薬後の吸収

が遅いというデメリットがある.そのため,服薬後に速やかに薬効が発現することが望ましい鎮痛薬,

睡眠導入薬,鎮咳薬などは溶解速度を改善することが望ましい.そこで本研究ではモデル薬物として

難水溶性の非ステロイド性抗炎症薬(non・steroidalanti・inaan血atory dNg, NSAID)であるメロキシカ

ム(Meloxicam, MEL,Fig.1)を用い,ナノ粒子化及びアモルファス固体分散体(ASD)化による MEL

の経口吸収性の改善について検討を実施した

ChemicalstNct11re ofmeloxicam (MEI")

,1>

S/^

1、

難水溶性薬物であるメロキシカム(Meloxicam, MEL)は非ステロイド性抗炎症薬(non、steroidal

anti・inaa1血atory drug, NSAΦ)に分類され,関節りウマチ[14],骨関節炎[15],術後の鎮痛[16]に使用

されている. MEL はシクロオキシゲナーゼー2(cyclooxygenase・2,CO×・2)を選択的に阻害するため[1刀,

CO×・1及びCO×・2の選択性が低いインドメタシンなどのNSAIDと比較して強い抗炎症作用にもかか

わらず消化管における副作用は弱いという優れた薬理学的性質を持つが, MELは難水溶性であるため

服薬後の吸収に時間を要し,薬効が発現するまで時間がかかるという欠点を持つ. MELはBcsclasSⅡ

に分類されι岡,その溶解度はPH 12およびPH4.0 において約0.6μgmLである四].さらにMEL服用

患者のうち,関節りウマチ及び骨関節炎の患者では気圧の変化やウィルス性疾患の櫂患などに伴う病

態の急性増悪により強い痛みが誘発され,強い痛みによる消化管の運動低下により難水溶性である

MELの吸収は健常人と比較してさらに遅延する[2゜,川.つまり,関節りウマチや骨関節炎などの強い痛

みを抱える患者がMEι服薬後に速やかな薬効を得ることができるようにするためにはMELの溶解性 を改善することが重要である

ナノ粉砕は簡便かつ効果的に溶解速度を改善する手法のつで,低融点薬物[22],イオン化できる

官能基を持たない化合物でも粉砕できるなど,幅広い物性の難水溶性薬物の経口吸収性改善に適用可

能な方法である[23].ナノ粉砕技術を用いた製剤がいくつか上市されているが(Table D,ナノ粉砕物

の粒子径が数百ナノメートルであるため,さらなる改善の余地がある.そこで,本研究ではナノ粒子

化技術をMELに適用して溶解速度及び経口吸収性を改善することを目的とし,各種検討を実施した

Nanocrystal dNgs on the market Table l Brand name Rapamune Emend Tric01 Megace ES Zyprexa Relprevv Invega suste血a Sirolimus Aprepitant Fen0丘brate Megestrol acetate Ola地apine pamoate monohydrate Palipehdone palmitate Generic nalne また, ASD化は数多くの医薬品に適用されている手法のつで,溶解性及び経口吸収性を改善でき る. ASD化は先発医薬品メーカーの結晶形の特許を回避してジェネリック医薬品を開発するために重 Dosageform

要な技術としても注目されている.しかしながら, ASD化による問題のつとして,長期保存時の薬

Oraltablet Oral capsul Oraltablet Oralsolution

物の結晶化がある[24]. ASD 中の薬物の結晶化が起こると,溶出速度の低下が誘発され,その結果経

口吸収性が低下する.したがって, ASD製剤を開発するには長期保存時も安定であることが必須であ

る. ASDの安定化アプローチとして,薬物とポリマー間の相互作用により結晶化を抑制する方法が報

告されている[25・29](Table2). MELの場合には,アルギニン残基を含むタンパク混合物と ASD化す

ることにより安定化することが報告されているBO].医薬品添加物として臨床使用実績のあるポリマ

ーのうち, MELと相互作用できるポリマーを発見することができれば,安定なMELのASDを調製で

Pfizer, hlc

Merck & CO. hlc

Abbottlaboratories, hlc

Par ph飢naceutical, hlc.,

EliLiⅡy and company

Janssen phannaceuuca, hlc Depotinjection Depotinjection Manufacturer

き,速やかに消化管から吸収される MEι製剤の臨床適用への可能性が広がるものと考え,各種検討

を実施した 本研究では, MELの経口吸収性の改善について,ナノ粒子化及びASD化の各アプローチについて

検討を実施した.第 1章ではMEL のナノ粒子化による溶解速度及び経口吸収プロファイル改善効果

について,第2章ではASD化による溶解性及び経口吸収性改善効果について記述する 3

Table 2 _{Stable amorphous solid dispersions} DNg Indomethacin CH ^ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Itraconazole HC-0

1゜゜V゜γく

N.、ノノ

ぐJ ゜

<,リ

Polymer Eudragit E PO CH CH CH [28] 0 Tra11ilast 00 CH

＼/NH ^

^ 0 、 CH 0 0 00 C4H9 Eudragit E PO Stabiliw test 0 0 CH HO CH 0 Nifedipine CH 40゜C/75%NI, 3 months Reference CH n H3C 0 0 Eudragit E PO CH CH3 CH H3C 0 CH3 0 [25] 0 Celecoxib CH 00

.

50゜C 3 months CH3 0 NO 00 CH Eudragit RL CH _CH3 0 CH3

.

、、、、 、ーーー H3C 250C侶0%RH 75 days 40゜C 75%R11, 4Weeks [26] 0 00 CH 00 C4H9 CH CH3 H3C 60゜C 4 Weeks N' PVP 0 CH [29] F [271 0 40゜C 75%RH, 3 months N HC H C ＼ N ノ C H 3 0＼ d H C ＼ 3 H 3 H C ＼ N ノ C H 3 H C ＼ 0 3 HN 0 ノ C H 3 O S O N H FF

第 1 章溶解性及び経口吸収性を改善したナノ粒子化メロキシカム製剤の開発 1-1-1 背景 ナノ粉砕は簡便かつ効果的に溶解速度及び経口吸収性を改善する手法のーつであり,幅広い物性の 薬物に適用可能な方法であるが,課題として保存時に凝集物が増加し,再分散性が低下することが報

告されている[31,32].凝集物の増加は表面積の減少を招き,溶解速度及び経口吸収性を減少させるた

め,ナノ粒子製剤の開発においては適切な分散剤を選択することが重要である.ナノ粒子の凝集抑制 方法として,ナノ粒子表面をポリマーなどの分散剤で覆う方法が報告されており,薬物粒子表面にお いて薬物分子と相互作用することにより吸着したポリマーが凝集抑制に重要な役割を果たしていると

考えられているB3].薬物ナノ粒子表面における相互作用を評価する方法として固体核磁気共鳴法,

ゼータ電位測定などが報告されているがB4,35],ナノ粒子製剤の分散剤を効率的に絞り込むために有

用なスクリーニングはこれまでに報告されていない. chauha11 らは,迅速かつ簡便な評価が可能でオ ートメーションが可能な 96 ウェルプレートを用いた薬物の過飽和溶液におけるポリマーによる結晶

成長阻害作用のスクリーニング(anti・precipita11t スクリーニング)はアモルファス固体分散体(ASD)

の安定なキャリアーのスクリーニングとして有用であることを報告したB6].過飽和溶液で薬物の溶

解濃度を低下するポリマーを用いてASDを調製すると安定なASDが得られた理由として,過飽和溶 液で薬物の結晶成長を阻害するポリマーは薬物の結晶成長に必要な官能基と分子間相互作用している

