中国医学処方に基づく生薬製剤の
抗微生物作用に関する研究
2019年度
東
京
薬
科
大
学
略 号 一 覧
AB medium Autoinducer bioassay medium
AI-2 Autoinducer-2
AMR Antimicrobial resistance
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain heart infusion
CFU Colony forming unit
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
EBM Evidence-based medicine
FIC Fractional inhibitory concentration
GS Gingyo-san
MGS Modified Gingyo-san
MIC Minimum inhibitory concentration
MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form
OdiE Oldenlandia diffusa extract
PBS Phosphate buffered saline
PFU Plaque forming unit
PNE Panax notoginseng extract
PRSP Penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae
2 ンスが西洋医学と比べ非常に不足している。さらには、一般用医薬品や健康食品の薬 理情報は少なく、西洋医学で用いられる治療薬と併用された場合の相互作用に関する 情報も乏しい。 一方で、呼吸器感染症は、薬局薬店でもよくみられる疾患であり、薬剤師が頻繁に 関与しうる。呼吸器感染症は、上気道感染症と下気道感染症に大別され、感染した部 位とその起因微生物によって病態が異なる[4]。上気道感染症は、声帯より上部にある 鼻腔、咽頭、喉頭から構成する上気道に微生物が感染した疾患であり、急性気管支炎 や急性副鼻腔炎、急性咽頭炎・急性扁桃炎などがある。また、下気道感染症は、気管、 気管支から構成する下気道に、微生物が感染した疾患であり、気管支炎や肺炎などが ある [4]。呼吸器感染症の薬物治療には、対症療法と原因療法がある。対症療法では、 非ステロイド性消炎鎮痛薬 (NSAIDs)、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、去痰薬、気管支拡 張薬などが用いられる。一方、原因療法では、主にウイルスまたは細菌が起因微生物 であるため、抗ウイルス薬や抗菌薬などが用いられる。細菌性の場合は、抗菌薬の投 与が有効であるが、ウイルス性の場合、抗菌薬の効果は期待できない。 市中呼吸器感染症の主要な原因微生物は、肺炎球菌 (Streptococcus pneumoniae) やイ
ン フ ル エ ン ザ 菌 (Haemophilus influenzae) 、 肺 炎 マ イ コ プ ラ ズ マ (Mycoplasma
pneumoniae) などである(Fig. 1)[5, 6]。肺炎球菌やインフルエンザ菌による感染症の
3
薬物治療は、主に高容量のpenicillin 系薬や β-lactamase 阻害薬配合 penicillin 系薬が
用いられる。また、マイコプラズマ肺炎の場合は、macrolide系やquinolone 系薬が用
いられる。しかしながら、市中の診療所等では、ウイルス性と細菌性を明確に区別 することは難しく、ウイルス性のものに対しても抗菌薬が使用されている現状があ る。このような不必要な抗菌薬使用は耐性菌の出現のリスクとなることが知られて いる。実際に、近年、不適切な抗菌薬治療によって、penicillin 耐性肺炎球菌
(Penicillin-resistant S. pneumoniae, PRSP) やmacrolide耐性マイコプラズマが増加して
おり、薬剤耐性 (Antimicrobial resistance, AMR) の対策は、人類全体の問題になって
5
【
方 法 】
1. 生薬製剤の抗菌活性のスクリーニング
1.1. 使用菌株と培養条件
試験菌株は、黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus JCM2874 株、大腸菌 Escherichia
coli ATCC25922 株、肺炎球菌 Streptococcus pneumoniae ATCC49619、インフルエンザ
菌Haemophilus influenzae ATCC49247 株を用いた。黄色ブドウ球菌および大腸菌は、
Hinton broth (Oxoid) または 1% 細菌用寒天 (Oxoid) を添加した Mueller-Hinton agar を用い 37°C で培養した。肺炎球菌は Todd-Hewitt broth (Becton Dickinson)
ま た は 血 液 寒 天 培 地 で 、 イ ン フ ル エ ン ザ 菌 は 、15 μg/mL β-nicotinamide adenine
dinucleotide oxidized form (NAD+: WAKO)、15 μg/mL Hemin (WAKO) 添加 Brain Heart
Infusion Broth (Oxoid) (sBHI broth) またはチョコレート寒天培地を用いて 37°C で培養 した。
1.2. ディスク拡散法
抗菌活性のスクリーニングには、ディスク拡散法を用いた。まず、8 mm Paper disk (Toyo Roshi Kaisha) に対し、各製剤の水性懸濁液を8 mg/diskとなるように滴下し、薬 剤含有ディスクを作成した。次いで、それぞれの増殖培地に0.75%の細菌用寒天を添 加した軟寒天に被験菌を懸濁後、寒天培地上に重層した。その培地に上記のdiskを静 置し、35°Cで一晩培養した後、阻止円の直径 (mm) を測定した。 使用した製剤は、イスクラ産業株式会社より提供された麦芽製剤、温胆湯製剤、玉 屏風散製剤、香砂六君子湯製剤、参苓白朮散製剤、五行草製剤、五味消毒飲製剤、丹 参製剤、竜胆瀉肝湯製剤、杭菊花製剤、山楂子製剤、藿香正気散製剤、帰脾湯製剤、 大黄黄芩製剤、杞菊地黄丸製剤、川芎茶調散製剤、銀翹解毒丸製剤、田七人参製剤、 板藍根製剤、独活寄生湯製剤、蒼耳子辛夷製剤、白花蛇舌草製剤、百合北沙参製剤、 蘇子降気湯製剤を用いた。また当帰飲子製剤はクラシエ薬品株式会社より提供された 当帰飲子を用いた。 2. 銀翹解毒丸製剤および田七人参製剤のもつ抗微生物作用 2.1. 使用菌株と培養条件
6
好気条件で培養した。インフルエンザ菌は、sBHI broth、またはチョコレート寒天培地
を用いて、37°C、好気条件で培養した。
Table 1. Bacterial strains used in this study
2.2. 使用薬剤
銀翹解毒丸 (Modified Gingyo-san, MGS) 製剤としてイスクラ涼解楽 (イスクラ産業 株式会社) を用いた。本製剤は1日量3包 (7.2 g) 中に4.7 gの涼解楽エキス末を服用す る。また添加物として乳糖とステアリン酸マグネシウムを含有する。田七人参 (Panax
Microorganism Description
Gram positive bacteria
Staphylococcus aureus JCM2874 Quality control strain for susceptibility test, Methicillin-susceptible strain N315 Methicillin-resistant strain
Streptococcus agalactie JCM5671 Quality control strain
Streptococcus intermedius ATCC27335 Type strain
Streptococcus anginosus JCM12993 Type strain
Streptcoccus mitis JCM12971 Type strain
Streptococcus pneumoniae ATCC49619 Quality control strain for susceptibility test, penicillin-susceptible
19F Clinical isolate, penicillin-resistant S. pneumoniae, serotype 19F R6 Non-virulent strain
Streptococcus pyogenes JCM5674 Type strain
GAS48 Clinical isolate chosen from laboratory stock at random GAS196 Clinical isolate chosen from laboratory stock at random GAS215 Clinical isolate chosen from laboratory stock at random GAS256 Clinical isolate chosen from laboratory stock at random GAS259 Clinical isolate chosen from laboratory stock at random GAS293 Clinical isolate chosen from laboratory stock at random
