セルラーゼに関する研究（第1報） : Poria vaporariaの培養とセルラーゼの精製について
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(2) . 第 １１ 巻 第 １ 号 Ａ. 北海道学芸大学紀要 （第二部）. 昭和３５年８月. セ ルラー ゼに関する研究 第 １報. Ｐｏγ知 り噂ｏγα“” の培養とセルラー ゼの精製について. 東. ，. ．尚. 巳. 北海道学芸大学旭川分校化学研究室. Ｎａ。ｍｉ ＡＺＵＡＩＡ ； Ｓｔｕｄｉｅｓ 。ｎ ＦｕｎｇａＩ Ｃｅ ｌ ｌｕｌ ｉｖａｔ ｉ ｔ ａｓｅ ｌ： Ｔｈｅ Ｃｕｌ 。ｎ ｏｆ ｉ ｆ ｉ ｉ ｌ ｌｕｌ ｐｏ“” “” Ｐｏγα“” ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｕｒ ｃａｔ ｏｎ ｏｆ Ｃｅ ａｓｅ Ｉ. ｌｕｌａｓｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏ ｌｕｌｏｓｅ ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ｓ Ａ ｃｅｌ ｆ ｈｙｄｒｏｌｙｚ ｉｎｇ ｂｏｔｈ ｃｅｌ ｌｕｂ ｌ ｏ ｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｒｉｖａｔｅｓ. ｌ ｌｕｌ ｌｕｌ ｔｈｙｌ ｔｈｙｌ （ｃａｒｂｏｘｙｍｅ ｃｅ ｏｓｅ ａｎｄ ｍｅ ｃｅｌ ｏｓｅ） ｈａｓ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐ の〆” “”力ｏ一 ｌｕ１ｏｓｅ ｐｏｗｄｅｒ ｌａｃｔ ｉｃ ａ ｉｄ ａｎｄ ｓｅｖｅｒａ１ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， γαγ” ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｃｅｌ ｃ ， Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｆ ｌ ｉ ｉｏｎａｔｅｄ ｂｙ ａｃｅとｏｎｅ ｔｒａｔｅｓ ｆｒｏ］ｍ ｃｕｌ ｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒａｃｔ ，. 植物， ある種の無背椎動物の消化管， バクテリヤ， 菌類， 原生動物などに見いだされているセ. ） ル ラ ー ゼ は， 地 上 に 極 め て 豊 富 に 存 在 して い る セ ル ロ ー ス を 基 質 と す る 酵素 で あ る． Ｋａｒｒ ｅｒ ら１ ） の大麦 々芽 セルラ ー ゼについ て の研 究 以 来 ｉｎｇｓｈｅ ｉｍ ら２ の カ タ ツ ム リ セ ルラ ド ゼ， Ｐｒ ， 若干の. ３ ）の ｉ 報告があるが， その作用については不明な点が多い． 叉， その精製については， Ｗｈ ｔ ａｋｅ ｒ. ４ ） ） 或は ｌ ｌｕｌ ｌ ｌｕｌ 及かγｏｚ膨ｃＺ ブ タ ｃｅ ａｓｅ ａｓｅ に 関 す る 報 告 が あ る が， Ｒ ｚ ‘ ｅｅｓｅ ら５ ， 西 沢 ら の かＰβ彩ｃｅ ‐ ６ ） ３ ｌ ｌｕｌｏｌ ｉ Ｎｏｒｄ ら の 主 張 す る ｃｅ ｔａｋｅｒ） の単一な酵 ｃ ｅｎｚｙｍｅ が一 種 以 上 あ る と い う 説 と， Ｗｈｉ ｙｔ ８ ） Ｗｈｉ ） ｌ ｔ は セ ル ロ ー ス 加 水 分 解産 物 と し 素によるという説とが対立 してい る． Ｓａｕｎｄｅｒｓ７ ｓ ｅｒ ， ， ） ） ）こ て， グル コ ← ス を オ サ ゾ ン に して 