と考えられるためと考察している.即ち,水溶液中での a11U・precipita11tスクリーニングでMEL の結晶

成長を抑制できるポリマーはナノ粒子粉砕時に薬物粒子表面に露出している官能基と分子間相互作用 すると考えられ,ナノ粒子製剤の分散剤の絞り込みに適用可能であると老えられる

本研究では, MELナノ粒子の分散剤の絞り込みにanti・precipitantスクリーニングB刀を用いて水溶液

中で MEL と分子間相互作用するポリマーを絞り込み,物理化学的に安定で溶解性を改善した MEL

のナノ粒子製剤の開発を目的として種々の検討を実施した.物理化学的性質は,粉末 X 線回折解析

(X・raypowderdif丘action,XND),製剤の長期保存前後の粒度分布測定,酸性条件下における溶出試験

により評価した.以上の検討結果から, mw'Wでの経口吸収性の改善が最も期待できるMELナノ粒

1-1-2 ポリマーのスクリーニング 1-1-2-1 結果及び考察 本研究ではMELのナノ粒子長期保存時の凝集抑制作用を持つ可能性のあるポリマーを絞り込むこ とを目的とし,ポリマーによる MEL の過飽和維持を指標としてスクリーニングを実施した.ナノ粒

子製剤を調製時に使用するポリマーとして代表的な水溶性ポリマーである Eudrag北 EPO, Eudragit ι

100, EudragitRLPO, HPMCAS・LF, HPMCAS・HF, POVACOATTypeF, HPC・SSL, HPC・L, PVPK・30

及びPVPK・90を用いてポリマーの共存下及び非共存下でのろ液中のMEL濃度を Table3に記載した.

また,各ポリマーの構造式をF地.2 に示した.

P01抑ler scree11ing Table 3 Polymer Without polymer Eudragit EPO EudngitL I00 Eudragit RL PO HPMCAS、IF MEldissolved (μgmL) HPMCAS・HF フ.49士 1.86 POVACOATTypeF HPC、SSL 6.69士1.12 Supersaturation (C/C叫) 5.67士0.05 HPC、L 2.79士0.27 PVP K、30 26.2士075 PVP K・90 1.00 0.89 0.76

Ceq: equilibrium solubility. Datarepresent mean士SD (n=3). N.D.: Not detennined.

25.0土3.17 27.1土2.06 Polymer solution PH 392士7.54 037 5.66 40.2士530 3.50 N.D. 103 土 173 334 3.61 Viscosity (da . S) N.D. 79.0士25.9 N.D. 5.23 0.94 6.04 537 N.D. 5.37 Bフ N.D. 6.52 10.5 N.D 6.B 1.09 5.60 1.B 1.08 5.62 フ.05 1.11 1.03 1.14 1.16

(A)

.. CH3 CH3 0 0

(C)

CH3 H3C 0 0 C4H9 N ●尋●

(B)

CH3 CH3 0 CH3 CH3 0 0 CH3 CH3 H3C

(E)

0 0 C2H5

(D)

CH3 CH3 CH3 OH O 0 CH3 0 CH3 0 RO

(G)

Or cH2CH(CH3)OCOCH30r cH2CH(CH3)OCOCH2CH2COOH R=H orcH2CH(OH)CH30r cocH30rcocH2CH2COOH OR OR 0 CH3 HO OR 0 m 0 RO

(F)

0 n CH3 0

H3C

OR

Fig.2. chemicalstNcture of(A) Eudragit EPO,促) Eudra即t L I00,(C) Eudragit N PO,(D) HPMCAS,(E) POVACOATType F,(F) HPC, a11d (G) PVP. 0 RO n

CH3

OR

R=H or cH2CH(OH)CH3

n OR 0 n C + N

ポリマーを添加しなかった場合,ろ液中のMEL濃度は7.49士1.86 μ創mLだった.つまり, DMSO

の溶媒シフト法により過飽和とした場合,わずか一時間で結晶核形成及び結晶成長により飽和溶解度

に近い濃度まで低下した.一方,ろ液中の MEι濃度が飽和溶解度以上の濃度を保っていたウェルは

溶解濃度が高い方からj順に PVPK、30,PVPK、90, HPC、L, HPC、SSL, POVACOATypeF, HPMCAS、LF,

及びHPMCAS・HFを添加したウェルであった.一般的に溶液中での薬物の結晶化プロファイルに影響

する要因として薬物ポリマー相互作用, PH及び粘度があるがB6],各ポリマー共存下での MEL の析

出プロファイルはPH及び粘度と相関していなかった(Table3).また, HPC、SSL と HPC、L, PVPK、30

と PVPK・90 の違いはポリマーの重合度の違いである. HPC、SSL, HPC、L, PVPK、30及びPVPK、90 の

分子量はそれぞれ約 30,000,約 70,000,約40,000及び約 630,000 であり,ポリマーの重合度は結晶核

形成および結晶成長に著しい影響を及ぼさなかったため,ポリマーが MEL の析出に影響する主因は

薬物とポリマー間の相互作用であると推察された. WU らは MEιと同じオキシカム骨格を持つ

Piroxicam の hydroxy基または amide 基の N・H と PVP の Carbony1基が相互作用していることを報告し

ているB8].そのため, MEL でも同様にナノ粒子表面の hydroxy基または amide 基の N、H と PVP の

Carbony1基とが相互作用していると考えられた.また, HPMCAS、LF と HPMCAS、HF の違いはアセチ

ル基とサクシノイル基の比率であり, HPMCAS、LF と HPMCAS、HF のアセチル置換度はそれぞれ 5.0-9.0%及び 10.0-14.0%,サクシノイル基の置換度はそれぞれ 1418%及び48%である.アセチル基

とサクシノイル基の比率は結晶核形成および結晶成長に著しい影響を及ぼさなかったため,これらの

官能基は MEL の結晶形成に関与する官能基とほとんど相互作用していないと考えられた.ポリマー の鎖長が粉砕時のナノ粒子間距離を超えるとナノ粒子間を架橋する頻度が増えて凝集物が増加するこ

とが報告されているためB9],鎖長が短いポリマーのほうがより高濃度で調製しても分子間の架橋に

よる凝集が起こりにくい.また,構成モノマーが同じ場合は重合度の増加に伴い粘度も増加するため,

重合度が低く鎖長が短いポリマーの方がナノ粒子の生産性に優れる.以上の結果から, MELのナノ粒

子製剤はPVPK・30, HPC・SSι及びPOVACOATTypeF を用いて調製し,調製したナノ粒子製剤をそれ

ぞれMEL/PVP, MEL/HPC及びMEL/POVA と表記した

1-1・2-2 製剤の調製及び解析

自転公転ミキサーNP・100(株式会社シンキー,東京都)により MEL をナノ粒子化した. NP、100 を用

いたナノ粒子化は粉砕の所要時間が数分と非常に短く,mgスケールから数百gオーダーまでスケール

アップできるというメリットを持っ[40].レーザー回折法により測定した未粉砕の原薬のMEL及び粉

砕一凍結乾燥後のナノ粒子製剤の粒度分布をFig.3およびTable4に示した.測定用サンプルは転倒混

和により蒸留水に懸濁させ,超音波による分散は行わなかった ( 1) (11) (111) (M 0.01 0.1

Fig.3. size distribution of NIEI" samples in water, as detennined by laser di丘'raction method.(a) a丑er

PreP町ation and (b) a丑er 60゜C,21 days.(1) MEL/PVP, qD MEL/HPC,(ⅡD MEL/POVA, and (1V) unpulverized

