2
Discovery of novel small molecules inhibiting
metabolism-regulating enzymes: D5D inhibitor, CDK8
inhibitor and GCN2 inhibitor
3
本 論 文 は 、 学 術 雑 誌 に 収 録 さ れ た 次 の 報 文 を 基 礎 と す る も の で あ る 。
1. J. Fujimoto,* R.Oka moto, N. Noguchi, R. Hara, S. Masada, T.Kawa moto, H. Nagase, Y. Okano Tamura, M.Imanishi, S. Takagahara, K. Kubo, K. Tohyama, K. Iida, T. Andou, I. Miyahisa, J. Matsui, R. Hayashi, T. Maekawa and N. Matsunaga. Discovery of 3,5-diphenyl-4-methyl-1,3-oxazolidin-2-ones as novel, potent, and orally available Δ‑5 desaturase (D5D) Inhibitors. J. Med. Chem. 2017, 60, 8963-8981.
2. J. Fujimoto,* T. Hiraya ma, Y. Hirata, Y. Hikichi, S. Murai, M. Hasegawa, Y. Hasegawa, K. Yonemori, A. Hata, K. Aoyama and D. R. Cary. Studies of CDK 8/19 inhibitors: Discovery of novel and selective CDK8/19 dual inhibitors and elimination of their CYP3A4 time dependent inhibition potential. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 3018-3033.
3. J. Fujimoto,* O. Kurasawa, T. Ta kagi, X. Liu, H. Banno, T. Kojima, Y. Asano, A. Nakamura,T. Nambu,A. Hata,T. Ishii, T. Sameshima,Y. Debori,M. Miyamoto, M. G. Klein, R. Tjhen, B. Sang, I. Levin, S. W. Lane, G. P. Snell, K. Li, G. Kefala, I. D. Hoffman, S. C. Ding,D. R. Caryand Ryo Mizojiri. Identification of novel, potent and orally available GCN2 inhibitors with type I 1/2 binding mode. ACS Med. Chem. Lett.
2019, 10, 1498-1503.
4
目 次
序 論 9 第 一 章 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 の 代 謝 制 御 を 指 向 し た D5D 阻 害 剤 の 創 出 第 一 節 D5D 阻 害 に よ る 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 の 代 謝 制 御 メ カ ニ ズ ム 17 第 二 節 フ ァ ー マ コ フ ォ ア モ デ ル に よ る 1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ノ ン 誘 導 体 の 創 出 19 第 三 節 代 謝 物 解 析 情 報 を活 用 した1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ノ ン 誘 導 体 の最 適 化 28 第 四 節 (4S,5S)-5n を 用 い た 動 脈 硬 化 モ デ ル マ ウ ス へ の 14 日 間 連 投 試 験 35 第 五 節 (4S,5S)-5n の 不 斉 合 成 ル ー ト の 構 築 37 第 六 節 小 括 42 第 二 章 解 糖 系 を含 むがん促 進 機 構 の制 御 を指 向 した CDK8 阻 害 剤 の創 出 第 一 節 CDK8 のがん細 胞 における生 物 学 的 機 能 43 第 二 節 CDK8 活 性 向 上 を指 向 した SBDD によるリード創 出 戦 略 45 第 三 節 代 謝 物 解 析 情 報 の活 用 による TDI 回 避 のための合 成 検 討 63 第 四 節 48k の in vitro 薬 理 試 験 および in vivo がん増 殖 抑 制 試 験 69 第 五 節 小 括 74 第 三 章 がんにおけるアミノ酸 代 謝 機 構 の制 御 を指 向 した GCN2 阻 害 剤 の探 索 第 一 節 がん微 小 環 境 下 におけるアミノ酸 代 謝 制 御 にGCN2 が果 たす機 能 75 第 二 節 GCN2 高 選 択 的 な type I 1/2 型 阻 害 剤 を指 向 したリード創 出 戦 略 83 第 三 節 93d および 93e を用 いた in vitro 及 び in vivo 薬 理 試 験 985
第 三 章 に関 する参 考 文 献 190
6 略 語 表
ADME absorption, distribution, metabolism, and excretion ALL acute lymphocytic leukemia
Al(OiPr)3 aluminum isopropoxide AML acute myelogenous leukemia ATF4 activating transcription factor 4
AUC area under the blood concentration time curve b.i.d. twice a day
CDI 1,1’-carbonyldiimidazole CDK cyclin-dependent kinase CLt ot al total clearance
Cm ax maximum drug concentration CRC colorectal cancer
Cs2CO3 cesium carbonate CTD C-terminal domain CuI copper(I) iodide
CyJohnPhos 2-(dicyclohexylphosphino)biphenyl DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene DDI drug-drug interaction
D5D delta-5 desaturase DMA N,N-dimethylacetamide DMAP 4-dimethylaminopyridine DMG loop Asp-Met-Glu loop
DMSO dimethyl sulfoxide
EDCI 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Et2O diethyl ether
EtOAc ethyl acetate F bioavailability FBS fetal bovine serum
GCN2 general control nonderepressible 2 GST glutathione S-transferase
HATU O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium-hexafluorphosphate
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HOBt 1-hydroxybenzotriazole
7 ICR Institute for Cancer Research INF interferon
IPE isopropyl ether
ISR integrated stress response LAH lithium aluminum hydride LBDD ligand-based drug design LLE ligand lipophilic efficiency
MCM3 mini-chromosome maintenance 3 protein mCPBA m-chloroperoxybenzoic acid
MED mediator complex MRT mean residence time MS metabolic stability MsCl methanesulfonyl chloride NaBH4 sodium borohydride NaH sodium hydride NaOtBu sodium tert-butoxide NEt3 triethylamine
ODS octadecyl silyl THF tetrahydrofuran
PBS-T phsophate buffered saline with Tween 20
PD pharmacodynamic
PDB protein data bank
Pd(PPh3)4 tetrakis(triphenylphosphine)platinum(0)
PERK protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase pGCN2 phosphorylated GCN2
PK pharmacokinetics q.d. once a day
PUFA polyunsaturated fatty acid RNAP RNA polymerase
rt room temperature
SBDD structure-based drug design SD standard deviation
SEM standard error of the mean
SPhos dicyclohexyl(2',6'-dimethoxy-[1,1'-biphenyl]-2-yl)phosphine STAT signal transducers (transduction) and activator of transcription TR-FRET time-resolved fluorescence resonance energy transfer
8 Vds s steady state volume of distribution
Xantphos 4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene XPhos 2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropylbiphenyl
9
序 論
12
Figure 1. Achievement of medicinal chemistry efforts in D5D inhibitor program.