確 認 し てお り， 叉， セ ロ ビ オ ー ス も確 認 さ れ て い る． ３ ・８ ・９ Ｌ ｉ グ ビオ の ルコースと セロ ド ス の 生 成 機 構 に つ い て， ｅｖｎｓｏｎ ら は， セ ル ロ ー ス の β－１ ，４‐ 結 合. ｔａｋｅｒ は， グ ル コ ー ス が セロ ビ オ ー を 切 る 酵 素 の 主 な 最 終 産 物 は セ ロ ビ オ ← ス で あ ろ う と し，Ｗｒｈｉ. スを経て生成するものではないと云っている， 叉， セルロ←ス分子に対して， セルラー ゼは末端 から作用するのか， 分子中の任意の結合に作用するものかについても， 種々の論がある． これら. の点を明らかにしようと して， 木材腐朽菌の中でも腐朽力の大きいことで知 られ て い る Ｐｏ“” 第めげα“” （ワ タ グ サ レタ ケ） を用 い て 実 験 を 行 っ て い る の で， こ こ に， こ の 菌 の セ ル ラ ー ゼ 生. 産に適する条件の検討並にその精製を行って得た結果について報告する． 実. 験. Ｍｇｓ０４ ・７Ｈ２０， ＮＨ４Ｎ０３ ， Ｋ２ＨＰ０４ ， 乳 酸 （７５％）， Ｆｅｓ０４・７Ｈ２０ は関東化学一級品で， このう ち Ｆｅｓ０４・７Ｈ２０ は 再 結 晶 し て 用 い た． Ｓｏｍｏｇｙｉ の銅試薬に使用する薬品はすべ て関東化学特級 品． 粉 末 ロ 紙 は 東 洋 瀬 紙 製 （１００～２００ｍｅｓｈ） の も の． セ ロ ビ オ ー ス は関 東 化 学 特 級 品， サ リ シ ソ は 和 光 純 薬 製． カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス （ＣＭＣ） は 東 京 化 成 製 の も の を１ｏｏｏｃ で２時間乾燥. 後１ ％溶液 （ｗ／ ｖ）. と し， こ れ を ３０ｏｏ ｒ ，ｐ ， ｍ． で３０分 間 遠 心 沈 殿 を 行 い， 沈 殿 す る 部 分 を 除 い た. 液 を １ ％ 溶 液 と した， メ チ ル セ ル ロ ← ス は Ｄｏｗ Ｃｈｍ． Ｃｏ ． の 重 合 度１０００の も の を 使用 した， 粗 一 ２７ 一.
(3) . セルラー ゼに関する研究 ｓ卿７ ２αＺ ｃα） の 熱 水 抽 出 液 に， エ チ ル ア ル コ ー ル を 加 え て， リ ケ ニ ン は エイ ラ ンタ イ （ＣＢか のＺα ズ. 生 じた沈殿をカ性ソー ダ液 にとかし， 可溶部分にエチルアルコールを加えて沈 殿させ， この沈殿 ＩＭ ２Ｍ の酷酸及び酷酸ソー ダにより ０， をアルコール及 びエーテルで洗練 して得た． 緩衝液は ０ ，. の所要の ＰＨ の酷酸緩衝液を調製した， 実 験 条 件 Ｐｏγ幻 の物ｏγの 幻 を麦芽・寒天培 地に接種， ２５ｏＣ で培養したものから少部分をとり， １２０ｏＣ ７ｏＣ に静置した． ５ｏＣ～２ で３０分 間， 叉 は１０００ＣＩ 時 間 の 殺 菌 を ３ 日間行った液体培地に接種 して２ ｃｃとし， ｃ， 酵素， 基質， 蒸溜水を加えて全量を １２ 酵素反応は特にことわらない限り， 緩衝液 ８ｃ ３０ｏＣ で反応直後及び１時間後 に 夫 々５. ｏ ） の方 法 で ｃｃず つ と り 出 し， Ｓｏ ・ｎｏｇｙｉｌ. ２００チオ硫酸ソーダ 溶液で１ 還元糖を Ｎ／ ％殿粉を指示薬と して滴定した， ここで. 滴定値と グルコース量との間には 直線的 関係が認められたので （第１図） ， 滴定値. で還元糖量 （グルコースとして） を表わ す こ と に した．. １ ０ 楓９ ，. ～ ０ ． クラレコ ー ス霊ゑ ÷. 