MEL Size (μm) 10 ( 1) 100 (11) (川 (M 0.01 0.1 Size(μm) 10 100

)

b >U仁ΦコずΦ﹂﹄Σ一m仁Φ一仁一でΦN仁円EOZ

(

)

a >0仁ΦコずΦ﹂﹄Σ一の仁Φ一三でΦN冒mEOZ

(

Table 4 Physicochemicalpropedies ofMELnanocrystalformulations

Poly111er scree11iπg

Supersaturation number(C/ceq)

Particle S1乞e distri6Uti0π

SO011 qflerpreparah'011 D50 (μm)

D90(叩)

Speci丘C surface area (m2/g)

冱jler 60゜C 21days D50 (μm) D90 (μm)

Speci丘C surface area (m2/g)

XRPD Crysta11i11iw UnpulverizedMEι 1.00

粒度分布測定の結果,未粉砕のMEL原薬の体積累積中位径Φ5のはB.1叩,SPANファクターは

PVP B.1 33.0 0.67

2.19 であった.ナノ粉砕により, MEL/PVP, MEL/HPC 及びMEL/POVA の D50 はそれぞれ 119,117

Nα110clystaljbr111U1αti011 Bフ4

及び 111 血, SPAN ファクターはそれぞれ 1.29,1.01及び 135 となり,均なナノ粒子が得られた.

HPC

また粒子径の減少により比表面積は著しく増加し, MEL/PVP, MEL旧PC及びMEUPOVAの比表面積

はそれぞれ7フ.6,78.1及び94.0倍増加した.ナノ粒子製剤の物理化学的性質をさらに解析するために

XRPD解析を実施した.未粉砕のMELのXNDパターンはMEι結晶の最安定形である無水1型(f0血

0.H9 0226 52.0 523 POVA form l 0.117 0.195 523 0.123 0.248 50.6 3.61

D のXRPDパターンと致した.同様の回折パターンがMEUPVP, MEL/HPC及びMEL/POVAでも

認められ,ナノ粉砕後のMEL も無水1型の結晶を維持していた(Fig.4).

0.111 0208 63.0 0.B2 1.25 47.4 fonn l fom11 5.31 22.5 1.48 form l

ωMEUPⅧ

15

10 20 25 30 35

2・theta

Fig.4. X・ray powder dif丘action pattems ofMEL samples.(D MEL/PVP,(1D MEL/HPC,(1Π) MELΦOVA, and (1V) unpulverized MEL

(11) MEUHPC (Ⅲ) MEUPOVA (M unpulverized

そこで,製剤の保存安定性を試験するために60OCで21日間製剤を保存し,1山n以上のミクロンサイ

ズの凝集物の増加および比表面積の減少によりナノ粒子製剤の溶解性は低下するため[4U,保存後の

粒度分布測定により物理化学的性質を評価した.保存後の粒度分布測定の結果,60OCで21日間保存 ることにより結晶成長を抑制できるポリマーはナノ粒子製剤長期保存時の再分散性低下を抑制できた また, MEレHPC及びMEL/POVA懸濁液中のミクロンサイズの粒子はボルテックスミキサーによる撹 製剤が物理化学的に長期にわたって安定であることは臨床使用のために必須な性質である 後の MEしHPC及びMEL/POVAの比表面積は保存前と比較してそれぞれ9.37%及び97.フ%減少した 集によるものと考えられた 方, MELΦVPでは比表面積の減少率はわずか2.69%となり,過飽和水溶液中でMELと相互作用す 枠ではほとんど減少しなかったが,強力な超音波処理により解砕したため,粗大粒子の増加は主に凝

ポリマーによる再分散性改善のメカニズムとして,圧縮されたポリマー鎖が安定状態に広がろうと

して働く斥力とポリマー鎖の相互侵入によりポリマーが密になることによる浸透圧が関与すると考え

られている.そのため MEL/PVP の再分散性が良かった理由として, anti、precipitantスクリーニングで

MEL過飽和溶液の経時的な濃度低下を最も抑制したPVPはMELナノ粒子表面においてもMEL分子 と相互作用でき, MEL ナノ粒子表面に吸着したためと考えられた

クリーニングにはいくつかの制約がある.薬物の特定の結晶形の結晶成長を抑制したとしても溶液中

で他の結晶形が生成し,薬物分子間相互作用の形式が異なる場合は結晶成長を抑制できない可能性が

考えられる[42,43].この点については異なる結晶多形間では結晶核形成速度と結晶成長速度が異なる

挙動となるため,a爪i・precipit釦tスクリーニングと析出物の結晶形の解析を組み合わせることで誤った

判断を防ぐことができる.さらに,界面活性作用により薬物の溶解度が高くなれば,薬物ポリマー間

の相互作用を過大評価してしまう可能性があるため,界面活性作用のあるホリマーを anu、precipita11t

スクリーニングに適用するには制約がある.また,薬物の溶解度が PH により著しく変化するとき,

ポリマー溶解前後のPHの変化に溶解度が影響される可能性がある.PHの変化に大きく影響される薬

物を用いるときは緩衝液などを使用して,PHの変動を最小限に抑えることが誤った判断を最小限にす

るために必要だと考えられる.ナノ粒子製剤の分散剤として必要なポリマーの性質については明らか

しかしながら, anu・precipi仏nt ス

になっていない部分もあり,薬物個別の検討が必要だと考えられるが,薬物の過飽和水溶液中での結

晶成長を抑制できないポリマーは薬物分子との分子間相互作用が弱い,もしくはないと考えられる

薬物分子との分子間相互作用が弱いポリマーはナノ粒子表面における吸着も弱く,ナノ粒子表面にお

いては隣り合うポリマー鎖の立体障害による斥力があるため,薬物とポリマー間の相互作用が強いポ

リマーと比較してナノ粒子表面への吸着量が相対的に少ないと老えられる.ナノ粒子表面へのポリマ

ーの吸着量が多いほど,ナノ粒子が水和した時に圧縮されたポリマー鎖が安定状態に広がろうとして 働く斥力とポリマー鎖の相互侵入によりポリマーが密になることによる浸透圧による斥力が大きくな

り,ナノ粒子の再分散性が良くなる.したがって anti・precipita11t スクリーニングは再分散性が良いナ

ノ粒子を調製できるポリマーの絞り込みに有用だと考えられた 溶出試験 1-1-2-3 MEL 服用後の速やかな薬効発現のためには溶解性は最も重要なファクターであると考えられる

しかしながら,未粉砕のMEιは酸性溶液である溶出試験第1液(PH 12)への溶解が著しく遅く,溶

出試験開始後120分におけるMEι濃度はわずか0.065μ創mLであった.方,すべてのナノ粒子製剤

の溶解プロファイルは著しく改善し,溶出試験開始7.5分後のMELΦVP, MEL旧PC及びMELΦOVA

の MEL濃度はそれぞれ 1.50,1.71及び272μgmL となった(F喰.5).また,溶出試験第2液(PH6.8)に

おいても未粉砕のMELは溶解速度が遅く,溶出試験開始後240分におけるMEL濃度は7.76μgmLで

あったが,全てのナノ粒子製剤では溶出試験開始後15分において約100%が溶解した.以上の溶出試 験結果と物理化学的性質を総合的に考慮した結果,今回検討した MEL 製剤の中で安定性と物理化学 的性質に優れるMEL炉VPについて加νiv0試験を実施した

(A)

20 15 10 5 0 0.0

(B)

Fig.5. Dissolution promes ofMEL samples in (A) PH I.2 mediumand (B) PH 6.8 medium.0, MEL/PVP;ロ, MEL/HPC;△, MEL/POVAand ゞ, unpulverized MEL. Eachbarrepresents mean土S.D.(π=3).