14 と を 見 出 し た 。 化 合 物 48k は in vivo に お い て も 強 い 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し 、CDK8 の阻 害 が、がん治 療 の新 規 なアプローチとなり得 ることが明 らかになった。 F i g ur e 3 . A c h i e v e me n t o f me d i c i n a l c h e mi s t r y e f f o r t s i n t h e C D K 8 i n h i b i t o r p r o g r a m. 第 三 章 第 三 章 で は 、 が ん 微 小 環 境 に お け る ア ミ ノ 酸 の 代 謝 を 制 御 す る ジ ェ ネ ラ ル ・ コ ン ト ロ ー ル ・ ノ ン デ プ レ ッ シ ブ ル 2（ general control non-depressible: GCN2） の 阻 害 剤 の リ ー ド 創 出 研 究 に つ い て 述 べ る 。
17
第 一 章
多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 の 代 謝 制 御 を 指 向 し た D5D 阻 害 剤 の 創 出
第 一 節 D5D 阻 害 に よ る 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 の 代 謝 制 御 メ カ ニ ズ ム
Δ− デ サ チ ュ ラ ー ゼ （ D5D） は 主 に 肝 臓 に 発 現 す る 膜 貫 通 型 タ ン パ ク で あ り 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 （ polyunsaturated fatty acid: PUFA ） の 生 合 成 に 関 与 し て い る 1 8 −20。 こ の 生
合 成 経 路 に お い て 、 必 須-6 脂 肪 酸 であ る リ ノー ル 酸 （linoleic acid） は、Δ− デ サ チ ュ ラ ー ゼ （ D6D） に よ っ て 6-7 位 間 が 不 飽 和 化 さ れ て -リ ノ レ ン 酸 （ -linolenic acid） へ 、 さ ら に エ ロ ン ゲ ー ス （ elongase ） に よ り ジ ホ モ --リ ノ レ ン 酸 （ dihomo--linolenic acid: DGLA） へ と 変 換 さ れ る （ Figure 6 ） 。
F i g ur e 6 . T h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o f P U FA .
18
20
ー サ ー 部 位 を 有 し て い る 。 い ず れ も 比 較 的 単 純 な 構 造 で あ る た め 、 後 の 構 造 展 開 に あ た っ て は 知 財 確 保 の 点 で 問 題 が 生 じ る こ と が 予 想 さ れ た 。
F i g ur e 8 . D 5 D i n h i b i t o r s i d e n t i f i e d b y H T S . Aromatic rings at each end of the molecule
22 <合 成 > 3-ベ ン ジ ル -1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 5a は 、 Scheme 1 に 示 す 経 路 で 合 成 し た 。 ま ず 、2-ア ミ ノ -1-フ ェ ニ ル エ タ ノ ー ル（ 6）と 1,1'-カ ル ボ ニ ル ジ イ ミ ダ ゾ ー ル（ CDI）を 、 N,N-ジ メ チ ル -4-ア ミ ノ ピ リ ジ ン （ DMAP） の 存 在 化 で 反 応 さ せ る こ と に よ り オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 7 を 得 た 。 ま た 、 別 途 、 2,4-ジ ク ロ ロ -5-(ヒ ド ロ キ シ メ チ ル )フ ェ ノ ー ル （ 8）を メ タ ン ス ル ホ ニ ル 化 し 、THF 溶 媒 中 、K2CO3の 存 在 下 に 上 記 の 7 と 反 応 さ せ る こ と で 所 望 の 5a を 得 た 。 S c he m e 1 . S y nt he s i s o f 3 - b e n z y l - 1 , 3 - o x a z o l i d i n - 2 - o ne 5 aa
aReagents and conditions: (a) CDI, DMAP, THF, 80 °C, 46%; (b) (i) MsCl, NEt3, THF, 0 °C; (ii)
7, K2CO3, THF, 80 °C, then NaOH, THF, 0 °C, 2% in 2 steps.
23
S c he m e 2 . S y nt he s i s o f 5 b − fa
a
Reagen ts an d con dition s: (a) N,O-dimeth ylh ydr oxylamin e h ydr och lor ide , EDCI, HOBt, NEt3,
DMF, 0 °C to room temperature, 82%; (b) 4-fluorophen ylmagnesium bromide, THF, 0 °C to room temperature, 87%; (c) NaBH4, MeOH, 0 °C to room temperature, 98%; (d) NaH, THF, 0 °C to
room temperature, 68%; (e) 2,4-dichlorobenzyl chloride, NaH, tetrabutylammonium iodide, THF, 0 °C to room temperature, 95%; (f) ArBr or ArI, Pd2(dba)3, Xan tph os, NaOtBu, toluen e, 120 °C,
microwave irradiation, 12−47%; (g) chiral HPLC separation.
化 合 物 5g と 5h は Scheme 3 に 示 す 方 法 で 合 成 し た 。
S c he m e 3 . S y nt he s i s o f 5 g a nd 5 ha
aReagen ts and con dition s: (a) Ar NH
2, 2-pr opan ol, 90 °C; (b) CDI, DBU, DMF, 80 °C, 3−4% in 2
24
ま ず 、オ キ シ ラ ン 14 に ア ニ リ ン 誘 導 体 を 開 環 付 加 さ せ 、対 応 す る ア ミ ノ エ タ ノ ー ル
15a お よ び 15 b を そ れ ぞ れ 合 成 し た 。 つ づ い て 、 DMF 溶 媒 中 で DBU お よ び CDI を 用
い て 1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 環 を 形 成 す る こ と で 、目 的 と す る 化 合 物 5g と 5h を 得 た 。
1,3-ジ フ ェ ニ ル -4-メ チ ル -1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 誘 導 体 5i と 5j は 、 市 販 の 化 合 物 16 か ら 6 段 階 を 経 て 合 成 し た （Scheme 4）。
S c he m e 4 . S y nt he s i s o f 5 i a nd 5 ja
aReagen ts an d con dition s: (a) N,O-dimeth ylh ydr oxylamin e h ydr och lor ide , EDCI, HOBt, NEt
3,
DMF, room temperature, 81%; (b) 4-fluorophen ylmagnesium bromide, THF, 0 °C to room temperature, 76%; (c) NaBH4 , T HF, MeOH, 0 °C, then HCl/EtOAc, r oom temperatur e, 38%; (d)
1-br omo-3-iod oben zen e, CuI, NaOH, 2 -pr opan ol, 90 °C, 72%; (e) CDI, DBU, THF, 80 °C, 37% (21) and 27% (22); (f) Zn(CN)2, Pd(PPh3)4, DMF, 100 °C, 67% (5i) and 30% (5j); (g) chir al HPLC
separation.