第１図： グルコースとチオ硫酸ソーダ滴定数との関係. . Ｍｇｓ０４ ０７５ｇ， ７５％ 乳 酸 ０ ３ｃｃ， ・７Ｈ２０・０ ． ．. ０ｇ， 水 １５０ｃｃ を ５００ｃｃ の 平 底 粉 末 ロ 紙３ ．. いて第２図の 結果を得た． この. ｃ ｃ ・ ・. 結果，１０日前後の培養で培養条 件の検討が出来ること， 並に， 酵素を濃縮する際は３週間前後. . は 培 養 す る こ と が 望 ま しい こ と. 数. ９ｇ， Ｋ２ＨＰ０４０ ３ｇ 件 の 通 り， ＮＨ４Ｎ０３０ ． ．. フラスコに入れて殺菌， 接種し て， 培養日数と酵素生成量につ. Ｎ／醐 １ チ. １ ， 培養日数と酵素生産との関係 ） の かＰＢ工 ｃｅ ｌ ｌｕｌ 西 沢 ら４ ｅ 生産の条 ａｓ. が判つた． ２ ． 培養条件の検討. ｃ ｃ ・ ・. 鉄の影響 ： 第１表の組成で. ４１ で １０ 日 間 培 養 し， ＰＨ ３ ．. Ｏ. ＣＭＣ に対する活性を測ったと. ０. ８日 培. 養. 、. 日. ２４ 日. １６ 日. 数. 第２図： 培養日数と酵素量との関係 ｐＨ ５ ．３ の酷酸緩衝液使用. ころ， 表の結果を得た． 培養液. ３０ｃｃ中 に１ｏｍｇ 以 上 の Ｆｅ が存. 在すると， 酵素活性の低下， ひ い て は 酵 素 力 が 全 く 認 め られ な いては酵素力が全く認められな. ０％ の 増 加 を 示 し い 状 態 と な る． （こ の 場 合 で も 苗 体 は 増 加 して い る）． １～６ｍｇ の添加で約２ ・７Ｈ２０ を用いた） た． （Ｆｅ は Ｆｅｓ０４ ．. 「 ２８ 一.
(4) . 東. 尚 １. 第. 巳 表. １ｇ， Ｋ２ＨＰ０４： ０ ０５ｇ， Ｍｇｓｏ ・７Ｈ２０ ： ０ ＮＨ４Ｎ０３： ０ ０１ｇ， 乳 酸０ ０２６ｇ， 粉 末 ロ 紙 ： ０ ５ｇ， ． ． ． ． ． ０ Ｆ ３ 全 量 ｃｃ で更に ｅ を次の量加えた ． Ｆｅ. 量. 酵 素 活 性. ０．０２ｇ. ０．０１ｇ. ０．００６ｇ. ０．００４ｇ. ０．００２ｇ. ０．ｏｏｌｇ. ０. ０．３８. ４．８１２. ４，９２５. ４．８１２. ４．９２７. ０ ４．００２. ｌｍｇ と し， セ ル ロ ー ス 量 を ０ ３ｇ か ら ０ ７ｇ ま セ ル ロ ー ス 量 の 影 響 ： 第１表の組成中 Ｆｅ を ・ ． ．. で変化させ， 他は同一組成で培養 （８日間） したところ， 次の結果が得られた， 且 セルロース亙. ０ ，３ｇ. ｏ ，４ｇ. ｏ， ５ｇ. ｏ ７ｇ ．. 酵 素 活 性. １３７. ２２. ４ ０４ ．. ７２８ ４ ．. セルロース量の増加と共に酵素量の増大することが認められる， ５ｇ と し乳酸量を変化させて他は同一 乳 酸 の 影 響 ： 第 １ 表 の 組成 中 Ｆｅｌ ｍｇ， セ ル ロ ー ス ０ ．. 組成で培養 （８日間） した結果， 次の通りであった． 乳. 酸. ０ ０１６ｇ ． ２ ９５２ ．. 量. 酵 素 活 性. ｏ ０２ｇ ． ３ ５５７ ．. ｏ ０２６ｇ ， ４ ０４０ ．. ｏ ０３ｇ ， ７ ３ ．１７. ｏ ０３４ｇ ． ７ ３ ．７３. ０２６ｇ の と 乳酸の量には最適条件があり， 此の実験に用いた組成では， 培養液３０ ｃ ｃに対して ０ ． きに最大の活性を示 した．. ３ ， 酵素の濃縮， 精製 ／ 培養液をロ過 して， 菌体及 び未利用セルロース類を除き， このロ液を３５ｏＣ以下で１ ４容 以下に濃. 覚拝 しな が ら 徐 々 に 縮 してロ 過 後，ロ 液 を 冷 却 し， …５０Ｃ以下 で ア セ ト ンを ７０％ （ｖ／ｖ） に な る ま で才. 