125 1.0 (h) Time 100 1-1-2-4 薬物動態プロファイル 75

Amidon らによる Bcsclassificationsystem(BCS)によれば, MEL は溶解性が低く,膜透過性が高い

ため BcsclasSⅡに分類されるn',W.般的にBcsclasSⅡの薬物は溶解速度律速で,溶解速度の上昇

がbioavailabiliW の上昇にっながる[心]. h1νiか0 で著しい溶解速度の改善を示した MEL/PVP がiπνiv0 で

も吸収改善作用を示すのか,ラットに経口投与後の血奬中濃度推移を測定することにより検証した 50 2.0 25 0 0

Fig.6にラットにMELΦVP及び未粉砕のMEιの懸濁液を経口投与したときの血奬中MEL濃度推移を

示した.また,そのときの薬物動態パラメータである C伽知 r血知 AUC皿及びAUC。_.をTable5 に示

2 Time (h) した. (一邸一0一﹄00＼0)でΦ>-0のの一で]山Σ '■ (一邸一0-、00＼0)でΦ>-0の仂一で"山Σ

3

2

e 会

Fig.6. plasma MEL concentration・time pr0丘les in rats a丘er oral administrauon of MEL samples.0,

MELΦVP; and *, unpulverized MEL (1.o mg・MEL/kg body weight). Each bar represents mean土S.D

(π=34).

゛

0 0

Table 5 Pharmacokinetic parameters ofpvpn、,1EL f0110wing oral administration in rats ゛ 4

Time (h)

Cm缺(μg/mL) r血,(h) AUCO_8(μg wmL)

Cmax: maximum concen杠'ation; rmax: time to maximum concentration; AUC: area under the cuNe of plasma

MEL concentration vs. time 丘'om o to t h a丑er oral administration. Data represent mean士 S.D.(π=4).***Pく 0.001,**Pく 0.ol and *Pく 0.05 With respectto contr01(unpulvedzed MEL).

Unpulverized MEL

未粉砕のMELをラットに経口投与後に血奬中MEL濃度は緩やかに上昇し, r卿が2.67hのときに

Cm獣は0.43μg/mL となった.方, MEL/PVPの懸濁液を経口投与後の血奬中MEL濃度は経口投与後

速やかに上昇し, MEL/PVPのC伽,は未粉砕のMEL を経口投与後と比較して6.7倍増加し, rm臥は2.0

16 0.43 土0.10 2.67士 1.15 2.21 土0.50 2.87士0.62 ** 0.63士025 * 1121土297 ** PvpnYIEL ●X コ兵ヨ)"山Σ円E器区

時間短縮した.りウマチや骨関節炎を櫂患している患者では,気圧の変動や気温の急激な変化,ウィ

ルス性疾患の櫂患などに伴って病態の急激な悪化が起こる.そのため,関節りウマチに適応を持つ

MELを服薬後に薬剤が可能な限り速やかに吸収されて,速やかに薬効を発現することは大きなメリッ トである. NSAIDの溶解性改善による薬理効果の速やかな発現を目的とした研究として,イブプロフ

エンと比較して速やかな溶出プロファイルを示すイブプロフェエンナトリウム2水和物の研究報告が

ある[伺.抜歯後の患者は痛みによる消化管の蟠動運動低下によりイブプロフェンの吸収が遅延する傾

向にあったが,溶解が速やかなイブプロフェエンナトリウム2水和物を投与後の患者では吸収遅延が

抑制された. NladiらはMELの治療効果を改善するために,親油性の界面活性剤である Gelucire44n4

を用いて速やかに溶解する製剤を調製した叩].我々の結果と同様にMELの溶解性の改善が認められ,

抗炎症作用も経口投与後速やかに得られていた.しかしながら,ヒト大腸カルシノーマ細胞である

Caco-2 細胞を Gelucire44/14 で処置すると細胞生存率の低下と P、糖タンパクの活性低下が認められ

るため[48],長期間服用することがある MEL 製剤に使用することは望ましくない.方, PVP K、30

は添加物として長年臨床使用されており,PVPK、30の安全性は確立されているため,溶解プロファイ

ル,薬物動態プロファイル及び添加物の安全性を総合的に考慮すると, MELΦVPは安全性の高い治療

と速やかな薬効発現の両立に貢献できると考えられた

1-1-3

本研究においては,迅速かつ簡便な anti・precipitant スクリーニングを用いてナノ粒子製剤を安定化

させるポリマーを絞り込み,湿式粉砕により調製した 3 種類の MELナノ粒子製剤の物理化学的性質

を評価した.3種類のMEιナノ粒子製剤の溶解プロファイルはいずれも著しく改善したが,MELΦVP,

結論 MEUPOVA においては保存後に凝集物の増加が認められた. MEUPVP においては保存後も凝集物の 増加はほとんどなく,過飽和溶液において過飽和を維持するポリマーはナノ粒子製剤保存時の凝集を