25 ノ ー ル 19 を シ ス /ト ラ ン ス 混 合 物 （ 混 合 比 率 は 未 決 定 ） と し て 得 た 。 つ づ い て 上 で 述 べ た 手 法 に 倣 い 、 化 合 物 19 か ら オ キ サ ゾ リ ジ ン -2- オ ン 体 へ と 誘 導 し 、 Buchwald-Hartwig 反 応 に よ り 最 終 目 的 物 の 合 成 を 試 み た 。し か し 、残 念 な が ら こ の カ ッ プ リ ン グ 反 応 は 進 行 し な か っ た 。こ れ は 、オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン の 4 位 の メ チ ル 基 に よ る 立 体 障 害 が 一 因 と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 代 替 案 と し て 既 報 33 を 参 考 に 、 化 合 物 19 と 3-ブ ロ モ -1-ヨ ー ド ベ ン ゼ ン と を 、CuI を 触 媒 と し て 用 い て 2-プ ロ パ ノ ー ル 溶 媒 中 で カ ッ プ リ ン グ さ せ る こ と を 試 み た と こ ろ 、 所 望 の カ ッ プ リ ン グ 生 成 物 20 を 収 率 72%で 得 る こ と が で き た 。 化 合 物 20 を 、 上 述 と 同 様 の 条 件 で 1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 誘 導 体 と し 、 得 ら れ た ジ ア ス テ レ オ マ ー 混 合 物 を 、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 各 異 性 体 21（ ト ラ ン ス ） お よ び 22（ シ ス ） へ と 精 製 分 離 し た 。 シ ア ノ 誘 導 体 5i お よ び 5j は 、 そ れ ぞ れ 化 合 物 21 お よ び 22 を 前 駆 体 と し 、 テ ト ラ キ ス（ト リ フ ェ ニ ル ホ ス フ ィ ン ）パ ラ ジ ウ ム（0）（Pd(PPh3)4）を 触 媒 に 用 い て 、シ ア ン 化 亜 鉛 と カ ッ プ リ ン グ さ せ る こ と に よ り 得 た 。ト ラ ン ス 体 5i を キ ラ ル HPLC で 精 製 分 離 す る こ と で 、光 学 活 性 体 (4S,5S)-5i お よ び (4R,5R)-5i を 得 た 。な お 、こ れ ら の 絶 対 立 体 化 学 は 、 (4R,5R)-5i の X 線 単 結 晶 構 造 解 析 に よ り 決 定 し た 。 S c he m e 5 . S y nt he s i s o f 5 ka
aReagen ts an d con dition s: (a) N,O-dimeth ylh ydr oxylamin e h ydr och lor ide , EDCI, HOBt, NEt
3,
DMF, room temperature, 57%; (b) 4-fluorophen ylmagnesium bromide, THF, 0 °C to room temperature; (c) NaBH4 , THF, MeOH, 0 °C, th en HCl/EtOAc, 0 °C to r oom temperatur e, 28% in
2 steps; (d) 1-br omo-3-iod obenzen e, CuI, NaOH, 2 -pr opan ol, 90 °C; (e) CDI, DBU, THF, r oom temperatur e to 80 °C, 56% in 2 steps; (f) Zn (CN)2, Pd(PPh3)4, DMF, 100 °C, 76%.
26 込 み 合 っ た gem-ジ メ チ ル 化 合 物 26 に お い て も CuI を 触 媒 に 用 い た カ ッ プ リ ン グ は 進 行 し 、 目 的 の カ ッ プ リ ン グ 体 27 を 得 る こ と が で き た 。 そ の 後 、 オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 環 の 形 成 と 、シ ア ン 化 亜 鉛 と Pd(PPh3)4を 用 い た シ ア ノ 基 導 入 を 経 て 5k を 合 成 し た 。 化 合 物 5l−n は 既 出 の 中 間 体 19 を 用 い て Scheme 6 に 示 す 経 路 で 合 成 し た 。 化 合 物 19 と 芳 香 族 ヨ ウ 素 化 合 物 と を 、 CuI を 触 媒 に 用 い る 条 件 で カ ッ プ リ ン グ さ せ 、 つ づ く 1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ン -2-オ ン 環 形 成 反 応 の 後 、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 精 製 を 経 て 、 化 合 物 30a お よ び 30b を シ ス /ト ラ ン ス 混 合 物 （ シ ス /ト ラ ン ス 含 有 率 は 、そ れ ぞ れ 約 2/8 ）と し て 得 た 。続 い て 、シ ア ン 化 亜 鉛 と Pd(PPh3)4を 用 い る カ ッ プ リ ン グ 反 応 に よ り 30a の ブ ロ モ 基 を シ ア ノ 基 へ と 変 換 し 、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 用 い た 精 製 分 離 に よ り ト ラ ン ス 体 5l を 得 た 。ク ロ ロ 体 30b を 用 い た シ ア ノ 化 反 応 に お い て は 、 1 置 換 お よ び 2 置 換 シ ア ノ 化 合 物 が 生 じ た が 、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 精 製 分 離 す る こ と で 、 そ れ ぞ れ の ト ラ ン ス 異 性 体 で あ る 5m お よ び 5n を 得 る こ と が で き た 。 得 ら れ た ジ シ ア ノ 体 5n を キ ラ ル HPLC で 精 製 分 離 し 、(4S,5S)-5n を 得 た 。加 え て 、30b か ら シ ア ノ 基 導 入 反 応 を 行 い 、生 じ た ジ ア ス テ レ オ 混 合 物 を キ ラ ル HPLC で 精 製 分 離 す る こ と で 、 (4S,5S)-5m を 得 た 。 最 終 化 合 物 5m お よ び 5 n の 絶 対 立 体 配 置 は X 線 単 結 晶 構 造 解 析 に よ り 決 定 し た 。 S c he m e 6 . S y nt he s i s o f 5 l − na
aReagen ts and con dition s: (a) Ar I, CuI, NaOH, 2 -pr opan ol, r oom temperatur e to 10 0 °C; (b) CDI,
DBU, THF, 80 °C, 32% in 2 steps ( 30a) an d 28% in 2 steps ( 30b) (c) (i) Zn (CN)2, Pd(PPh3)4,
27
Pd(PPh3)4, DMF, r oom temper atur e to 10 0 °C, 72% (5m) and 13% (5n); (e) ch iral HPLC
28
Figure 10. Chemical structure of T-3364366.