加え，３０分間静置したのち遠沈処理し， 得た沈殿をできるだけ少量の水に溶解し， 不溶解分も併 せて流水で１昼夜， 更に蒸溜水で１日透析を行い， 透析液を遠心沈殿して上澄み液を酵素液と し ６ 飽和になる様に加 た， 一方， 培養液の濃縮液をアセトン処理する代わりに， ００Ｃ で硫安を ０ ． え て 生 じた 沈 殿 を ロ 別 後， 少 量 の 水 に 溶. 第３図 ｐＨ と 活 性 曲 線. 解し， 流水及び蒸溜水で透析して得た液 を硫安処理酵素液として， その活性を比 較すると， 培養液の酵素活性を１００と し. 酵 素 活. て， 濃 縮 液 ８５， ア セ ト ン処 理 酵 素 液７４，. ％. 硫安処理液３９という結果が得られた． つ まりアセトン処理に比べて 硫安処理の場. 性. 合の収量が約半分程である こ と が 判 っ た．. ０ ～. ４ ， 最 適 ｐＨ ｐＨ と酵素活性との 関係を第３図に示 ４附 近 が最 適ｐＨ した． この 関 係 か らｐＨ３ ， であ る こ と が 判 る．. ３ ０ ，. ３ ～ ，. 卿 ｐＨ. ４～. ０ ～ ，. 一 ２９ 「. ５ ， 反応時間の影響 オストワル ドの粘度計を用いて， 反応. 液 の 組成 を 還 元 糖 定 量 の 場 合 と 同 一 組成 で 全 量 を ６ｃｃ と し て， ３０ｏＣ で反応させ 、.
(5) . セルラーゼに関する研究. ｃ，１ ％ ＣＭＣ４ｃｃ， 酵 流下時間の経時的変化をみた， 叉， 還元糖定量のためには， 酷酸緩衝液１６ｃ ｏ ｃ ｃを採り出して Ｓｏｍｏｇｙｉ 法 素 及 び 水 を 加 え て 全 量 を ２４ｃｃ と し， ３０ Ｃ で反応させて， 時間毎に５ で糖を定量 し， 残りの部分は直ちに煮沸して酵素作用を止めた後水浴上で濃縮し， ペーパ ←クロ. ．５０ を 用 い， ｎ‐ブタ ノ ー ル ： ピ リ ジ ソ： 水 ＝６：４：３ マ ト グラ フ ィ ー の 試 料 と した． 東 洋 滋 紙 Ｎｏ で展開 し （上昇法， ３ 回）， ｐ－ ア ニ 第４図 ａ： ＣＭＣ の分解曲線 シ ジ ソ試 薬 を 噴 霧 して，１０ｏｏＣ で５～ ７ 分間処理した． これらの結果を ４. 図に示す． ６， ＣＭＣ 以外を基質にした場合 末 ロ 紙 及 び セ ロ フ ァ ン： ａ） ， 粉. ｃｃに 緩衝液 ８ｃｃ， 酵素及び蒸溜水 ４. 粉 末 ロ 紙叉 はほ ゞ ０ ．２５ｃｍ２ に 細 断 し た セ ロ フ ァ ンを０．２４ｇ 加 え， ３０ｏＣ. に保った． 時間毎にガラス ロ過器 Ｉ. Ｇ４ で ロ 過 し， ロ 液 を２５ｃｃ と し， そ. の５ｃｃについて還元糖の定量を行 っ て第２表の結果を得た． （尚， セル. ２Ｑ 時間. ロ←ス 及びセロフ ァ ンの重量減は殆 ん ど認められな かった）．. 反応時間. ｂ）. 第４図 ｂ： グルコース. . ◎. ◎. サ. リ シ ン， リ ケ ニ ン， セ ロ ビオ ー ス ： メ チ ルセ ルロ ー スに 対す. ◎. ◎. メ チ ル セ ル ロ ー ス，. る作用時間と粘度及 び生成還元 糖量の関係は第５園の通りで，. . ー オース セロヒ. ＣＭＣ の場合と殆ど同様であ る， サ リ シ ソ（反 応 液 中 Ｍ／４６０）セ ロ. ビオ←ス （反応液中 Ｍ／１２００） を前述 通りの条件で反応させる と， １時間までは還元糖の生成 Ｓ. －. ｚ. ３. は全然認め られなかった． この 場合， 酵素量を２０倍にして も同. ４. Ｓ ： グ ル コ ー ス 及 び セ ロ ビオ ー ス １： ０ ．５時間. ４： １ １時 ；間. 購逼 － 宙質－ ＩＣ ＣＮ. 粉 末 口 紙. ２： ２時間. ３： ５時間. ５： ２１時間. ６： ２ ６時間. 第 ２. 時. 間. ０．８６ Ｃ Ｃ. １. 日. 様に反応しなかった． 粗リケニ ンに は作用 して還元糖を生成し た，. ２ 表 ２. ４ Ｃ ．５２２ Ｃ. 日. ０．０１４ Ｃ Ｃ. ／ （但し ＣＭＣ の場合の酵素量は他の場合の １ ５ である）． － ３０ －. 日. ４. 日. ６ Ｃ ．５４５ Ｃ. １ ｃ ・０７ Ｃ. セ ロ フ ア ソ. ３. １ Ｃ ．１２１ Ｃ. Ｃ １ ．３５８ Ｃ. ０．０６８ Ｃ Ｃ. ０．２４ Ｃ Ｃ.