抑制できる傾向にあった. MELΦVPの懸濁液をラットに経口投与した結果,未粉砕のMEL懸濁液と

比較して吸収が速やかになり, AUCも増加した.これらの結果から,ナノ粒子化のアプローチは関節

リウマチや骨関節炎の患者における MEL の経口吸収性改善及び速やかな薬効発現に有効なアプロー チであると考えられた

第2章溶解性及び経口吸収性を改善したアモルファス固体分散体化ME工製剤の発

1-2-1

アモルファス固体分散体(ASD)化技術は難水溶性薬物の溶解性および経口吸収性の改善のために

最も使用される手法のーつである[10].しかしながら, ASD 化による問題のーつとして,長期保存時

のアモルファスの結晶化がある[24]. ASD 化により,薬物の自由エネルギーが増加するため,結晶核

形成と結晶成長が起こることが報告されている[判. ASD中の薬物の結晶化が起こると,溶解速度の低

月方ミ 下が誘発され,経口吸収性が低下する.したがって, ASDの安定化は確実な治療のために必須な要素

である.溶解性を改善したMELのASDについては複数報告されているが[5゜,町, ASD開発において最

も重要である長期保存時の安定性を確認した薬物とポリマーの二成分系の ASD はこれまでに報告さ

れていない. Noolkar らはmor血gacoagulant と PVPK・30 を用いて安定なMEL の ASD を調製できるこ

とを報告し[5刀,同じ研究グループのBhende らはMEL と mor血gacoagulant 中のいずれかの分子のアル

ギニン残基がアモルファスの安定化に寄与していることを報告しているB01.しかしながら, morin部

Coaguantはmorin部 SeedSの水溶性抽出物の混合物で分子量が6-12 ゆaで等電点が 10からⅡの分子

を含み, ASDの安定化に必要な分子の含有量は明らかになっていない.したがって,臨床使用できる

医薬品添加物を用いてMEI"のASDを調製できれば, ASDの安定化メカニズムのさらなる解明と溶解

性を改善したASDの臨床適用可能性の拡大に貢献できる アモルファス薬物の安定化に関与するメカニズムのーつとして薬物ポリマー間の相互作用が報告

されており,薬物とポリマーの相互作用により薬物のアモルファス状態が安定化することが報告され

ている邸,瑚.薬物分子間での相互作用は薬物の結晶核形成および結晶成長に必須であるため,薬物の

結晶核形成及び結晶成長に必要な官能基とポリマーの官能基が相互作用することにより薬物分子間の

相互作用を阻害すれば,結晶核形成及び結晶成長が抑制される 以上の背景から長期保存時も物理化学的に安定で経口投与後に速やかに薬効が発現するASD の開

発を目的として,種々の検討を実施した.物理化学的性質は偏光顕微鏡観察(polarizedlightmicrosC叩y

PLM),製剤を長期保存前後の粉末X線回折解析(X・皿ypowderdi缶action,XRPD),フーリエ変換赤外

分光法(Fourier住ansfonnin丘'ared(FT・1R)spectralanalysis)を用いて解析し,分子間相互作用が長期保存

時のASDの安定化に及ぼす影響を評価した.また,溶出試験により溶解性を評価し,物理化学的性質

の評価及び溶解性の評価から,加νiv0試験を実施するASDを選択し,ラットに経口投与後の薬物動態

推移を測定した 20

結果及び考察 1-2.2

1-2-2-1 製剤の調製及び物理化学的評価

ASD の調製に使用される代表的なポリマーである PVPK、30, HPC、SSL,またはEudragitEP0 を用

いてMELのASD を調製し,得られた製剤をそれぞれMEL/PVP, MEL征IPC及びMEL促P0 とした.

各サンプル中のMELのアモルファス化を粉末X線回折により確認した.L昭erら及びCoppiらはMEL

の無水物の結晶には5つの結晶多形があることが報告している化肌olfom,ルZW世erionsf0血,Ⅱ1,Ⅳ

及び V)曄,56].原薬のCwstaⅡineMELの粉末X線回折パターンは最安定形である無水1型の結晶に特

徴的な回折パターンと同じだったことから[56],原薬の結晶形は無水1型であると考えられた(Fig.フ).

MEL/EP0の回折パターンはハロパターンとなり,無水1型に特徴的な回折パターン及びその他の結晶

型に特徴的なピークは認められなかったため,MEL/EP0中のMELはアモルファス化していた.一方,

MELΦVP及びMEUHPCでは無水1型結晶と同じ位置にわずかにピークが認められたが,ASD調製直

25 後は大部分のMELがアモルファス化していると考えられた. (1) MEUP四 (") MEUHPC

F地.フ. physicochemical characterization of MEL formulation using x・ray powder di缶action soon a丘er

Preparation. a) MEι/PVP,(1D MEL/HPC,(11D MEL/EPO, and (1V) crysta11ine MEL.

(Ⅲ) MEUEPO

(M crysta11ine

5 10 15 20

川

川1)

^

Fig.8. Morph010gical obseNation of MEL S如Ples using the poladzed light microscopy.(1) MEL/PVP,(1D

MEL/HPC,σ11) MEL/EPO,笹ld (1V) crysta11ine MEL

(川

次に, XRPDよりも高感度で結晶を検出できる偏光顕微鏡観察を実施した(F地.8).偏光顕微鏡画像で

もMEL/PVP及びMEL/HPC 中にわずかに結晶が認められ, MEL/EP0中にはほとんど結晶は認められ

(1V)

なかった. 安定性試験 1-2-2-2 保存時の安定性は ASD の開発で最もネックとなる項目である.本研究では固体状態での安定性を 評価するため,各ASD を40゜C/50%臨または40゜C/75%臨で30日保存後のXNDパターンを測定し た. MEL促P0は40゜C/50%臨で30日間保存後もハロハターンを示し,無水1型に特徴的なX線回折

パターン及びその他の結晶型に特徴的なピークは認められなかった.一方, MELΦVP及びMEUHPC

では40゜C/50%臨で30日間保存後に無水1型に特徴的なシャープなピークが認められ,保存時にMEι

22

(a)

(1)ハモUP炉 (11)八征UHPC (Ⅲ)八促UEPO (M CMta11ine 5

Fig.9. physicochemical charactedzation of MEL formulation using x・ray powder dif丑'action a丑er storage at

(a) 40゜C/50%臨 for30 daysand (b) 40゜C/75%臨 for30 days.Φ MEL/PVP,σD MEL/HPC,σⅡ) MEL/EPO, and (1V) cwsta11ine MEI,.

10 15

(b)

20 2・theta

の結晶化が起こっていることが示唆された(F地.9B・1及びⅡ). MEL/EP0 は40OC/75%朗で30日間保

存後もハロパターンを示し,無水1型に特徴的なX線回折パターン及びその他の結晶型に特徴的なピ

ークは認められなかった岡(Fig.9B).以上の結果より,調製した 3 つのASD製剤のうち, MEL/EPO

が物理化学的に最も安定性に優れるASDであると考えられた. 25 (Ⅲ)A正UEPO 30 35 (M crysta11ine 5 10 1-2-2-3 製剤中における薬物/ポリマー分子間の相互作用 15 20 2・theta

EudragitEPO, PVPK・30及びHPC・SSL と MEιの分子間相互作用を評価するため,'HNMR解析を

実施した(Fig.1の. MELのプロトンシグナルはHPC・SSL及びPVPK、30 により高磁場及び低磁場への

シフトはせず,相互作用は認められなかった.一方, Eudragit EP0 はMEL の tMazole基の H、4'及び

ベンゼン環の H・8, H・9, H・10及びN・methy1基である H、B のプロトンシグナルを高磁場シフトさせ,

MEL と EudragitEP0の分子間相互作用により電子密度が変化したことが示唆された.さらにASD 中

の薬物とポリマー間の分子間相互作用を解析するためにFT、1Rを実施した(F地.Ⅱ).

23

。ノ゜ ゜,j>

8^/N＼ H フ,、、

(D)

H・フ H、8, H、9, H、10

(C)

旧)

H4'

(A)

H・13 DMSO

Fig.10.噴 NMR spectra ofMEL with or W北hout hydrophilic p01川ers in d'・DMSO. FU11SpectNm of(A)

MEL,(B) MEL with HPC・SSL,(C) MEL with pvp K・30, and (D) MEL with Eudrag北 EPO. supramolecular Chains of MEL in crystalHne form l sustained by sulfonyl・amide dimers and sulfathiazole・alcoh01

[57] Supramolecular synthons 8.0 H・6' フ.0 3.0 フ.5

Chemical shi貴(ppm)

無水1型結晶である原薬のFT・1R解析の結果,無水1型結晶中の薬物分子間相互作用に関与してい

る amideⅡ, sulphone及びt面azole に由来するバンドがそれぞれ B50,1530 及び 1550cm、'に認められ

た[581. MEL と HPC、SSL 及びPVP K、30 との ASD である MEL/HPC 及びMEL/PVP 中では amide n,

Sulphone及びt面azoleに由来するバンドの著しいシフトは認められなかった.方,MELとEudragitEPO

2,5 2.0

とのASDである MEι促P0 ではamideⅡ,SUゆhone及びthiazole に由来するピークの低波長シフトカ靖忍

められた. MEL と Eudragit EPO, HPC・SSL 及び PVP K、30 の物理混合物では amide n, sulphone 及び

thiazoleに由来するピークの著しいシフトは認められなかった. FT、1R解析及び噴、NMR解析の結果,

40゜a75%臨で4週間保存後もMELの結晶化が認められなかったMEL促P0中ではMELとEP0が相

互作用しており,MELとEP0の分子間相互作用がMEι促P0の安定化に寄与していることが示唆され

た.方,40゜C/50%噸で4週間保存後にMELの結晶化が認められたMEL炉VP及びMEL/HPCでは

FT・1R解析及び'H・NMR解析の結果ともに著しいピークシフトは認められず, MELとの分子間相互作

用が弱いためMELの結晶化を抑制できなかったと考えられた. (1) aysta11ine A后_ UI)ト^^ .^^^^、

Vvavenumber(cm、1)