Ta b l e 1 . B i o l o g i c a l a c t i v it i e s a n d l i p o p h i l i c it i e s o f hi t c o m p o u n d s a nd 1 , 3 -o x a z -o l i d i n - 2 - -o n e s
D5D
IC5 0 (nM)
compd. Bindinga Cellb cLogPd LLEe
1 39 N.T.c 4.1 3.0 2 360 N.T.c 4.4 2.0 5a 12 1100 4.2 3.7 5b 79 150 4.9 2.2 5g 13 18 2.9 5.0 5h 8.5 4.1 2.8 5.3
aInh ibition of radiolabelled ligand bin ding to D5D in rat liver micr osomes. bD5D inh ibition in
HepG2 cells measur ed by th e pr oduction of [1 4C]AA fr om [1 4C]DGLA. cNot tested. dLogP value
calculated by Da yligh t pr ogr am. eLigand-lipophilic efficien cy. LLE = pIC
29
第 三 節 1,3-オ キ サ ゾ リ ジ ノ ン 誘 導 体 の最 適 化 :代 謝 物 解 析 情 報 の活 用
前 節 で述 べたとおり、3,5-ジフェニル-1,3-オキサゾリジン-2-オン誘 導 体 5h は強 力 な D5D 阻 害 活 性 を示 す。しかし、さらなる評 価 の結 果 、ヒトおよびマウス肝 ミクロソームにおける代 謝 安 定 性 が低 いことが判 明 した（201 mL/min/mgin human、234 mL/min/mgin mouse）。代 謝 安 定 性 の低 さは 経 口 剤 を目 指 すうえ での 障 壁 となる 。そこで、この課 題 を 論 理 的 な薬 剤 設 計 によ り対 処 すべく、ヒトおよびマウス肝 細 胞 における 5h の代 謝 物 解 析 を実 施 した（Figure 11）。化 合 物 を
細 胞 に 37°C で 6 時 間 インキュベートし、インキュベート前 後 の細 胞 上 澄 みを LC/MS/MS にて 比 較 解 析 することで代 謝 物 の構 造 を推 定 した。
F i g ur e 11 . Structures of metabolites of 5h found in human or mouse hepatocytes ( in vitro)
and mice livers (in vivo) based on LC/MS/MS analysis, and quantification of each metabolite.
aFormation ratio (%) = (UV peak area of metabolite after incubation) / (UV peak area of
parent compound before incubation) × 100. Metabolites were quantified assuming that the molecular extinction coefficient is equal to that of 5h. bNot detected. cConcentration in mice
30 その結 果 、代 謝 物 としてフェノール体 M-1、硫 酸 抱 合 体 M-2、グルクロン酸 抱 合 体 （M-3 お よび M-4）の生 成 が推 定 された。さらに、in vivo における代 謝 物 解 析 試 験 も実 施 したところ、混 餌 条 件 で 5h を経 口 投 与 した後 のマウスの肝 臓 において、M-3 を除 く 5 種 類 の代 謝 物 が生 ず ることが推 定 された。これらの結 果 は、化 合 物 5h のメトキシ基 および 1,3-オキサゾリジン-2-オン 環 の 4-メチレン部 位 が主 代 謝 部 位 となり、第 I 相 酸 化 代 謝 反 応 と、それに続 く第 II 相 抱 合 反 応 を受 けることを示 唆 するものである。したがって、これらの主 代 謝 部 位 の変 換 が本 化 合 物 群 の 代 謝 安 定 性 改 善 に有 効 であろうと期 待 し、新 規 化 合 物 のデザイン、検 証 を行 った。 Ta b l e 2 . B i o l o g ic a l a c t i v it i e s a nd m e t a b o l ic s t a b i l i t ie s o f 3 , 5 d i p he ny l 1 , 3 -o x a z -o l i d i n - 2 - -o n e d e r i v a t i v e s D5D Metabolic stabilityd IC5 0 (nM) (mL/min/mg)
compd. R1 Bindinga Cellb human mouse
31 5k CN 450 N.T.c 0 0 5j CN 410 N.T.c 21 7 5i CN 13 8.9 0 0 (4S,5S)-5i CN 5.3 8.7 0 24 (4R,5R)-5i CN 5800 N.T.c N.T.c N.T.c
aInh ibition of r adioligan d bin ding to D5D in rat liver micr osomes. bD5D inhibition in HepG2
cells measur ed by pr oduction of [1 4C]AA fr om [1 4C]DGLA. cNot tested. dMetabolic stabilit y in
human or mouse h epatic micr osomes. Values equal to or less th an zer o ar e indicated as "0" in this table. Th e details ar e descr ibed in th e exper imental section.