(6) . 東. 尚. 巳. ７ ． 酵素濃度の影響. 第５図：メチルセルロースの分解曲線. 反応条件は既述の通 りで， 酵素. 量 を ０．０ｌｃｃ か ら ０．１２ｃｃ まで変え. 流下. て， 生成還元糖と酵素量との 関係 を求めると第６図の結果を得た．. 時 間. 考. 察. 培養条件の検討の際， セルロ← ス量の増加と共に， 生産される酵. 滴定. 素量が大となったのは， セルロ ← ス量の多い程， 菌糸と接触し易す. 数 ＾ Ｖ. くなるため， 繭体量が増加し， そ の結果， 酵素量が増すと考えられ. ３. 反応時間. るが， 逆に， 生産される酵素のう ち， セ ル ロ ー ス に 吸 着 さ れ る 部 分 も， セ ル ロ ー ス量 の 増 加 と 共 に. 第６図：酵素濃度の影響. 増加することも併わ せ 考 え て，. 滴. ０．５ｇ／３０ｃｃ の割合が適量であろう. 定. と 推 定 し た． こ こ で， 菌 糸 と セ ル ロース との接 触を高 め る た め に. 数. は， 振湯培養叉は通気培養も好結 果を与えるものと予想される， 事 実， 多くの報告も， それらの培養. ０. ０ ０２ ，. ０４ ０ ○ ０も 、 ， 酵 素．量. ０８ ○ ，. ０ 、′０. ｉ ０ ′之‐ ｃＣ ． ．. ｌ Ｉ Ｊ ｌ で 酵 素 を 生 産 して い る が， Ｐａ. ら は ｛蜂ｙγｏ物８ ｃＺ ｚ ‘ ’ ” 〃〃〆締切αγ卿. な ど数種の菌類について， 却って. 振湯しない方が良い結果を得ているので， 更に比較検討する必 要 は あ る． ワタグサレタケの生 育に対し ｐＨ がある程度影響を及ぼ，し， 比較的酸性で良好な発育を示すことが認めら れ て い る ２ ） が１ ， これは乳酸添加量に最適条件のあることと 関係があるものと思われる． 酵素の精製過程中 の， 培養液， 濃縮液， アセトン処理液， 硫安 処理液のいずれについても， セロ ビアー ゼ作用が認 められなかった． セルラーゼが単一のものか否かについては， 酵素活性を有する数種の蛋白部分 ３ ４ ） ） も あ り 叉 Ｗｈｉ ）の い う よ う に 単 一 の 酵 素 で あ る と い う 報 Ｊ ３ の 分 離 に 成 功 し た 報 告５ ｔａｋｅｒ ’１ ’１ ， ，. 告もある， 現在までは， Ｐｏ“”リリｏγの 如 から得たセルラー ゼは， より以上の精製を行っていな い の で， そ れ ら の 点 に つ い て は 何 ら 言 及 で き な い が， 反 応 生 成 物 の ペ ー パ ーク ロ マ ト グラ フ ィ ー. の結果からみると， 重合度の大きな反応生成物を分離しないまま展開したので， ス ポットは余り 明瞭には分かれてい ないが， グルコースの生成前に， オリ ゴ糖が， 次でセロ ビオースが出現し，. 叉， 粘度変化でも， 還元糖の増加の前に粘度が著しく低下することからみても， ＣＭＣ 叉はメチ ル セ ル ロ ー ス の 末 端 か ら， グル コ ← ス 叉 は セ ロ ビ オ ー ス を 切 断 す る の で は な く， ａｔｒａｎｄｏｍ に 切. るものであることが判る． しかし， この酵素の純度については， 更に検討する必要がある， 粉末 口紙類の不 溶性基質に対しても， 反応速度は小さいが作用するのは， 他の起源のセルラ← ゼと同 一 ３１ 「.