Fig. H. Baseline・conected and n0血alized peak ofamide 11, sulphone 雛ld thiazole in (D cwstaⅡine MEL,(1D

MEL/EPO, qn) MEL/HPC, and (1V) MEL/PVP. solid line, ASD fonnulation; broken line, physical miX加re

OfMEL and hydrophilic polymers. (111)ト但/H叱 、 、 、 、J 、ーー .ーーーー 1300 .、. (Ⅳ)畑、/A/P J 〆 ψ、ー、 、 、' 、J J 、 1600 、ー、 " ' J ノ' J i 、 、 1500 、 、 、 ゛ 邑 、ーー、、、 1400 25 、J 〆 /J 、、 、、 、 、 、 J i 、 、 、、 、、

MEL促P0中のMELの含有率がASD中の薬物の結晶化に与える影響について精査するため, MEL

含有比率を 25,50及び67%に変えて, FT・1R解析を実施した(Fig.12). MEL の比率が67%のとき,

無水1型結晶中のamide Ⅱ及びthiazoleのピークと同じ波長にバンドカ荒忍められたが, MELの比率が

50%以下のとき,無水1型結晶に由来する amide Ⅱ, sulphone及びthiazole のバンドのシフトカ電忍めら

れ,これらの官能基の電子密度がポリマーとの相互作用により変化したと考えられた. ME工の無水1

型結晶中で MEL は分子間で Sulfonyl・amide 二量体を形成し,二量体同士が SulfatMazole、alcoh01 相互作

用をしている[57].したがって, PKa が低い MEL の hydroxy 基(PKa l.D と Eudra即t EP0 の

dimethylaminoethy1 基(PKa lo.0)力誹H互作用し, MEL の無水 1 型結晶形成に必要な Sulfat面azole・alcoh01

相互作用を阻害することにより MELの結晶成長は抑制されたと考えられた Sta11ine 八旧_ (") Me = 67:33 (川= 三'●= 50:50 26 1500 1600 1400 1300

Vvavenumber(cm、1)

Fig.12. FT・1R spectra of MEL samples. Baseline・conected and n0血alized peaks of amide 11, sulphone and thiazole 血Φ Crysta11ine MEL,(1D MEL/EPO (67:33),(111) MEL/EPO (50:5の, av) MEL/EPO (25:75),砥ld (V) Eudragit EPO

(Ⅳ) Ma:E円=25:フ

(V) E円

薬物の結晶化のためには薬物分子間の相互作用が必須であるため,ポリマーが薬物の結晶化に必要

な官能基と相互作用することにより薬物分子間の相互作用を抑制すれば,結晶の成長を抑制できると

考えられる. Bh伽de らの報告でも,アモルファス薬物の結晶化速度を遅らせる要因として薬物分子

とポリマーとの相互作用が重要なファクターであると考察されており[30],1ndomethacinの結晶形成

に必要な官能基である Carboxy1基と Eudragit EP0 の dimethylaminoethy1基の相互作用により結晶化

が抑制されたことが報告されている口5}

1-2-2-4溶出試験

原薬である結晶のMEL及びMELを25%含有した各ASDの日本薬局方溶出試験第1液(PH12)にお

ける溶解性を評価した(Fig.13).原薬の CrystaⅡineMEL は緩徐に溶解し,溶出試験開始30分における

溶解 MEL 濃度はわずかに 0.027士0.0侃%であった.方,すべての ASD 製剤は CwstaⅡine MEL と比

較して溶解挙動が著しく改善し,溶出試験開始30分後におけるMEL/PVP, MEL征IPC及びMEL促PO

の溶解MEL濃度はそれぞれ3.04士1.12,8.65士1.35 及び78.1士6.56%だった. MEL は酸性条件におい

ては極めて溶解速度が遅いが,弱酸性から中性にかけて溶解速度及び溶解度が増加する.そのため,

EP0とアモルファス化することによる溶解性向上はホリマーの濡れ性及び薬物の結晶化度のみならず,

固体表面近傍において溶解したEP0によるPH緩衝効果が寄与した可能性が考えられる.

100 75 0.5 1.0 1.5 2.0

Time (h)

Fig. B. Dissolution pr0負les ofMELsamplesin pH I.2 medium.0, MEL/PVP;ロ, MEL/1WC;△ MEL/EPO; ▲, physical mixture of MEL and EPO; and x, crysta11ine MEL. Each bar represents mean士S.E. of 3 independent experiments 50 ' 25 0 0.0 ^ 固 哩 ヨ 28 会 (一価一0一↑00＼0)でΦ>-0のの一で"山Σ

日本薬局方溶出試験第1液(PH12)において最も溶解性に優れていたMEL/EP0は日本薬局方溶出

試験第2液においても著しく溶解性が改善した(Fig.14).調製したASDのうち, MEレEP0が最も溶

解性と物理化学的安定性に優れていたため,ラットに経口投与後の薬物動態を評価した.

120 100 80 60 40 0.5 1.0 1.5 2.0

Time (h)

Dissolution profiles of MEL samples in pH 6.8 medium.△, MEL/EPO; and x, crystaⅡine Each barrepresents mean士S.E. of3 independent experiments

' Fig.14 MEL 20 ^ 0 0.0 29 (一邸一0-、00＼0)でΦ>-0のの一で"山Σ 'r

1-2-2-5 薬物動態プロファイル

ラットに Crysta11ine MEL及びMEL促PO (1.o mg・MELA【g)を経口投与後の血奬中濃度プロファイル

を Fig.15 に示し, C如知 AUC。_8などの薬物動態パラメータを Table 6 にまとめた.経口投与後に MEL

の血奬中濃度はゆるやかに上昇し,C,献は0.43士0.10μ創mL となった.方,溶解性に優れる MEL促PO

を経口投与後は血奬中濃度の立ち上がりが速くなり, C脚,は 1.06士0.003 μ創mL となった. MEL/EPO

の C,飢及びAUC。_8はCrystaⅡineMEL と比較し,それぞれ2.5 倍及び2.3 倍高値となった

1.25 1.00 0.75 050

Fig.15. plasma MEL concentrations in rats a丘er oral administration ofMEL formulation. and o, MEL/EPO (1 mg・MEL/kg). Data represent mea11士S.E. of3 experiments.

.

戸

0.25

Table 6 Pharmacohnetic parame ers ofMEL疋Po f0110wing oraladministration 血 rats 0.00 ^ 0 C血,(μg/mL) r血,(h) AUCO_8(μgwmL) 4

Time (h)

Cmax: maximum concentrauon; AUC: area underthe cuNe ofplasma MEL concentration vs.time 丘'om o to t h a負er oral administration. Data represent mean士S.D.(れ= 3).***Pく 0.ool and *Pく 0.05 With respect to Contr01(crysta11ine MEL). . Crysta11ine MEI 0.43 士0.10 2.67土 1.15 221士0.50 X, crystaline MEL; MEL/EPO 1.06土0.00 233士 1.53 520士 1.37 * *** 30 令 コ長豊二山Σ邸E袷区

1.2.3 結論

本研究では3つのASDを調製し,物理化学的性質を評価した.調製した全てのASDでPH12の酸

性溶液での著しい溶解性の改善が認められ,特に MEL/EP0 で最も溶解速度が改善し,過飽和に達し

た.また, MEL恒P0 は40゜C/75%臨で30日間保存後に結晶化が認められず, ASDの欠点である長期 保存時の薬物の結晶化を抑制できた. MEL/EP0をラットに経口投与後のMEιの血奬中濃度の立ち上