Streptococcus salivarius JCM5707 Type strain
Enterococcus faecalis ATCC29212 Quality control strain for susceptibility test
Bacillus subtilis ATCC6633 Control strain for various assays
Gram negative bacteria
Escherichia coli ATCC25922 Quality control strain for susceptibility test C Host of bacteriophage ϕX174
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 Quality control strain for susceptibility test
Haemophilus influenzae ATCC49247 Quality control strain for susceptibility test
Serratia marcescens ATCC13880 Type strain
Fungi
Candida albicans ATCC10231 Quality control strain for various assays
Bacteriophage
ϕX174 Virulent phage for E. coli C
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notoginseng extract, PNE) 製剤 (イスクラ産業株式会社) は、1日3包 (3.0 g) 中に三七
人参エキス末、乳糖を含有している。 2.3. ディスク拡散法を用いた抗菌活性測定 種々の細菌に対する抗菌活性のスクリーニングは、1.2.と同様にディスク拡散法で行 った。 2.4. 増殖阻害活性の測定 MGS製剤又はPNE製剤含有、非含有培地に対し、一晩培養した菌液を100分の1とな る様に添加し、35°Cで振とう培養した。但し、肺炎球菌のみ静置で培養した。添加直 後、培養1時間後、2時間後、4時間後、6時間後の培養菌液を採取し、生理食塩水で希 釈した後、適切な増殖用培地に塗抹した。一晩培養後、発育したコロニー数を数え、 培地中のColony forming unit (CFU) を測定した。増殖が抑制された菌もしくは、
Streptococcus属菌に対する実験については、独立した日に3回以上行った。 2.5. Plaque assay MGS製剤について、抗ウイルス活性を評価するために bacteriophage の増殖に対す る作用を検討した。まず、MGS製剤と bacteriophage φX174を混合し、一定時間曝露さ せた。その後、混合液をPBSで、適切な倍率に希釈し、E. coli C 株および 0.75%寒天 と混合し、普通寒天培地上に重層した。一晩培養後、plaque の数を測定し、培養液中 の Plaque forming unit (PFU) を算出した。
2.6. 細胞毒性試験
ヒ ト 肺 胞 上 皮 細 胞 株A549 細 胞 を 10% Fatal bovine serum (Hyclone) 添 加 Eargle’s
minimum essential medium (EMEM: WAKO)で96 well plate (Iwaki)に1×104 cells/wellとな
るように播種した。次いで、MGS製剤をEMEMに懸濁し、10 mg/mL、20 mg/mLの濃
度で細胞に添加し、3時間、37°C、5% CO2 条件下で培養を行った。培養後にCellTiter
96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega)を用い、生存細胞を定量 した。
2.7. PNE製剤のS. intermediusと化膿レンサ球菌 (S. pyogenes) の共培養実験
PNE製剤については、S. intermedius ATCC27335を25 μg/mL rifampicin (WAKO) 含有
9
【
結 果 】
1. 生薬製剤の抗菌活性のスクリーニング 日本の市場に流通している一般用医薬品および健康食品を含む、中国医学処方に基 づく生薬製剤 25種を用いて、ディスク拡散法で抗菌活性のスクリーニングを行なっ た (Table 2)。対象微生物は、代表的なグラム陽性菌および陰性菌である黄色ブドウ球 菌 (S. aureus) と大腸菌 (E. coli)、市中の呼吸器感染症の起炎菌である肺炎球菌 (S.pneumoniae) やインフルエンザ菌 (H. influenzae) とした。その結果、大黄黄芩製剤、
銀翹解毒丸製剤ならびに田七人参製剤で阻止円の形成が認められた。このうち、銀翹 解毒丸製剤ならびに田七人参製剤では、呼吸器感染症起炎菌に対し効果が認められた ことから、この2つの製剤について詳細な解析を行った。
Table 2. Screening of antimicrobial activity
生薬製剤 生薬数含有 分類 Gram positive Gram negative
S. aureus S. pneumoniae E. coli H. influenzae
10 2. 銀翹解毒丸製剤のもつ抗微生物作用 2.1. ディスク法を用いた抗菌活性測定 銀翹解毒丸 (modified Gingyo-San, MGS) 製剤の抗菌活性について、さらに対象微生 物を拡大しディスク法で検討した (Table 3)。肺炎球菌 (S. pneumoniae)と化膿レンサ球 菌 (S. pyogenes)ではわずかな大きさの阻止円が形成されたが、それ以外のすべての菌 株で阻止円の形成は認められなかった。
Table 3. Inhibitory zone of modified Gingyo-san (MGS) containing paper diska
2.2. MGS製剤の増殖阻害活性
ディスク法は、簡便でスクリーニングには適しているが、培地への浸透度といった 被験物質の物性に依存するため、必ずしも抗菌活性があるものが阻止円を形成すると は言えない[14]。そこで、MGS製剤の持つ増殖抑制効果を検討するために、MGS製剤 存在または非存在下で被験菌を培養し、経時的に菌数を測定した。抗菌薬の検定菌と
して使用される 枯草菌 (Bacillus subtilis) ATCC6633株に対し、MGS製剤を添加したと
ころ、濃度依存的に菌数の低下が認められた (Fig. 2)。
Strain Inhibitory zone (mm)b
S. aureus JCM2874
- S. aureus N315
- S. pneumoniae ATCC49619 10.0
S. pneumoniae 19F 10.0
S. pyogenes JCM5674 8.5
E. faecalis ATCC29212
- B. subtilis ATCC6633
- E. coli ATCC25922
- P. aeruginosa ATCC27853
- H. influenzae ATCC49247
-a 8 mg/disk
b - , inhibitory zone not appeared (< 8 mm)
Strain Inhibitory zone (mm)b
Staphylococcus aureus JCM2874
-Staphylococcus aureus N315
-Streptococcus pneumoniae ATCC49619 10.0
Streptococcus pneumoniae 19F 10.0
Streptococcus pyogenes JCM5674 8.5
Enterococcus faecalis ATCC29212
-Bacillus subtilis ATCC6633
-Escherichia coli ATCC25922
-Pseudomonas aeruginosa ATCC27853
-Haemophilus influenzae ATCC49247
-a 8 mg/disk
b - , inhibitory zone not appeared (< 8 mm)
11
Fig. 2. Antibacterial effect of modified Gingyo-san against Bacillus subtilis ATCC6633
This experiment was performed twice on independent occasions and similar results were obtained. The date shown is representative of the results obtained.