(7) . セルラー ゼに関する研究 様 で あ る， リ ケ ニ ソに 作 用 す る の は， こ の 酵 素 中 に， リ ケ ナ ー ゼ が 混 在 して い る た め か， こ の セ ルラー ゼのもつ作用なのかは明らかではない 最適 ｐＨ に つ い て は， ４．５～６．０附 近 に あ る もの が. ．. ７ ） な ど の 例 に み ら れ る よ う に， 酸 性 １ ６ ５ ） Ｐ ″Ｚ” 〃”認Ｚの“” で ｐＨ ３，２１ ）ｍａ ｌ ｔ で ｐＨ ３，０ 多 い が１ ， に 最適 ｐＨ を 有 す る も の も 若 干 あ る， こ の セ ル ラ ー ゼ の 最 適 ＰＨ も その 例 で あ る，. Ｐｏ“” 堀夢ｏ〆”“” を培養 して， 培養液中にセルラー ゼの生産されるのを見た．適当な条件は，. Ｍｇｓ０４ ・７Ｈ２０ ： ０．０１ｇ， ＮＨ．Ｎ０３： ０．１ｇ， Ｋ２ＨＰ０４： ０．０５ｇ， Ｆｅ： ０．０２ｇ， 乳 酸 ： ０．０２６ｇ， 粉 末口紙 ０，５ｇ， 全 量 ３０ｃｃ の割合で， ２～３週 間の培 養であった． この培養液をアセトン処 理して. 酵素を精製 した． ＣＭＣ を基質と し， 酷酸緩衝液を用いて最適 ｐＨ を 求 め る と， ３．４ であった．. メ チ ル セ ル ロ ー ス， 粉 末 ロ 紙， セロ フ ァ ン， リ ケ ニ ソに は 作用 し た が， サ リ シ ソ， セ ロ ビ オ ー ス. には作用 しなかった． 酵素濃度， 反応時間の影響についても研究 した， 本研究の一部は北海道科学研究費補助金により行なわれた， 付記して謝意を表す． 献. 女. １ ｌ ｉ ｔ ｈｒ ， Ｐ， Ｋａｒｒｅｒ ， Ｐ，Ｓｃｈｕｂｅｒ ，ａｎｄ Ｗ， Ｗｅ ， 賊浸り， Ｃ粥川， Ａｃね，８， ７９７ （１９２５）， Ｐ， Ｋａｒｒｅｒ ａｎｄ Ｐ， Ｓｃｈｕｂｅｒ ｔ ，ｉ鋭ｄ ，９ ， ８９３ （１９２６） ’ ｉｄ． α′ ８８ （１９２８） ｉｎｇｓｈｅ ｉｍ ａｎｄ Ｋ． Ｂａｕｒ ２． 日．Ｐｒ ｅｍ． ｓ ，１７３ ，１ ， ｚ がり ３． Ｄ， Ｒ． Ｗｈｉ ｔ “ ｏが夢ｓ ａｋｅｒ Ｇ海′ ． ，４３ ，２５３ （１９５３） ， Ａγ欲． 助ｏ ， Ｂｉ. １ ９５４ ４ ） ． 西沢， 小林， 市川， 酵素化学シンポジウム，１０ ，７（. ′ ・ ！ ′ ’ ｌ ｌ ｉｇａｎ ５． Ｂ． Ｔ， Ｒｅｅｓｅ ａｎｄ ｗ． Ｇｉ ｓ ｅｍ． β／ ｏがり ｃな β ｏ Ｇ ｚ ． ，７４ （１９５３） ，４５ ， Ａ； ／ ｌ ｄｏ ６ ｏメリリ ｔ ｚのれ ｅｎｖｅｎｉ ｅｒ ａｎｄ Ｃ．ｓ． Ｂｉ ． ． β卿Ｃ ， Ｂｉ ． Ｆ． Ｆ． Ｎｏｒｄ ．