がりは原薬のMEL と比較して改善した.しかしながら,第 1章のMELナノ粒子製剤(MEL/PVP)と

比較すると AUC。_8が50%以下と低かった. MEL/EP0 は酸性溶液中ではナノ粒子製剤の MELΦVP よ

りも溶解性に優れるが,中性溶液中ではナノ粒子製剤のMELΦVPの溶解性がMEUEP0よりも優れて

いたため,中性溶液中での溶解性の差がAUCNの差につながったと考えられた

Kawabata らは酸性薬物である tra11ilast と Eudragit EP0 のASDが酸性溶液における溶解性を著しく

改善し,安定性に優れていたことを報告している【59]. ME工は酸性のHydroxy基と塩基性のtMazole基

をあわせ持つ薬物であり,酸性と塩基性の官能基を併せ持つ化合物は薬物分子間の相互作用が強いた

め結晶化が起こりやすいが, MEL の塩基性のthiazole基(PKa=4.2)よりも高い PKa を持っ EudragitEPO

の dimethylaminoethy1基(PKa=10.のが相互作用することにより ASD を安定化することができた.その

ため, Eudrag北EP0によるASD安定化のアプローチは酸性薬物のみならず,酸性と塩基性の官能基を

第3章総括 近年,新規に上市される医薬品化合物の約40%は難水溶性化合物に分類され,ハイスループットス クリーニングで得られた医薬品候補化合物に占める難水溶性化合物の割合は増加傾向にあるため,難 水溶性化合物の溶解性改善は医薬品開発において重要な位置づけとなっており,種々のアプローチが 盛んに研究されている 第 1章ではMELのナノ粒子化による経口吸収性改善を目的として各種検討を実施した.迅速かつ

簡便な anti・precipitant スクリーニングを用いてナノ粒子製剤の凝集を抑制するポリマーを絞り込み,

湿式粉砕により調製した3種類のMELナノ粒子製剤の物理化学的性質を評価した.結果として,3種

類のMELナノ粒子製剤の溶解プロファイルはいずれも著しく改善したが, MELΦVP, MEL/POVAに

おいては保存時に凝集物の増加が認められた. MELΦVPは保存後も凝集物はほとんどなく,過飽和溶 液において過飽和を維持するポリマーはナノ粒子製剤を保存時の凝集を抑制できる傾向にあった MELΦVPの懸濁液をラットに経口投与した結果,末粉砕のMEL懸濁液と比較して吸収が速やかにな り, AUC も増加した.これらの結果から,ナノ粒子化による MELの物性改善は速やかな薬効発現に 有効なアプローチであると考えられた 第2章ではMELのアモルファス固体分散体化によるラット経口吸収性改善を目的として各種検討

を実施した.フーリエ変換赤外分光光度計(FT・1R)解析及びプロトン核磁気共鳴分光法 CH、NMR)解

析の結果, MEL/EP0では相互作用によるピークシフトが認められ, ASD 中のMEL と EP0が相互作

用していることが示唆された.方,PVP及びHPCではFT、1R及び'H、NMR ともに著しいピークシフ

トは認められず,40OC/75% N1で4週間保存後もMEL疋P0は結晶化が認められなかったことから,

MELとEP0分子間相互作用がMEL/EP0の安定化に寄与していることが示唆された.溶出試験の結果,

調製した全てのASDでPHI.2の酸性溶液での著しい溶解性の改善が認められ,特にMEL/EP0で最も

溶解プロファイルが改善した. MEレEP0をラットに経口投与後のMELの血柴中濃度の立ち上がりは

原薬のMEL と比較して改善した.以上の結果から, EP0 を用いてMELのASD を調製することによ

り, MELの溶解性改善及びアモルファス安定化を両立させたMELのASDが得られた

以上 2 つの検討結果は, MEL の物性及び経口吸収性の改善のみならず,新規の難水溶性医薬品候

補化合物の開発推進に寄与できるものと考える

第2部実験の部 2-1 2-1-1 第1章実験の部

MEL 結晶は東京化成工業株式会社(東京都)から購入した.ヒドロキシプロピルセルロース

但ydroX沖ropylceⅡUlose,HPC)は日本曹達株式会社(東京都)より購入した.ポリビニルピロリドン

(polyvinylP町olidone, PVP)は和光純薬工業株式会社(大阪府)から購入した. Eudragit EPO ((poly

実験材料

(butyl methacwlate・CO・(2・dimethylaminoethyl) methacwlate・CO・methyl methacwlate) 1:2:D, Eudragit L I00

(poly (methacylic acid・CO・methyl methacwlate) 1:D 及び Eudragit N PO (poly(ethyl acwlate・CO・methyl

methacrylate・CO・trimethyla11血onioethyl methacrylate chlonde) 1:2:02)は Evonik industnes (Da如Stadt,

Ge血any)から得た. POVACOAT Type F (polyvinylalcohov Acrylic acid Methyl methacwlate cop01沖er)

は大同化成工業株式会社(兵庫県)から得た. HydmxypropylmethylceⅡUloseacetatesuccinate(HPMC・AS)

は信越化学工業株式会社(東京都)より得た.その他の試薬は市販のものを使用した.

2-1.2 液体クロマトグラフィ

ME工は液体クロマトグラフィーを用いて検出し,濃度は絶対検量線法により定量した.液体クロ

マトグラフィーは high・perfomance liquid C11romatog叩hy (HPLC)(株式会社島津製作所,京都府)を使

用した.キ蒜成は LC・20A solvent delivery U11it, Mgh・pressure aow・1ine selection valves, SIL・20A auto sampler,

CTO-20A COIU血 Oven及び SPD、M20A diode

(pa丘iclesize:5 1Un,COIU血 dimensions:4.6 mmゞ150 n血)を使用した.カラム温度は 40゜C に保ち,サン

プルは 20 mM phosphatebU丘er(PH 7.の及び acetoni廿ile(3/フ, V/V),流速 0.5 mL/m血で分離し,吸光度 360

detector とした.カラムは COSMOSIL 5C18、AR、Ⅱ

array

血で検出した

溶媒シフト法による結晶析出抑制剤のスクリーニング(anti・precipitantスクリーニング)

2-1-3

試験に用いた水溶性ポリマーは150μ創mLの濃度で溶解及び均一に懸濁させた.水溶性ポリマー溶

液及び懸濁液 200 μL を 96 ウェルフィルタープレート(Multiscreenl{Ts solubiliW 釧ter plate,0.45 叩,

M辺ゆore)に200μL分注した.次に 1μL の 30mg・MEL/ml・dimethylsulfoxide溶液を各ウェルに添加し,

プレートシェーカー aK'へ、MS3digitalMⅨER,1KA,staufen, Ge伽any)を用いて 25゜C で 1時間撹枠し

た.ろ過サンプルは遠心処理(500氾,5min)により96 ウェルプレートに回収した.ろ液は等量のアセ

トニトリルで希釈し, ME王濃度は液体クロマトグラフィーにより定量した 35 2-1-4

MEL のナノ粒子製剤は自転公転ミキサーにより調製した(NP、100;株式会社シンキー,東京都).粉

砕方法は過去に報告されている方法に従った[卯].すなわち,20 mgのMEL及び2.5gのZirconia ビー

ズ(zirconiumoxide,0.11血diameter;株式会社ニッカトー,大阪府)を自転公転ミキサーの容器に秤量

し,0.5mLの水溶性ポリマー溶液(40m創mL)を添加した. MEL懸濁液は二段階の湿式粉砕によりナ

ノ粉砕した.第一過程ではポリマー溶液と共に2,ooorpmで2分粉砕し,第二過程では4.5mLの蒸留

水を添加して40orpmで 1分回転させた.ナノ粉砕後に各MEL懸濁液(20mg・MEL/10mL)は液体窒

素により急速凍結し, FD・81丘eeze如er(東京理化器械株式会社,東京都)を用いて凍結乾燥した

湿式粉砕によるナノ粒子製剤の調製

粉末X線回折(XND)