本製剤は、1回2.4 gを約100 mL水で服用するため、飲用濃度は、約24 mg/mLであると
考えられる。すなわち、飲用濃度で直接的な抗菌作用があることが示された。 そこで、種々の微生物を用いて同様の検討を行った (Fig. 3)。その際、MGS製剤の濃 度はすべて20 mg/mLに統一した。その結果、市中及び院内肺炎の原因となる黄色ブド ウ球菌 (Staphylococcus aureus) や肺炎球菌 (S. pneumoniae)、腸球菌 (E. faecalis)、急性 咽頭炎の主要な原因菌である化膿レンサ球菌 (S. pyogenes) は、増殖が有意に阻害さ れた。さらにこの作用は、methicillin耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) やpenicillin耐性肺 炎球菌 (PRSP) といった薬剤耐性を保有する株に対しても認められた。すなわち、グ ラム陽性菌に対しては、増殖抑制作用を持つことが示された。一方で、グラム陰性菌 である大腸菌 (E. coli) や緑膿菌 (P. aeruginosa) に対しては、増殖抑制効果は全く認 められなかった。しかし、興味深いことに、上気道感染症の病原菌であるインフルエ ンザ菌 (H. influenzae) に対しては、グラム陰性菌であるにも関わらず有意な増殖抑制 作用が認められた。また、院内肺炎の原因菌となるその他のグラム陰性菌に属する
Acinetobacter baumanniiやSerratia marcescence、Klebsiella pneumoniaeに対しても効果を
示さなかった (date not shown)。
10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 0 2 4 6 8 10 Control 1.25 mg/mL 2.5 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL 20 mg/mL 100 1000 10000 100000 0 1 2 3 4 5 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 0 2 4 6 8 A. B.
C. albicans ATCC10231 bacteriophage φX174
MGS 0 mg/mL MGS 20 mg/mL
Incubation time (hr) Incubation time (hr)
12
Fig. 3. Antibactrial effects of modified Gingyo-san against several bacterial strains
A, S. aureus JCM2874; B, S. aureus N315 (MRSA); C, S. pneumoniae ATCC49619; D, S. pneumoniae
19F (PRSP); E, S. pyogenes JCM5674; F, E. faecalis ATCC29212; G, E. coli ATCC25922; H, P. aeruginosa ATCC27853; and I, H. influenzae ATCC49247. Each experiment was performed three times on independent occasions. The P value was calculated by Welch’s t-test. ** P < 0.01, * P < 0.05
A. B.
S. aureus JCM2874 S. aureus N315
C. D.
S. pneumoniae ATCC49619 S. pneumoniae 19F
E. F.
S. pyogenes JCM5674 E. faecalis ATCC29212
G. H.
E. coli ATCC25922 P. aeruginosa ATCC27853
13 2.3. MGS製剤の真核生物とbacteriophageに対する作用 MGS製剤の真核生物に対する作用およびウイルスに対する作用を検討するために、 モデルとして真菌であるCandida albicansとbacteriophageを用いて阻害活性の検討を行 った (Fig. 4)。いずれの場合においても、MGS製剤の作用は認められなかった。また、 ヒト肺胞上皮細胞株であるA549細胞に対しても、毒性は認められなかった (Fig. 5)。 以上のことから、真核細胞やウイルスには直接的な増殖阻害活性や毒性はないことが 明らかとなった。
Fig. 4. Antifungal and antibacteriophage effects of modified Gingyo-san (MGS)
A, C.albicans ATCC10231 and B, bacteriophage φX174. Each experiment was performed 3 times on
independent occasions and similar results were obtained.
Fig. 5. Effect of modified Gingyo-san (MGS) on A549 cell
Proliferation activity was evaluated. Each experiment was performed 3 times on independent occasions.
10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 0 2 4 6 8 10 Control 1.25 mg/mL 2.5 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL 20 mg/mL 100 1000 10000 100000 0 1 2 3 4 5 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 0 2 4 6 8
A.
B.
C. albicans ATCC10231 bacteriophage φX174
MGS 0 mg/mL MGS 20 mg/mL
Incubation time (hr) Incubation time (hr)
14
3. 田七人参製剤のもつ抗微生物作用
3.1. ディスク法を用いた抗菌活性測定
田七人参エキス (Panax notoginseng extract, PNE) 製剤についても、さらに対象微生物 を増やしディスク拡散法を用いて抗菌活性の測定を行った (Table 4)。種々の菌を用い て検討したところ、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌 (S. aureus)、枯草菌 (B. subtilis)、 グラム陰性菌の緑膿菌 (P. aeruginosa)、大腸菌 (E. coli)に対し阻止円の形成は認めら
れなかった。一方、グラム陽性菌の化膿レンサ球菌 (S. pyogenes)、肺炎球菌 (S.
pneumoniae)、B群レンサ球菌 (S. agalactiae)、グラム陰性菌のインフルエンザ菌 (H. influenzae)では阻止円が出現した。
Table 4. Inhibitory zone by P. notoginseng extract (PNE) containing paper disk
3.2. PNE製剤の増殖抑制効果
ディスク拡散法は先述したように薬剤の物性に影響する[14]。したがって、PNE製剤
に対しても増殖阻害活性を検討した。PNE製剤の飲用濃度は約20 mg/mLであるが、半
量の10 mg/mLに統一した。PNE製剤は、化膿レンサ球菌 (S. pyogenes)、肺炎球菌 (S.
pneumoniae)、S. mitis、インフルエンザ菌 (H. influenzae) に対し、有意に増殖を抑制す
ることが明らかになった (P < 0.01, Fig. 6)。一方、黄色ブドウ球菌 (S. aureus)、枯草菌 (B. subtilis)、大腸菌 (E. coli) の増殖を阻害しなかった (Fig. 6)。また興味深いことに、 化膿レンサ球菌 (S. pyogenes) や肺炎球菌 (S. pneumoniae)と同じStreptococcus属の口
腔内レンサ球菌であるS. intermedius、S. anginosus、S. salivariusの増殖阻害作用は認め
られなかった。
Strain Inhibition zone
(mm)* S. aureus JCM2874 -S. aureus N315 -S. pneumoniae R6 11.0 S. pyogenes JCM5674 11.5 S. agalactiae JCM5671 11.0 B. subtilis ATCC6633 -E. coli ATCC25922 -P. aeruginosa ATCC27853 -H. influenzae ATCC49247 13.3 * > 8 mm, antimicrobial activity (+); -, zone did not appear
Strain Inhibition zone (mm)*
Staphylococcus aureus JCM2874
-Staphylococcus aureus N315
-Streptcoccus pneumoniae R6 11.0
Streptcoccus pyogenes JCM5674 11.5
Streptcoccus agalactiae JCM5671 11.0
Bacillus subtilis ATCC6633
-Escherichia coli ATCC25922
-Pseudomonas aeruginosa ATCC27853
-Haemophilus influenzae ATCC49247 13.3 * > 8 mm, antimicrobial activity (+); -, zone did not appear
Strain Department Specimen Inhibition zone (mm)* P value**
Aerobic Anaerobic
S. pyogenes clinical isolate
GAS48 Otorhinolaryngology Pus 10.37 ± 0.45 12.47 ± 0.34 0.014
GAS196 Otorhinolaryngology Pus 12.93 ± 1.01 13.40 ± 0.78 0.712
GAS215 Obstetrics and Gynecology Vaginal swab 10.37 ± 0.42 11.67 ± 0.94 0.190
GAS256 Pediatrics Sputum 10.23 ± 0.12 12.23 ± 0.82 0.093
GAS259 Otorhinolaryngology Pus 10.67 ± 0.24 12.40 ± 0.37 0.010
GAS293 Transplant surgery Sputum 10.37 ± 0.45 12.30 ± 0.70 0.013
S. pyogenes JCM5674 11.50 ± 0.33 12.40 ± 0.16 0.016 * > 8 mm, antimicrobial activity (+) ; Mean ± SD , ** P value was calculated by Student's t-test.