34
化 合 物 (4S,5S)-5i は 肝 ミ ク ロ ソ ー ム に お い て 優 れ た 安 定 性 を 示 し （0 mL/min/mg in human、24 mL/min/mg in mouse）、こ れ は 4 位 メ チ ル 基 が 代 謝 部 位 へ の 代 謝 酵 素 の 接 近 を 防 ぐ と い う 薬 剤 設 計 仮 説 の 有 効 性 を 支 持 す る も の で あ っ た 。 ま た 、 こ の 高 い 代 謝 安 定 性 は マ ウ ス カ セ ッ ト ド ー ジ ン グ 試 験 に お け る 高 い 生 物 利 用 率（ F = 87.2%）に も 反 映 さ れ て い た（ Table 3）。そ こ で 、さ ら に in vivo に お け る D5D 阻 害 作 用 の 評 価 に 進 む こ と に し た 。 Ta b l e 3 . B i o lo g i c a l a c t i v i t i e s a nd P K pr o f i l e s o f 5 - s ub s t i t ut e d d e r i v a t i v e s D5D in vivo PK
IC5 0 (nM) D5D indexc AUCpod MRTpof Fg
compd. R Bindinga Cellb dose % (ng·h·mL- 1) (h) (%)
(4S,5S)-5i H 5.3 8.7 3 mg/kg, bid 42 2076 3.4 87.2 5l F 4.0 3.7 3 mg/kg, bid 63 1198 3.8 61.0 (4S,5S)-5m Cl <1.0 0.52 3 mg/kg, qd 71 974 e 4.2e 74.4e (4S,5S)-5n CN 1.5 1.5 3 mg/kg, qd 74 891 e 4.0e 53.3e
aInh ibition r adioligan d bindin g to D5D in r at liver micr osomes. bD5D inhibition in HepG2 cells
measur ed by pr oduction of [1 4C]AA fr om [1 4C]DGLA. cDecr ease r ate of th e AA/DGLA r atio in
liver upon test compoun d administration compar ed with th e con tr ol gr oup as 100%. Test compoun d was orall y administr ated to n ormal ch ow fed C57BL/6J mice for 4 da ys. dAr ea un der
th e cur ve fr om mouse cassette dosin g (1 mg/kg, p.o., 0−8 h ). eData wer e collected in a discr ete
stud y (0.1 mg/kg, i.v., 0−8h an d 1 mg/kg, p.o., 0−8h). fMean r esiden ce time fr om mouse cassett e
dosin g (1 mg/kg, p.o., 0−8 h ). gBioa vailability fr om mouse cassette dosin g (0.1 mg/kg, i.v., an d
35 化 合 物 (4S,5S)-5i を 、C57BL/6J マ ウ ス に 1 日 1 回 、4 日 間 経 口 投 与 し た 後 、肝 臓 サ ン プ ル に お け る AA と DGLA の 含 有 量 を 測 定 し た 。評 価 に あ た っ て は 、化 合 物 投 与 群 で 算 出 さ れ た AA/DGLA 比 の 、 コ ン ト ロ ー ル 群 か ら の 減 少 量 を 指 数 に 用 い た 。 こ の 指 数 は 、 社 内 に お い て こ れ ま で に 他 の 誘 導 体 群 の 評 価 で も 用 い ら れ た 実 績 が あ る 29。 こ れ を in vivo D5D 阻 害 指 数 と 定 義 す る 。 ま た 4 日 間 投 与 後 の 本 指 数 が 70%程 度 で あ れ ば 、in vivo に お け る D5D 阻 害 を 最 大 限 実 現 で き て い る も の と 判 断 し 、そ の よ う な 活 性 を 示 す 化 合 物 を 創 出 す る こ と を 研 究 目 標 と し た 。 し か し 、 (4S,5S)-5i を 3 mg/kg の 用 量 で 1 日 2 回 、 4 日 間 マ ウ ス に 経 口 投 与 し た と こ ろ 、in vivo D5D 阻 害 指 数 は 42%で あ り 、目 標 と し た 数 値 か ら は 大 き く 劣 る こ と が 判 明 し た 。 よ り 強 力 な in vivo 作 用 を 目 指 す の で あ れ ば 、 in vitro に お け る 阻 害 活 性 を 向 上 さ せ る こ と が 直 接 的 な 解 決 策 に な る と 考 え 、 こ の 化 合 物 を 基 に 、 さ ら な る 置 換 基 導 入 に よ っ て 活 性 向 上 を 図 る こ と に し た 。 は じ め に 、 ベ ン ゾ ニ ト リ ル 部 位 へ の 置 換 基 追 加 が 活 性 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 、 5 位 へ の 置 換 基 導 入 が 活 性 向 上 に 最 も 有 効 で あ る と の 知 見 が 得 ら れ た 。 詳 細 な 結 果 を Table 3 に 示 す 。潜 在 的 な 酸 化 代 謝 を 最 小 限 に 抑 え る た め 、置 換 基 と し て サ イ ズ が 小 さ く 、電 子 求 引 効 果 を も つ フ ル オ ロ 基 を 導 入 し た と こ ろ （ 5l）、 対 応 す る 5i と 比 較 し て D5D 結 合 活 性 お よ び 細 胞 活 性 が 2 倍 以 上 向 上 し た 。さ ら に 、化 合 物 5l を 3 mg/kg の 用 量 で 、1 日 2 回 、4 日 間 マ ウ ス に 経 口 投 与 し た と こ ろ 、in vivo D5D 阻 害 指 数 は 63% と な り 、5i を 上 回 る こ と が 確 認 さ れ た 。5 位 に ク ロ ロ 基 を も つ 化 合 物 (4S,5S)-5m で は 、 さ ら な る 活 性 増 強 が 確 認 さ れ 、 IC5 0値 で 1 nM を 下 回 る レ ベ ル に 達 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。そ こ で 改 め て こ の 化 合 物 の in vivo に お け る 作 用 を 1 日 1 回 の 経 口 投 与（ 3 mg/kg）に よ り 評 価 し た と こ ろ 、in vivo D5D 阻 害 指 数 は 目 標 値 と し て い た 71% に 到 達 し た 。 し か し 、 さ ら に 精 査 し た と こ ろ 、 (4S,5S)-5m は 中 程 度 の CYP2CP 阻 害 活 性 を 示 し た （ 44.2% inhibition at 10 M） た め 、 分 子 全 体 の 脂 溶 性 を 低 減 す る 目 的 で ク ロ ル 基 を ニ ト リ ル 基 に 代 え た (4S,5S)-5n を 合 成 、評 価 し た 。そ の 結 果 、こ の 化 合 物 は 強 力 な in vitro 活 性 （ D5D 結 合 阻 害 活 性 お よ び 細 胞 活 性 に お い て 、 ど ち ら も IC50 = 1.5 nM）な ら び に 最 大 レ ベ ル の in vivo D5D 阻 害 指 数（ 74%, 3 mg/kg, p.o.）を 示 し た 。さ ら に 、 CYP2C9 阻 害 作 用 も 低 減 （ 28.5% @ 10 M） し た 。 以 上 の 結 果 よ り 、 in vivo に お け る D5D 阻 害 作 用 の 向 上 に 、 in vitro 活 性 の 増 強 が 寄 与 し た こ と が 示 唆 さ れ る 。加 え て 、マ ウ ス に 投 与 し た あ と の 薬 物 動 態 が in vivo の 作 用 に 影 響 を 与 え る こ と も 考 え 、 こ の 点 を 解 析 し た 。 す な わ ち 、 化 合 物 5l、 (4S,5S)-5m、