2-1-5

XNDパターンはNNTdi缶actometer(株式会社りガク,東京都)を用いて測定した. CUKα照射は

40mA及び40kVの条件とした.回折データは50から400(2θ)の範囲で020刻みで測定し,スキャンス

溶出試験 ピードは50/min とした 2-1-6 粒度分布測定 製剤の粒度分布の測定及び比表面積の測定は湿式条件で測定するレーザー回折装置を用いた

(Mastersizer 200O Hydr02000μP, Malvem hlstNments Ltd., worcesterS面re, UK). MEL サンフルを 2.o mL の

蒸留水に懸濁し,超音波処理をせずに懸濁させた.粒度分布から体積累積中位径D50とSPANファク

ターを算出して製剤間の比較を実施した.SPANファクターはSPAN=Φ90-D1の/D50で定義され,

DI0, D50及びD90 は累積体積がそれぞれ 10%,50%及び90%における粒子径である.即ち SPAN フ アクターが高いほど粒度分布が幅広いことを示す.また,長期保存時の製剤中の凝集物増加を評価す

るために製剤中の 1μlnよりも大きい粒子の体積の割合を算出した

2-1-フ 長期保存時の粒子径の評価

MELサンプルはバイアルに封入し60OCで21日間保存し,粒度分布を測定した

2-1-8

溶出試験液は90omLの日本薬局方溶出試験第 1液(PH 12)及び第2液(PH6.8)を用いた. MELサ

ンプルの溶出試験は回転バスケット法にて実施し,回転数は 10orpm,温度は370C とした(NTR、VS6,

36

富山産業株式会社,大阪府).各MELサンプルは溶出試験べッセル内のMEL量が15mgとなるように

秤量した.サンプリング容量は lmL とし,溶出試験開始7.5,15,30,60,90及び 120分後にサンプ

リングした.サンプルは50血以上のMEL粒子を理論上遠心分離できる 15,ooog,15分の条件で遠心

し上清を定量した 2-1-9

雄性 SD ラット(sprague・Dawleyrats,2909407.4ginweight;日本エスエルシー株式会社,静岡)を

実験室で飼育し,試験前日までは自由飲食とした.動物実験に関わるすべての手順は摂南大学の動物

実験倫理委員会に承認された内容で実施した 実験動物 2-1-10 経口投与後の血奬中濃度測定 MEL サンプルを投与する雄性ラットは試験前日から絶食・自由飲水とした.投与量は健康成人男

性(体重50kg)がヒト臨床最大投与量(15mg)を服用したときの体重当たりの投与量(0.3mg、MEL/kg

body)の約 33 倍である 1.omg・MEL/kgbodyweight に相当する MELサンプルを蒸留水に懸濁して経口

投与した.懸濁液の濃度は0.5mg・MEL/mL とした.血液サンプルは経口投与前,経口投与0.5,1,2,

4及び8時間後に頸静脈から採血した.採取したサンプルは3,ooorpmで 10分遠心して血柴サンプル

を得た.血奬75μLに等量のアセトニトリルを添加し,10,000地で5分間遠心し,得られた上清中に

おけるMEL濃度を液体クロマトグラフィーにより定量した.水系の溶媒として(A)20mM りン酸緩

衝液(PH7.0)及び有機溶媒として但)アセトニトリルを用いた.グラジエント条件は0-0.5min,70%

A; 0.5-5.5 m血,70-55%A; 5.51-6.o min,40%A とし,流速は 0.5 mL/min とした

2-1-11 統計解析 二群間の比較はF検定及び対応のない Student'st、test により実施した. P値が0.05 よりも小さいと き統計学的に有意な差があるとした 2-2 第2章実験の部 2-2-1 実験材料 2-1-1 に示したものを使用した 2-2-2

MEι(30mg)及び水溶性ポリマー(90m幻を 30mL の 1,4・di0稔ne に完全に溶解させ,液体窒素で

急速凍結後にFD・81丘eezedwerを用いて凍結乾燥した(東京理科器械株式会社,東京都).凍結乾燥後

にASD を減圧乾燥することにより25%(側岡のMELを含有するASDを得た

アモルファス固体分散体の調製 2-2-3 液体クロマトグラフィー 2-1-2 に従って試験を実施した 2-2-4

_{粉末X線回折(XRPD)}

2-1-5 に従って測定を実施した 38

偏光顕微鏡観察(PLM)

各MELサンプルのPLM画像はマイクロスコープ(VHX、50oomicroscope,株式会社キーエンス,大

阪府)を用いて撮影した

2-2-5 2-2-6 MEιサンプルは開栓状態のバイアルに入れた状態で40士20C/75%N1または40士20C/50%N1で30 日間保存した.相対湿度75%及び50%はそれぞれ塩化ナトリウム懸濁液及び硝酸マグネシウム懸濁液 により維持した.30日保存後に各MELサンプルのXRPD及びPLM試験を実施した 安定性試験 2-2-フ

物理混合物及び各ASDなどのMELサンプルを約3 mg・MEL となるように秤量し,30o mgのKBr

と均に混和した.混合粉末をプレスすることにより測定用ディスクを調製し,1Rスペクトルを測定

した.1RスペクトルはIRsolutions0丑WaN を用いて解析した(株式会社島津製作所,京都府)

フーリエ変換赤外分光光度計解析

核磁気共鳴(NMR)分光法

2-2-8

Eudra即tEP0の有無による MELの'H・NMRスペクトル変化はJEOLECA50ospeC廿ometer(日本電子

株式会社,東京都)を用いて測定した.各サンプルはdimethylsulfoxide・d6(DMSO,99.9%D)に完全に

溶解させ測定した.測定温度は室温とした 39

2-2-9 溶出試験 2-1-8 に従って試験を実施した 2-2-10 実験動物 2-1-9 に示した通りに実施した 2-2-11

1.omg・MEL/kgbodywe地htに相当する MELサンプルを蒸留水に懸濁して経口投与した

物濃度測定は実験の部2-1-10に従って実施した 経口投与後の血奬中濃度測定 2-2-12 統計解析 実験の部2-1、Ⅱに従って解析を実施した 血柴中薬 40

謝辞 本研究を遂行するにあたり,始終ご懇切なる御指導,御鞭挫を賜りました摂南大学大学院薬学研究 科橋本直文教授に厚く感謝の意を表します.本研究に御指導,御鞭捷を賜りました静岡県立大学大学 院薬食生命科学総合学府尾上誠良教授に深く感謝いたします. 本論文に関し,懇切丁寧な御指導と御助言を頂きました摂南大学大学院薬学研究科山下伸二教授, 佐久間信至教授に深く感謝の意を表します 種々の御指導,御協力を頂きました摂南大学大学院薬学研究科弓樹佳曜助教に感謝いたします.実 験及び論文作成に御協力頂きました,摂南大学薬学部薬品物性化学研究室の諸氏に厚く御礼申し上げ ます.最後に学生としての研究生活を長きに渡って支えていただきました亡き父に感謝いたします

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