15 Fig. 6. Growth inhibition assays in several species
A, S. aureus JCM2874; B, S. aureus N315; C, S. pyogenes JCM5674; D, S. pneumoniae R6; E, S.
intermedius ATCC27335; F, S. salivarius JCM5707; G, S. anginosus JCM12993; H, S. mitis JCM17971; I, B.subtilis ATCC6633 ; J, H.influenzae ATCC49247; K, E.coli ATCC25922. The experiments for S. pyogenes, S. pneumoniae, S. intermedius, and H.influenzae were independently performed 3 times, and the date are presented as the means ± SDs. P values were calculated using Welch’s t-test. * P < 0.05; ** P < 0.01.
A. B. C.
S. aureus JCM2874 S. aureus N315 S. pyogenes JCM5674
D. E. F.
S. pneumoniae R6 S. intermedius ATCC27335 S. salvarius JCM5707
G. H. I.
S. anginosus JCM12993 S. mitis JCM17971 B. subtillis ATCC6633
J. K. Incubation time (hr)
H. influenzae ATCC49247 E. coli ATCC25922
PNE 0 mg/mL PNE 10 mg/mL
16 3.3. 臨床分離株に対する抗菌活性 本実験は、PNE製剤の飲用濃度で試験を行ったが、このような高濃度が肺などの各局 所器官に移行するとは考えられにくい。そこで、比較的高濃度の接触が可能な嗽薬や スプレー剤、外用薬としての利用を考え、急性咽頭炎や伝染性膿痂疹の起因菌である 化膿レンサ球菌をターゲットにし、詳細な解析を行った。化膿レンサ球菌の臨床分離 株に対する有効性を検討するために2013年から2014年に喀痰や膿から分離された化 膿レンサ球菌臨床分離株を用いてディスク拡散法を行った (Table 5)。 その結果、試験した全ての臨床分離株で阻止円が認められた。また、その阻止円は 嫌気時の方が有意に大きかった。一般的に、化膿レンサ球菌は好気培養時と比較して 嫌気培養時の方が病原性が高いといわれている[15, 16]。すなわちPNE製剤は臨床分離 株にも抗菌活性を示し、また様々な状態の本菌に広く有用であること示唆された。化 膿レンサ球菌臨床分離株に対しても短時間での抗菌活性を検討するために、臨床分離 株の中で、GAS48とGAS196に対する増殖抑制効果を測定した。その結果、PNE製剤は いずれに対しても増殖を抑制した (Fig. 7)。また、GAS48に対しては静菌的に作用し、 GAS196に対しては大幅に増殖を抑制し、殺菌的に働いた。したがって、PNE製剤は化 膿レンサ球菌全体に効果を示すことが示された。
Table 5. Inhibition zone by P. notoginseng (PNE) containing paper disk
Strain Inhibition zone
(mm)* S. aureus JCM2874 -S. aureus N315 -S. pneumoniae R6 11.0 S. pyogenes JCM5674 11.5 S. agalactiae JCM5671 11.0 B. subtilis ATCC6633 -E. coli ATCC25922 -P. aeruginosa ATCC27853 -H. influenzae ATCC49247 13.3
* > 8 mm, antimicrobial activity (+); -, zone did not appear
Strain Inhibition zone (mm)*
Staphylococcus aureus JCM2874
-Staphylococcus aureus N315
-Streptcoccus pneumoniae R6 11.0
Streptcoccus pyogenes JCM5674 11.5
Streptcoccus agalactiae JCM5671 11.0
Bacillus subtilis ATCC6633
-Escherichia coli ATCC25922
-Pseudomonas aeruginosa ATCC27853
-Haemophilus influenzae ATCC49247 13.3
* > 8 mm, antimicrobial activity (+); -, zone did not appear
Strain Department Specimen Inhibition zone (mm)* P value**
Aerobic Anaerobic
S. pyogenes clinical isolate
GAS48 Otorhinolaryngology Pus 10.37 ± 0.45 12.47 ± 0.34 0.014
GAS196 Otorhinolaryngology Pus 12.93 ± 1.01 13.40 ± 0.78 0.712
GAS215 Obstetrics and Gynecology Vaginal swab 10.37 ± 0.42 11.67 ± 0.94 0.190
GAS256 Pediatrics Sputum 10.23 ± 0.12 12.23 ± 0.82 0.093
GAS259 Otorhinolaryngology Pus 10.67 ± 0.24 12.40 ± 0.37 0.010
GAS293 Transplant surgery Sputum 10.37 ± 0.45 12.30 ± 0.70 0.013
S. pyogenes JCM5674 11.50 ± 0.33 12.40 ± 0.16 0.016
* > 8 mm, antimicrobial activity (+) ; Mean ± SD , ** P value was calculated by Student's t-test.
17
Fig. 7. Growth inhibition of clinical S. pyogenes isolates by P. notoginseng extract (PNE)
A, GAS48; B, GAS 196. Each experiment was independently performed 3 times, and the date are
presented as the means ± SDs. P values were calculated using Welch’s t test. * P < 0.05; ** P < 0.01.
3.4. 口腔内レンサ球菌S. intermediusと化膿レンサ球菌の共培養時におけるPNE製剤 の影響 常在菌は体内に侵入した病原菌の増殖を抑えるなどの重要な免疫作用を担っている [17, 18]。しかし、抗菌薬は常在菌に対しても抑制作用を持っている[19]。加えて、肺 炎球菌などは抗菌薬が常在菌を溶菌させることで DNA が放出され、その DNA を獲 得することで、抗菌薬に耐性化した例が報告されている[20]。つまり、抗菌薬には常 在菌に影響せず、病原菌のみに選択的に作用することが必要とされる。PNE 製剤は化 膿レンサ球菌に抗菌活性を示したが、同じ Streptococcus 属の口腔内常在菌である S.
intermedius、S. salivarius、S. anginosus には増殖抑制効果を示さなかった (Fig.6)。した
がって、PNE 製剤は常在菌には影響を与えず、病原菌特異的に抗菌活性を示すのでは ないかと仮説を立てた。化膿レンサ球菌とS. intermedius を PNE 製剤の存在下ならび に非存在下で共培養し、それぞれの菌数を測定した (Fig. 8A)。PNE 製剤非存在下で はS. intermedius、化膿レンサ球菌ともに菌数が増加し、培養 6 時間後には化膿レンサ 球菌の割合が 50%以上を占めた (Fig. 8B)。しかし、PNE 製剤存在下では化膿レンサ 球菌の増殖が選択的に抑制され、時間依存的に S. intermedius の割合が増加した。ま
た、S. intermedius に着目すると、PNE 製剤非存在下よりも PNE 製剤存在下の方が有
意に増殖したことが明らかとなった (Fig. 8A)。以上より、PNE 製剤は口腔内常在菌 には影響を与えにくく、化膿レンサ球菌のみに特異的に作用することが示唆された。 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 0 1 2 3 4 5 6 7 * * *
A.