(4S,5S)-5 n の 血 漿 中 に お け る 平 均 滞 留 時 間（ Mean Residence Time: MRT）を 評 価 し た と
36
第 四 節 (4S,5S)-5n を 用 い た 動 脈 硬 化 モ デ ル マ ウ ス へ の 14 日 間 連 投 試 験
38 第 五 節 (4S,5S)-5n の 不 斉 合 成 ル ー ト の 構 築 前 節 で 述 べ た と お り ， 化 合 物 (4S,5S)-5n は 新 規 か つ 経 口 投 与 可 能 な D5D 阻 害 剤 と し て 有 望 で あ る 。 そ こ で ， 次 な る 研 究 段 階 へ の 移 行 に 向 け て 、 実 験 用 バ ル ク ス ケ ー ル （ 数 g） の 不 斉 合 成 経 路 の 確 立 に 取 り 掛 か る こ と と し た 。 最 初 に 開 発 し た 合 成 経 路 を Scheme 7 に 示 す 。 S c he m e 7 . A s y m m e t r i c s y nt he s i s o f ( 4 S , 5 S ) - 5 na
aReagen ts and con dition s: (a) Br
2, Et2O, 0 °C to r oom temper atur e, 95%; (b) (Ph CH2)2NH, Na2CO3,
CH3CN, 60 °C, 89%; (c) LiAl H4, Et2O, r oom temper atur e, 81%; (d) H2, Pd/C, MeOH, r oom
temperatur e, 93%; (e) Boc2O, NEt3, THF, 0 °C to r oom temperatur e, 91%; (f) ch iral HPLC
39
40
に あ た っ て は 、Meerwein-Ponndorf-Verley（ MPV）反 応 を 採 用 し た 。す な わ ち 、ケ ト ン
42 を 、11 倍 モ ル 量 の イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル お よ び 20 mol%の ト リ イ ソ プ ロ ポ キ シ ア
ル ミ ニ ウ ム（ Al(OiPr)3）を 用 い て 、ト ル エ ン 中 、50 °C で 還 元 し た 。反 応 処 理 後 に 粗 生 成 物 を 酢 酸 エ チ ル /ヘ キ サ ン か ら 再 結 晶 す る こ と に よ っ て 、 (1R,2S) 異 性 体 43 を 99% 以 上 の ジ ア ス テ レ オ マ ー 過 剰 率 （ diastereomeric excess: de）、収 率 67%で 得 る こ と に 成 功 し た 。
S c he m e 8 . A s y m m e t r i c s y nt he s i s o f 3 7a
aReagen ts an d con dition s: (a) N,O-dimeth ylh ydr oxylamin e h ydr och lor ide , EDCI, HOBt, NEt
3,
DMF, r oom temper atur e, 88%; (b) 4-fluor oph en ylmagn esium br omide , THF, r oom temper atur e, quant.; (c) Al(OiPr )3, 2-pr opan ol, toluen e, 50 °C, then r ecr ystallization , 67%; (d) MsCl, NEt3,
THF, 50 °C, 87%; (e) LiOH, water, 90 °C, 69%.
41
Fig ure 15. Stereochemical course of the reduction of ketone 42.
45 第 二 節 CDK8 活 性 向 上 を目 指 した SBDD 戦 略
強 力 な 活 性 を も つ CDK8 阻 害 剤 を 論 理 的 に 創 出 す る こ と を 目 指 し 、ヒ ッ ト 化 合 物 45 を 三 つ の 部 分 構 造 に 分 け て 各 々 の 構 造 変 換 を 立 案 す る "modular"ア プ ロ ー チ を 採 用 し 、 構 造 に 基 づ く 薬 剤 設 計 （ Structure-Based Drug Design： SBDD） を 試 み た 。
研 究 開 始 当 時 、CDK8 と リ ガ ン ド の X 線 共 結 晶 構 造 と し て は 、1 例 の み で は あ る が 、 マ ル チ キ ナ ー ゼ 阻 害 薬 で あ る solafenib（ Figure 17A） と の 共 結 晶 構 造 が 報 告 さ れ て い た（ PDB ID：3RGF）5 6。そ こ で ま ず は 、そ の 情 報 を 活 用 し て 化 合 物 45 と CDK8 と の ド ッ キ ン グ モ デ ル を 作 成 し た （ Figure 17B）。
F i g ur e 1 7 . ( A ) T h e c h e mi c a l s t r u c t u r e o f s o r a f e n i b . ( B ) D o c k i n g mo d e l o f 4 5
46
47
48 ＜ 合 成 ＞ 本 章 で 報 告 す る ピ リ ジ ル ア ク リ ル ア ミ ド 誘 導 体 は 、い ず れ も 市 販 の 4-ク ロ ロ ニ コ チ ン ア ル デ ヒ ド 塩 酸 塩 （ 49） を 出 発 物 質 と し て 合 成 し た 。 そ れ ぞ れ の 合 成 経 路 を 以 降 に 示 す 5 7。 ま ず 、 化 合 物 49 と ト リ エ チ ル ホ ス ホ ノ ア セ テ ー ト と の Horner-Wadsworth-Emmons 反 応 に よ り 、 所 望 の (E)-ア ル ケ ン 50 を 良 好 な 収 率 で 得 た54。 こ の と き 、 副 生 成 物 で あ る（ Z）-異 性 体 の 生 成 率 は 5%未 満 で あ り 、カ ラ ム 精 製 に よ り 容 易 に 除 去 で き た 。得 ら れ た 50 を 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 を 用 い て 加 水 分 解 し 、 カ ル ボ ン 酸 54 を ほ ぼ 定 量 的 に 得 た 。 化 合 物 50 お よ び 54 を 中 間 体 と し て 用 い 、 以 降 に 示 す 各 誘 導 体 を 合 成 し た （ Scheme 9） 。
Scheme 9. Synthesis of 50 and 54. Reagents and conditions: (a) ethyl 2
-(diethox yphosphoryl)acetate, NaH, THF, 0 °C to rt, 86%; (b) NaOH, water, THF, EtOH, rt, then aq. HCl, 96%.