ｓ． Ｗａ ， ６８ ，５０２ （ｉ９５７） ， Ｊ ， Ａ”ん ー ｃ ん ６ ９ １ ９ ４ ８ Ｒ Ｓ β如 ′ ７ ４ ７ ７ Ｐ ｄ Ｒ 日 Ｓ ｉ ｄ Ｒ Ｇ Ｇ ｔ （ ） ′ 幻ル ａ ｎ ｎ ｓ ｕ ｅ ｒ ａ ｎ ｅ ｕ ． ． ． ． ． ， ， ． ， ， ， ． ｌ ８． Ｒ， Ｌ， Ｗｈｉ ｔ ） ｓ ２ 足擢． ｓの． ｅｒａｎｄ ｃ． Ｌ． Ｓｍａｒｔ ， ． Ａ分 ． ｃ／ ，７５ ， １９１６ （１９５３ ，′ ’ ９ ／のＺ ． ） ｓ ？切ｚ ， ． 茂りがり ． ． Ｅ． Ｔ． Ｒｅｅｓｅ ａｎｄ Ｈ．ｓ ， Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ，３１ ，３５１ （１９５１ ， Ａ′物． β. ｉ ． ／ｄ． Ｃ／ｍｍ． １０． Ｍ． Ｓｏｍｏｇｙ ．β ，ノ ，１９５ ，１９ （１９５２） ｌ １１ ） ． Ｓ． Ｎ． Ｂａｓｕ ａｎｄ ｐ． Ｎ． Ｐａ ，１７８ ， ３１２ （１９５６ ， Ｍ”加デｅ. １ ２ ． 阿部， 小田島， 大山， 北海道林業指導所研究報告， 第６号， １２３頁 （昭和２９年）. ／ｄ． Ｃ／ ｌ ｌ １３． Ｇ． Ｌ． Ｍｉ ． ｅｒ ａｎｄ Ｒ． Ｂ１ｕｍ， ノ ぞのれ，２１８ ．β ， １３１ （１９５６） 〆 １４． Ｍ． Ａ．ｊｅｒｍｙｎ ｓ ． ｓＧ ． Ｒげ ． ， Ｂ．５ ，４３３ （１９５２） ， Ａｚ懲．′ ｉｍｅｓ ｚ １５ ｏ物ｅ“ ｏｐルタ ６８ ． βｉ ，４１２ （１９５７） ． Ｒ． Ｍ． Ｇｒ ， Ａｒｃ九 β′ ， Ｃ． Ｗ． Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｃ． Ａ． 日ｏＰＰｅｔ ， Ｊ Ｂ Ｓｕｍｎｅｒａｎｄ Ｋ Ｍｙｒｂａｃｋ ｅｄｓ） ｖｏ１ １ Ｐａｒｔ２ Ｐ ７３２ ” １６ ． ｎａｎ ． ． ． ， ・ ， ． ． ， ． Ｗ・Ｐｉｇ ， “を β“リリ〃 ぷ （ Ａｃａｄｅｍｉ ｓ ｃ Ｐｒｅｓ ． ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ， １９５１ Ｚ ・ ！ １７． Ｂ． Ｃ．Ｓｉ ｚ ｚｙｓ ｏ ｃ その１ ｓｏｎ ． ．β ． β知力′ ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔａｎｄ Ｆ． Ｆ． Ｎｏｒｄ ，７５ ，２６０ （１９５８） ， Ａｒｃを ， Ｗ．Ｊ. － ３２ 一.
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