B.
GAS48 GAS196 PNE 0 mg/mL PNE 10 mg/mLIncubation time (hr) Incubation time (hr)
18
Fig. 8. Streptococcus pyogenes-specific growth inhibitory effects of P. notoginseng extract (PNE) A, Bar graphs of viable bacteria in co-culture analysis. This experiment was independently performed
3 times, and data are presented as the means ± SDs. p values were calculated using Welch’s t-test.
B, The percentages of S. intermedius and S. pyogenes in the presence or absence of PNE.
* P < 0.05; ** P < 0.01. 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 0 1 2 3 4 5 6 7 * * *
A.
B.
GAS48 GAS196 PNE 0 mg/mL PNE 10 mg/mL Incubation time (hr) Incubation time (hr)V ia bl e ba ct eri a (CF U /m L ) 109 108 107 106 105 104 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 0 1 2 3 4 5 6 7 * * ** *** 108 107 106 105 104 103 102 10
A.
PNE 0 mg/mL PNE 10 mg/mL S. pyogenes S. intermediusIncubation time (hr) Incubation time (hr) 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 0 1 2 4 6 * 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 0 1 2 4 6 ** V ia bl e ba ct eri a (CF U /m L ) 1010 109 108 107 106 105 104 1010 109 108 107 106 105 104
B.
PNE 0 mg/mL PNE 10 mg/mLS. intermedius S. pyogenes S. intermedius S. pyogenes
S. pyogenes S. intermedius Fraction of bacteria (%) Fraction of bacteria (%)
19
【
考 察 】
本章では、中国医学処方に基づいた生薬製剤25種類の中から市中呼吸器感染症に使 用できる製剤を探索するために、抗菌活性のスクリーニングを行った。その結果、大 黄黄芩製剤、MGS製剤ならびにPNE製剤で阻止円が認められた。その中で、市中呼吸 器感染症起炎菌である肺炎球菌やインフルエンザ菌に抗菌活性を示したMGS製剤と PNE製剤に注目し、各種の抗微生物作用を検討した。 まず、MGS製剤は、一般用医薬品 (第2類医 薬品) として市場に流通している (Fig. 9)。 その効能には、かぜによるのどの痛み、口・ のどの渇き、せき、頭痛と記載されている。 また、中国医学古典の「温病条弁」に記載さ れている銀翹散に基づく処方で、Table 6に 示す通り、10種類の生薬 (金銀花き ん ぎ ん か、連翹れんぎょう、 甘草か ん ぞ う、桔梗き き ょ う、薄荷は っ か、牛蒡子ご ぼ う し、荊芥け い が い、淡豆豉た ん と う し、 淡竹葉た ん ち く よ う、羚羊角れ い よ う か く) から構成されている。本製 剤は、中国医学領域では初期感冒や呼吸器 感染症などに使われてきた。 本研究より、MGS製剤は、市中及び院内における呼吸器感染症の原因となるグラム 陽性菌に対して、広く増殖阻害活性を示すことが明らかになった。一方、グラム陰性 菌に対してはインフルエンザ菌を除き抗菌活性を示さなかった。MGS製剤の菌種間で の作用の違いは、表層構造に依存していると考えられる。グラム陰性菌は、陽性菌と 表層構造が異なり、細胞壁の外側に脂質からなる外膜を保有している。外膜は、薬物 の透過性に大きく影響を与えていることが知られている[21]。さらに、グラム陰性菌 は、細胞膜に薬剤排出タンパクを複数持っており、菌体内の薬物を菌体外に排出して いる[22]。そのため、MGS製剤はこれらの要因でグラム陰性菌に効果を示さなかった のではないかと考えられる。一方、インフルエンザ菌は、他のグラム陰性菌と比較し て細胞の表層構造が異なっていることが知られている[23]。また、他のグラム陰性桿 菌と比較し、染色体性排出タンパク質が少ない[24]。このことが、グラム陰性菌であ るにもかかわらず、インフルエンザ菌に殺菌活性が認められたことに関連していると 考えられる。また、薬剤耐性菌にも効果を示したことから、既存の抗菌薬とは異なる 経路で微生物の増殖を阻害していると考えられる。 市中の呼吸器感染症の主要な起炎菌として、肺炎球菌、インフルエンザ菌が知られ ている[25]。また、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌なども、鼻咽頭に疾患を引き起Fig. 9. modified Gingyo-san (MGS)
20 こす。そのため、MGS製剤がこれらの菌に対して、阻害活性を示すということは、MGS 製剤の経験則に基づく使用法と合致していると考えられる。 また、類似処方である銀翹散製剤は、これまでに抗炎症作用や間接的な抗ウイルス 作用を持つことが報告されている[26, 27]。すなわち、本研究で示したMGS製剤の薬剤 耐性菌を含む呼吸器感染症起炎菌に対する直接的な抗菌作用と合わせると、呼吸器感 染症起炎菌ならびにウイルス双方に効果を示しうると考えられる。 したがって、MGS製剤の本研究結果は、呼吸器感染症の治療選択における科学的エ ビデンスとなり得ると考えられる。しかし、本製剤はあくまでも直接的な作用である。 すなわち、体内で代謝を受けて効果を示すか否かについては、今後の検討課題である。 PNE 製剤は、ウコギ科の三七 Panax notoginseng を基原植物とし、根を乾燥させたも のを製剤化し、国内市場に健康食品として流通している(Fig 10.)。 田七人参は、古くから中国医学領域にお いて、化瘀止血薬に分類され、「甘、微苦, 温。帰肝、胃経。」の薬性をもち、止血作 用、化瘀か お作用、止痛作用、消腫作用の4 種 の薬能をもつと言われてきたことから、 近年、冠状動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、 慢性肝炎、急性肝炎などに応用されてい る。また、200 以上の成分が含まれてお り、それぞれ抗腫瘍効果、血糖降下作用 などが報告されている[28, 29]。 しかし、これまでPNE 製剤の細菌に対する作用は知られていなかった。本研究によ り、PNE 製剤が、肺炎球菌やインフルエンザ菌といった呼吸器感染症起炎菌ならびに、 咽頭扁桃炎の主要な原因菌である化膿レンサ球菌に抗菌活性があることが明らかに なった。本実験は、このうち比較的高濃度の薬液と接触しうる急性咽頭炎や伝染性膿 痂疹の起因菌である化膿レンサ球菌をターゲットにし、詳細な解析を行った。 増殖培地における、増殖抑制効果を測定したところ、PNE 製剤は化膿レンサ球菌の 増殖を有意に阻害した。さらに、化膿レンサ球菌臨床分離株に対しても検討を行った ところ、すべてに対し抗菌活性を示した。そのため PNE 製剤が臨床においても広く 有用であることを示唆している。一方、他のレンサ球菌として、口腔内常在性のレン
サ球菌であるS. mitis、S. intermedius、S. salivarius、S. anginosus に対する増殖阻害活性
を評価したところ、S. mitis 以外の増殖に影響は認められなかった。
Fig. 10. Panax notoginseng extract (PNE)
24
【
方 法 】
1. 使用菌株
本実験には、Table 7に示した菌株を使用した。それぞれの菌株は、第1章と同様に培 養した。また、これらの菌株は、15% glycerolあるいは10% skim milk培地中で、-80°C で使用まで保存された。
Table 7. Bacterial strains used in this study
2. 感受性測定
抗菌薬感受性測定は、Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) の基準に従い 微量液体希釈法で最小発育阻止濃度 (Minimum inhibitory concentration, MIC) を測定し た[33]。測定には、抗菌薬としてampicillin (WAKO)、cefdinir (Tokyo Chemical Industry)、 fosfomycin Aldrich)、clarithromycin (Tokyo Chemical Industry)、doxycycline (Sigma-Aldrich)、levofloxacin (Tokyo Chemical Industry) を用い、生薬製剤としてイスクラ涼解