は じ め に 、中 間 体 50 を LiCl の 共 存 下 、触 媒 と し て Pd(PPh3)4を 用 い て 1,1,1,2,2,2-ヘ キ サ ブ チ ル ジ ス タ ン ナ ン（ Bu3SnSnBu3）と カ ッ プ リ ン グ さ せ 5 8、つ づ い て 、DMF 溶 媒 中 、CsF、CuI、Pd(PPh3)4を 用 い る 条 件 59で の Stille 型 反 応 に よ り 、イ ソ チ ア ゾ ー ル 体
52a へ と 導 い た 。 化 合 物 52a を 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 中 で 加 水 分 解 反 応 し た の ち 、
49
Scheme 10. Synthesis of 46a. Reagents and conditions: (a) Bu3SnSnBu3, LiCl, Pd(PPh3)4, toluene, 120 °C, 19%; ( b) 4-bromoisothiazole, CsF, CuI, Pd(PPh3)4, DMF, 100°C, 75%; (c) NaOH, water, THF, EtOH, rt, then HCl or AcOH, 26−83%; ( d) 4-(morpholinomethyl)aniline, HATU, DIEA, DMF, rt, 34−83% . 他 方 、 中 間 体 50 を 、 ホ ス フ ィ ン リ ガ ン ド Sphos ま た は CyJohnPhos を 用 い て 、 ピ ラ ゾ ー ル ボ ロ ン 酸 も し く は ボ ロ ン 酸 エ ス テ ル 試 薬 と 、カ ッ プ リ ン グ さ せ る こ と に よ っ て 、 ピ ラ ゾ ー ル 体 52b–e を 得 た 。 得 ら れ た エ ス テ ル は 、 ア ル カ リ 加 水 分 解 に よ り 良 好 な 収 率 で 対 応 す る カ ル ボ ン 酸 53b–e へ と 変 換 で き た 。 た だ し 、 水 溶 性 の 高 い 53b の 収 率 は 26%に と ど ま っ た 。こ れ ら カ ル ボ ン 酸 を H ATU 存 在 下 、4-（モ ル ホ リ ノ メ チ ル ）ア ニ リ ン と 縮 合 反 応 さ せ て ア ミ ド 46g、46f、46k、46m へ と 導 い た 。ま た 、化 合 物 46f お よ び 46k の ア ク リ ル ア ミ ド 内 の 二 重 結 合 を 、 パ ラ ジ ウ ム 炭 素 を 用 い た 水 素 化 反 応 に よ り 還 元 し 、 化 合 物 46o お よ び 46p を 得 た （ Scheme 11） 。
Scheme 11. Synthesis of 46g, 46f, 46k, 46m, 46o and 46p. Rea gents a nd conditions: (a)
50 化 合 物 46d、46h、46i、46l、46n（ Scheme 12）は 、中 間 体 54 を 起 点 と し て 、先 に ア ク リ ル ア ミ ド 部 位 を 形 成 し た 後 に 、 ピ リ ジ ン 環 4 位 へ 各 芳 香 環 を 導 入 す る こ と に よ っ て 合 成 し た 。 す な わ ち 、 Vilsmeir 試 薬 を 54 に 作 用 さ せ て 酸 ク ロ リ ド へ 変 換 し 、 4-（モ ル ホ リ ノ メ チ ル ）ア ニ リ ン を 求 核 攻 撃 さ せ る こ と に よ り ア ミ ド 体 55 を 合 成 し た 。得 ら れ た 55 と 適 切 な ア リ ー ル ボ ロ ン 酸（ も し く は ボ ロ ン 酸 エ ス テ ル ）を 、 Sphos も し く は CyJohnPhos を 配 位 子 と す る パ ラ ジ ウ ム 触 媒 を 用 い て カ ッ プ リ ン グ さ せ た 60, 6 1。
Scheme 12. Synthesis of 46d, 46h, 46i, 46l and 46n. Reagents and conditions: (a) oxalyl
55 ヒ ッ ト 化 合 物 45 と は モ ル ホ リ ン 部 位 の 構 造 の 異 な る 各 化 合 物 48a-k は Scheme 17、 Scheme 18 に し た が っ て 合 成 し た 。 ま ず 、 化 合 物 48a お よ び 48b は 、 カ ル ボ ン 酸 中 間 体 53c を そ れ ぞ れ ア ン モ ニ ア 、 ア ニ リ ン で ア ミ ド 化 す る こ と に よ り 合 成 し た（ Scheme 17）。ま た 、カ ル ボ ン 酸 53c を (4-ア ミ ノ フ ェ ニ ル )メ タ ノ ー ル と 縮 合 さ せ て 化 合 物 72 と し た 後 、 そ の 水 酸 基 を メ タ ン ス ル ホ ン 酸 エ ス テ ル 化 し て 脱 離 基 と し 、 3-オ キ サ -8-ア ザ ビ シ ク ロ [3.2.1]オ ク タ ン 塩 酸 塩 で 置 換 す る こ と に よ り 末 端 部 に 環 状 ア ミ ノ 構 造 を 導 入 し て 化 合 物 48e を 得 た 。た だ し 、 環 状 第 2 級 ア ミ ン の 導 入 段 階 は 収 率 が 極 め て 低 か っ た た め （ 2 工 程 、 4%）、 つ づ く 化 合 物 48c お よ び 48i の 合 成 で は 、 ア ミ ノ ア ル コ ー ル 74 の ア ニ リ ノ 基 の Boc 基 保 護 と 、 続 く メ シ ル 化 反 応 に よ り 76 を 得 た 後 、 環 状 ア ミ ン 塩 酸 塩 に よ る 求 核 置 換 反 応 に よ り ア ニ リ ン 中 間 体 77c お よ び 77i を 合 成 し た 。 両 化 合 物 の Boc 基 を エ タ ノ ー ル 中 、 20% HCl で 除 去 し た 後 、 HATU、 DIE A を 用 い る 条 件 で カ ル ボ ン 酸 53c 縮 合 さ せ 化 合 物 48c お よ び 48i を 得 た 。