Species Strain Description
Staphylococcus aureus JCM2874 Susceptibility test control strain
2011.28 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2011.80 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2013.8 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2016.5 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2016.7 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2016.39 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2016.102 Clinical isolate, levofloxacin resistant 2016.161 Clinical isolate, levofloxacin resistant
Streptococcus pnuemoniae ATCC49619 Susceptibility test control strain
SP3008 Clinical isolate, levofloxacin resistant
Escherichia coli JCM5491 Susceptibility test control strain
2661 Clinical isolate, levofloxacin resistant
BW25113 Parent strain of KEIO collection
ΔmdtF KEIO collection
ΔacrB KEIO collection
ΔacrD KEIO collection
ΔemrY KEIO collection
ΔemrB KEIO collection
ΔtolC KEIO collection
ΔmdtB KEIO collection
ΔacrE KEIO collection
Klebsiella pneumoniae JCM1662 Type strain
Proteus mirabilis JCM1669 Type strain
Haemophilus influenzae Rd Well-characterized strain
25
楽 (株式会社イスクラ産業) を用いた。本製剤は1日量3包 (7.2 g) 中に4.7 gの涼解楽 エキス末を服用する。また添加物として乳糖とステアリン酸マグネシウムを含有する。
3. Checkerboard法による併用効果
菌株は、感受性測定と同様に準備し、薬剤は、Mueller-Hinton broth を用い希釈した。
チェッカーボードは、96 well microplate (Stem) に抗菌薬は縦に、MGS 製剤は横に 2 倍
希釈となるように作成した (Fig. 11)。MGS 製剤と抗菌薬の併用効果は fractional inhibitory concentration (FIC) index を算出し、相加相乗効果を判定した[34]。FIC index
は以下の式より算出した。判定値として、FIC index ≤ 0.5 を相乗効果 (synergetic effect)、
0.5 < FIC index ≤ 1.0 を相加効果 (addictive effect)、1.0 < FIC index ≤ 2.0 を不関 (indifferent index)、2.0 < FIC index を拮抗作用 (antagonistic effect) と判定した (Fig. 12)。本実験
は、独立した日に少なくとも3 回行った。
Fig. 11. Experimental scheme of checkerboard assay
Fig. 12. FIC index 算出法
FIC index ＝ 抗菌薬のMIC (併用時) + 銀翹解毒丸製剤のMIC (併用時) 抗菌薬のMIC (単剤) 銀翹解毒丸製剤のMIC (単剤) 14
Modified Gingyo-san (MGS) Antimicrobial agent Checkerboard plate
High Low
+
→
Concentration Concentration High LowFIC index ＝抗菌薬のMIC(併用時)+銀翹解毒丸製剤のMIC(併用時)
抗菌薬のMIC(単剤) 銀翹解毒丸製剤のMIC(単剤)
26
【
結 果 】
1. MGS製剤はキノロン耐性黄色ブドウ球菌に対するquinoloneの作用を増強する
MGS 製剤と抗菌薬の相互作用を検討した。グラム陽性菌の基準として、黄色ブドウ
球菌を用いて相互作用の解析を行った。抗菌薬と相互作用を解析したところ、b-lactam
系の ampicillin と cefdinir、tetracycline 系の doxycycline、macrolide 系のclarithromycin では相乗効果、相加効果は認められなかった。しかし、quinolone 系の levofloxacin と 併用した場合、quinolone 高度耐性株 ( > 128 mg/L) で FIC index が 1 未満となり相乗 効果が認められた (Table 8)。一方、levofloxacin の MIC が 8 と 0.125 mg/L の菌株で は、一部相加効果が認められたが相乗効果は認められなかった。
ついで、呼吸器感染症起炎菌である肺炎球菌およびインフルエンザ菌で検討したと ころ、quinolone感受性株、耐性株とも相乗効果は認められなかった。インフルエンザ 菌のquinolone耐性株に対しては、むしろ拮抗作用が認められた。
Table 8. Combination effects of modified Gingyo-san (MGS) and levofloxacin
27
2. MGS製剤はグラム陰性菌に対してはquinolone系薬と拮抗する
インフルエンザ菌に対し拮抗作用が認められたため、グラム陰性菌について、併用 効果の検討を行った (Table 8)。その結果、肺炎桿菌 (K. pneumoniae) では拮抗作用は 認められなかったが、大腸菌 (E. coli) やP. mirabilisについてはquinolone耐性の有無に かかわらず強い拮抗作用が認められた。 グラム陰性菌は、グラム陽性菌と比較し薬剤を排出する膜タンパクが多いことが知 られている[35, 24]。そこで、この拮抗作用と薬剤排出ポンプの関連を検討するために、 大腸菌の薬剤排出ポンプ欠損株のシリーズを用い拮抗作用の有無を検討した (Table 9)。その結果、acrB欠損株では、拮抗作用が認められたもののその作用は減少した。 また、AcrBを含めた多くの薬剤排出タンパクと複合体を形成し、排出に関与している TolCの欠損株では、FIC indexが2.0と拮抗作用は消失した。すなわち、本拮抗作用には AcrAB-TolC 排出ポンプが関与していることが明らかとなった。
Table 9. Relationship between combination effect and efflux pump of Escherichia coli
28
【
考 察 】
本章では、MGS製剤と抗菌薬の相互作用に焦点をあて検討した。MGS製剤はグラム
陽性菌の中でも、quinolone高度耐性黄色ブドウ球菌に対し、levofloxacinと相乗効果を
示した。levofloxacinは、DNA gyraseやtopoisomerase IVに作用することで抗菌活性を示
すため、これらのアミノ酸置換が起こることで耐性化することが知られている[36]。 臨床で分離される黄色ブドウ球菌は、levofloxacinに対して耐性化が進んでおり、治療 に使用されることはほとんどない。しかしながら、黄色ブドウ球菌は多剤耐性化が進 んでいるため、治療薬の選択肢を増やすことは極めて重要である。そのため、MGS製 剤の作用部位を明らかにすることができれば、治療の選択肢を増やすことができる可 能性が考えられる。 一方、グラム陰性菌については、拮抗作用を示すことが明らかとなった。この機序 として、多くのグラム陰性菌が染色体上に保有する異物排出系が関与していることが 示された。異物排出系の中でも、AcrABは、菌の内膜に存在し、多くの抗菌薬が基質 となることから多剤排出に関与していることが知られている (Fig.13) [35]。
Fig. 13. Chromosomal multidrug efflux pump of E. coli
30
第
3
章
白花蛇舌草
び ゃ っ か じ ゃ ぜ つ そ う製剤のもつ抗バイオフィルム阻害活性
【
緒 言 】
第1章、第2章において、中国医学領域で呼吸器感染症の治療に用いられる銀翹解毒 丸製剤の呼吸器感染症起炎菌に対する抗菌活性を明らかにした。呼吸器感染症治療に おいて、銀翹解毒丸製剤は、しばしば他の薬剤と併用される。その一つに白花蛇舌草 エキス製剤がある。 白花蛇舌草エキス (OdiE) 製剤 は、アカネ科フタ バムグラ Oldenlandia diffusaの根を含む全草を加工 したものであり、日本では健康食品として市場に流 通している(Fig.14)。中国医学の領域では清熱薬に 分類される。また、臨床では炎症性疾患に使用され ているほか、先述したように、呼吸器感染症におい て他の感染症治療に用いる製剤と併用して補助的 に経口投与 (12-24 g/day) される。また、これまで の研究で、白花蛇舌草は抗腫瘍作用や肝解毒作用、 血液循環促進作用、食細胞機能促進作用など があることが知られている[40, 41]。 呼吸器感染症の主要な起炎菌として、インフルエンザ菌や肺炎球菌がある。このう ち、肺炎球菌による感染症は、ワクチンの定期接種化に伴い減少しており、インフル エンザ菌による感染症の割合が相対的に増加している[42, 43]。インフルエンザ菌によ る中耳炎や副鼻腔炎は、小児において、慢性化や難治化することがある[44]。この難 治化には、菌の薬剤耐性化に加えて、菌の形成するバイオフィルムが関連している可 能性が示唆されている (Fig.15) [45]。したがって、インフルエンザ菌のバイオフィル ム形成を阻害することは、疾患の難治化、慢性化を防止する上で重要である。インフ ルエンザ菌のバイオフィルム形成は、luxSが関与するautoinducer 2 (AI-2) を介したも のと、クオラムセンシングに関与する二成分制御系であるqseBCを介したものが知ら れている (Fig.16)。Fig.14. Oldenlandia diffusa Extrat (OdiE)
31
Fig. 15. Biofilm formation step
Fig. 16. Two pathway of biofilm formation of H. influenzae
本研究では、OdiE製剤が有する感染症に対する作用の基礎的エビデンスの構築を目 的とし、呼吸器感染症起炎菌の中でもインフルエンザ菌に注目し臨床分離株に対する 増殖抑制作用およびバイオフィルム形成に対する阻害作用を検討した。
Planktonic bacteria Attachment Immature biofilm Mature biofilm
Matrix
Autoinducer-2 (AI-2) dependent pathway QseBC dependent pathway LuxQ LuxS AI-2 Membrane Membrane QseC QseB
Induction of biofilm-associated genes Biofilm formation
Environmental signal
↑
Phospholyration32
【
方 法 】
1. 使用菌株及び培養条件 インフルエンザ菌は、2013年に東京医科大学八王子医療センターにおいて、呼吸器 感染症患者の鼻腔から分離された無莢膜型のバイオフィルム高形成臨床分離株2013-86株を用いた[46, 47]。また、他のバイオフィルム形成株として、同病院から2011年に 分離された2011-130株および2013年に分離された2013-28株を用いた[46, 47]。インフ ルエンザ菌の標準株は、ATCC49247株を用いた。菌株は、チョコレート寒天培地ある いはsBHI brothを用いて培養した。培養条件は、AnaeroPack®-MicroAnaero (株式会社ス ギヤマゲン)を使用し、5~10% CO2存在下、35°Cとした。AI-2の定量には、American Type Culture Collection (ATCC) から購入したVibrio herveyii
ATCC BAA-211株を使用した。この菌株は、0.3 M NaCl、0.05 M MgSO4、0.2% (w/v)
casamino acid (WAKO) に、10 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7.0)と1 mM L-arginine、1% (v/v)
glycerolを添加した培地 (autoinducer bioassay medium, AB medium) を用いて、30°Cで 培養した[48]。
2. 使用薬剤
33
4. Crystal violet染色によるバイオフィルムの定量
sBHI broth で一晩培養した菌液を 100 倍に希釈し、96 well microtiter plate (Iwaki) に 100 µL ずつ添加し、OdiE 製剤を 2.5、5、10、20 mg/mL の濃度になるよう添加し、35°C で24 時間培養した。その後、培養上清を除去し、200 µL の PBS で 3 回洗浄して浮遊 菌を除去した。次いで、残存しているバイオフィルムを0.1% crystal violet で 20 分間染 色し、PBS で 3 回洗浄した。その後、それぞれの well に 95% ethanol 200 µL を添加し、各 well の吸光度 (630 nm) を測定することでバイオフィルムを定量した[49]。試験はそれぞ れにつき5 well ずつ行い、独立した日に 3 回以上行った。 バイオフィルムを剥離する作用の検討は、上述のようにバイオフィルムを形成させ、浮 遊菌を取り除いた後、新しいsBHI broth に懸濁させたOdiE製剤を2.5、5、10、20 mg/mLの 濃度になるよう添加し、再度35°Cで3、6、24時間培養した。その後、上記と同様に残存し たバイオフィルムをcrystal violetで染色し、残存バイオフィルム量を測定した。それぞれ の実験は、独立した日に少なくとも3回行った。
5. 半定量的Reverse transcription-PCR (RT-PCR) 法によるluxSとqseCの転写量の解析
バイオフィルム形成に関与する遺伝子のmRNA転写量を比較するために、半定量的RT-PCRを行った[46, 47]。菌株のRNAは、一晩培養した菌液を100分の1となる様にsBHI broth
に添加し、20 mg/mLとなるように白花蛇舌草を添加して、培養直後、1、2、4、6、12時間
培養したインフルエンザ菌からTotal RNAを抽出した。Total RNAの抽出には、High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) を用いた。cDNAの作成は、PrimeScript®Ⅱ 1st strand
cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) を用いて行った。PCR法により、作成したcDNA上のluxSと
qseC を 検 出 し た 。 プ ラ イ マ ー は 、 GyrB-F (GGAAAATCCTGCAGATGC) 、 GyrB-R
34
6. Viblio harveyii ATCC-BAA211を用いたAI-2の定量
インフルエンザ菌をsBHI brothで一晩振とう培養し、AI-2の持ち込みを避けるため、菌体 を集菌し、新しいsBHI brothで再懸濁した。再懸濁した菌液をsBHI brothで100倍に希釈し、 OdiE製剤は10 mg/mL、20 mg/mLとなるように添加し、さらに2時間振とう培養した。2時 間後、遠心分離して得られた上清を0.45 µmのメンブランフィルターを用いて濾過し、サ ンプルとした。
V. harveyi ATCC BAA-211 は、AB medium で一晩培養した後、新しい AB medium で 5,000
倍になるように希釈した。希釈した菌を96 well black plate (Stem)に 100 µL ずつ添加し、
BHI で 2 分の 1 に希釈したインフルエンザ菌の上清を 10 µL 加えた。30°C で 5 時間培養
し、ルミノメーターで生物発光を測定することでAI-2 の定量を行った。それぞれの実験
は、独立した日に少なくとも3 回行った。
7. 統計学的解析
35
【
結 果 】
1. 増殖阻害活性の測定 OdiE製剤がインフルエンザ菌の増殖を抑制するかを検討するために、飲用濃度の20 mg/mLと半分量の10 mg/mLの白花蛇舌草存在下または非存在下で被検菌を培養し、経 時的に菌数を測定した (Fig. 17)。培養4時間後に菌数の減少が認められたが、その後 はいずれの薬剤濃度においても非添加群とほとんど差は見られなかった。すなわち、 OdiE製剤は、インフルエンザ菌の増殖に対し直接影響を及ぼさないことが明らかとな った。また、初期接種菌量を103に減量しても同様の結果が得られた。Fig. 17. Growth of H. influenzae with or without Oldenlandia diffusa extract (OdiE)
Each experiment was performed three times on separate occasions, and the data are shown as the mean +SD. The P value was calculated by the Welch's t-test.
2. Crystal violet染色によるバイオフィルムの定量 OdiE製剤のバイオフィルム形成阻害作用を検討するために、クリスタルバイオレッ トによる染色を行い、バイオフィルムを定量した (Fig. 18)。その結果、インフルエン ザ菌のバイオフィルム形成量は、OdiE製剤の濃度依存的に有意に減少した (P < 0.01)。 また、実際に形成されたバイオフィルムの形状を観察するために、1,000倍の光学顕微 鏡を用いて観察したところ、薬剤非存在下で培養したものと比較し、20 mg/mLのOdiE 製剤存在下で培養したものは明らかに菌数が少なく、バイオフィルムの形成が抑制さ れていることが明らかとなった (Fig. 19)。 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 0 1 2 4 6 8 12 24 1010 109 108 107 106 105 104 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 1E+11 0 1 2 4 6 8 12 24 1011 1010 109 108 107 106 105 104
36
Fig. 18. Biofilm formation assay
Biofilm formation of H. influenzae 2013-86 with or without OdiE. The upper panel shows a photograph of each well after adding 95% ethanol. Each experiment was performed three times on separate occasions, and the data are shown as the mean ± SD. P values were calculated by the Student's t-test. Dotted line shows the cutoff value for biofilm formation in this study.
Fig. 19. Phase-contrast light microscopic images of H. influenzae 2013-86 (magnification ×1,000)
H. influenzae 2013-86 was cultured in a 24-well plate, and each well was washed with PBS three times to remove planktonic bacteria. A, without OdiE; B, with 20 mg/mL of OdiE.
次に、一度形成したバイオフィルムを剥離させる活性の有無について検討するため に、形成させたバイオフィルムに対してOdiE製剤を添加し、残存しているバイオフィ ルムの量を測定した。その結果、いずれの薬剤濃度、培養時間で培養した場合でも、 バイオフィルムの量は減少しなかった (Fig. 20)。したがって、OdiE製剤はインフルエ ンザ菌のバイオフィルム形成を抑制するが、一度形成されたバイオフィルムを剥離さ せる作用はないことが示された。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 2.5 5 10 20
37
Fig. 20. Exfoliative activity of OdiE on biofilm of H. influenzae 2013-86
A, analysis scheme; B, 3 hr after adding OdiE; C, 6 hr after adding OdiE; D, 24 hr after adding OdiE.
Each experiment was performed three times on separate occasions, and the data are shown as the mean ± SD. The P value was calculated by the Student's t-test.
3. 半定量的RT-PCR法によるlusSとqseCの転写量の解析
インフルエンザ菌のバイオフィルム形成は、luxS が関与する AI-2 を介したものと、
クオラムセンシングに関与する二成分制御系である qseBC を介したものが知られて
いる[50, 51]。このため、RT-PCR 法により、この 2 つの遺伝子の mRNA 転写量に OdiE 製剤が及ぼす影響を経時的に調査した (Fig. 21)。OdiE 製剤添加直後の 1 時間後、2 時
間後のサンプルにおいて、qseC に変化はみられなかった。一方、luxS の mRNA は非
添加時よりも、有意に減少していた (P < 0.05)。しかし、6 時間後では遺伝子発現量に 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 3hr 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 6hr 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 24hr 0 Op tic al d en si ty ( 63 0 nm ) Op tic al d en si ty ( 63 0 nm ) Op tic al d en si ty ( 63 0 nm ) 3 hr 6 hr 24 hr
Oldenlandia diffusa extract (mg/mL)
2.5 5 10 20 0 2.5 5 10 20
Oldenlandia diffusa extract (mg/mL)
38
有意な変化は認められなかった。したがって、OdiE 製剤は添加 1、2 時間後では luxS を減少させるが、持続しないこと明らかとなった。
Fig. 21. Transcript levels of H. influenzae 2013-86 biofilm-related genes
Transcript levels of luxS and qseC were evaluated by semi-quantitative RT-PCR. Relative expression was calculated in comparison with the transcription level of gyrB. Each experiment was performed three times on separate occasions, and the data are shown as the mean ± SD. The P value was calculated by the Student's t-test.
4. Viblio harveyii ATCC BAA-211を用いたAI-2の定量
39
Fig. 22. Oldenlandia diffusa extract inhibits AI-2 production
The AI-2 in the medium was measured by a bioassay using Vibrio harveyi ATCC BAA-211. Each experiment was performed twice on separate occasions, and the data are shown as the mean ± SD. The P value was calculated by the Student's t-test.
0 2000 4000 6000 8000 10000 control 1/2 白花蛇舌草10 mg/ml 1/2 白花蛇舌草20 mg/ml 1/2 0 10 20 ** **
Oldenlandia diffusa extract (mg/mL)
42 した。その結果、quinolone 高度耐性黄色ブドウ球菌に対して、levofloxacinと相乗効果 を示す一方で、MGS製剤はグラム陰性菌の排出系に作用することで、抗菌薬の作用を 減弱させうることが示された。したがって、大腸菌が原因の疾患でlevofloxacinを服用 している場合、MGS製剤の併用は回避するべき医薬品情報であり、消費者への注意喚 起が必要であることが示唆された。 第3章においては、呼吸器感染症治療において、補助薬としてMGS製剤などと併用さ れるOdiE製剤に着目し、呼吸器感染症の中でも、近年起炎菌としての重要性が上がっ ているインフルエンザ菌に対する作用を解析した。その結果、増殖阻害作用は認めら れない一方で、バイオフィルム形成抑制作用を示すことが明らかとなった。OdiE製剤 は、古くから感冒などの呼吸器感染症の補助療法として経験的に使用されてきた。本 研究により明らかとなった、抗菌活性を示さないがバイオフィルム活性を阻害すると いう特徴は、OdiE製剤の持つ経験的な使用法に極めて合致したものである。そのため、 本研究の成果は、OdiE製剤が呼吸器感染症治療において、MGS製剤等の治療薬を補助 し、難治化予防につながる可能性が示唆するものである。 本研究は、各製剤の直接効果のみ検討した成績である。生体内での効果は、ADMEと
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