56 化 合 物 48g お よ び 48h の 合 成（ Scheme 18）に お い て は 、ま ず 、カ ル ボ ン 酸 53d と ア ミ ノ ア ル コ ー ル を 縮 合 さ せ て ア ミ ド 78 に 変 換 し た 後 、 ベ ン ジ ル ア ル コ ー ル 部 位 を 二 酸 化 マ ン ガ ン で 酸 化 し て ア ル デ ヒ ド 体 79 を 得 た 。 こ の ア ル デ ヒ ド と 環 状 第 2 級 ア ミ ン を 用 い 、 メ タ ノ ー ル 溶 媒 中 、 酢 酸 存 在 下 、 2-ピ コ リ ン ボ ラ ン を 作 用 さ せ る こ と で 還 元 的 ア ミ ノ 化 反 応 を 行 っ た と こ ろ 、 目 的 の 48g お よ び 48h を 得 る こ と が で き た 。 ま た 、 4- ニ ト ロ ベ ン ズ ア ル デ ヒ ド (80) と 環 状 ア ミ ン と の 還 元 的 ア ミ ノ 化 反 応 お よ び ニ ト ロ 基 の 還 元 を 経 て 、 ア ニ リ ン 82d、 82f、 82j を 合 成 し 、 カ ル ボ ン 酸 53c も し く は 53d と の ア ミ ド 縮 合 反 応 に よ っ て 、 化 合 物 48d、 48f、 48j、 48k を 得 た 。
Scheme 18. Synthesis of 48d, 48f, 48g, 48h, 48j, 48k. Reagents and conditions: (a) 53d,
58 <合 成 化 合 物 の 評 価 と 検 討 の 経 緯 >
61
Table 4 (continued)
CDK8a pSTAT1b
compd. R IC5 0 (nM) EC50 (nM)
46h 1.5 (1.0-2.4) 10 (5.7-18) 46i 4800 (3065-7502) >10000 46j 2.5 (2.1-3.0) 2.4 (1.5-3.9) 46k 6.4 (5.0-8.3) 11 (4.5-26) 46l 24 (21-27) 50 (16-152) 46m 28 (23-35) 150 (78-290) 46n 4.5 (3.6-5.7) 28 (15-54)
aInh ibition of kin ase tracer 236 bin ding to h uman CDK8 (n = 2, values in par enth eses in dicate
95% con fiden ce inter val). bInhibition of STAT1 ph osph or ylation (at Ser 727) in duced by IFN -γ in
62 Ta b l e 5 . PK p r o f i l e s a nd m e t a b o l i c s t a b i l i t ie s o f s e le c t e d c o m p o u n d s Metabolic stabilityf compd. Clt ot al a Cm axb AUC poc MRT pod F e (%) ( mL/min/mg) ( mL/h/kg) (ng/mL) (ng/mL*h) (h) human mouse 46f 2967 47.5 76.9 1.5 21.9 22 77 46k 1523 207.7 339.7 1.5 51.2 25 64 46n 5765 15.7 26.9 1.2 15.5 78 118
PK data obtain ed fr om mouse cassette dosin g studies (1 mg/kg, p.o., 0−8 h ). aCl
t o t al: mean plasma
clearan ce. bC
ma x: maximum con cen tration. cAUCp o.: ar ea un der th e cur ve. dMRTp o.: mean
residen ce time. eF: bioavailability in mouse cassette dosin g studies (0.1 mg/kg, iv an d 1 mg/kg,
p.o.). fMetabolic stabilit y in h uman or mouse h epatic micr osomes.
F i g ur e 1 8 . P r e s u me d s t r u c t u r e s f o r me t a b o l i t e s o f 4 6 f ( i n mo u s e p l a s ma ) b a s e d
63
第 三 節 代 謝 物 解 析 の活 用 による TDI 回 避 のための合 成 検 討
リ ー ド 化 合 物 46f お よ び 46k の 構 造 最 適 化 に あ た り 、 Figure 17 で 述 べ た と お り 、 ヒ ン ジ 結 合 部 位 で あ る ピ リ ジ ン 環 に 置 換 基 を も つ 化 合 物 47a–d を 合 成 し 、 評 価 し た （ Table 6） 。
Table 6. Biological activities of 46f, 46k and substituted pyridine derivatives 47a−d
CDK8a pSTAT1b CYP3A4 TDIc
compd. R1 IC5 0 (nM) EC50 (nM) (% remaining at 30 μM) 46f Me 6.5 (5.8-7.2) 13 (9.6-18) 81 46k cPr 6.4 (5.0-8.3) 11 (4.5-25) 54 47a Me 990 (787-1248) 1300 (392-4389) ND d 47b Me > 10000 > 10000 89 47c Me 5.2 (4.5-5.9) 3.6 (2.3-5.5) 60 47d cPr 6.5 (5.7-7.5) 2.3 (0.95-5.3) 46
aInh ibition of kin ase tracer 236 bin ding to h uman CDK8 (n = 2, values in par enth eses in dicate
95% con fiden ce inter val). bInhibition of STAT1 ph osph or ylation (at Ser 727) in duced by IFN -γ in
64
c% r emainin g of CYP3A4 activit y. Tested comp oun ds wer e pr e -in cubated in human liver
micr osomes for 60 min. Test oster on e was added to micr osomes and in cubated for 20 min. dND:
n ot determin ed.
化 合 物 47a お よ び 47b は 、CDK8 の ヒ ン ジ 部 位 の Ala100 お よ び 近 傍 の Asp98 と の 2 点 の 水 素 結 合 形 成 を 目 論 み（ Figure 17B）、ピ リ ジ ン 窒 素 原 子 の 隣 接 位 に ア ミ ノ 基 も し く は ヒ ド ロ キ シ 基 を 導 入 し た も の で あ る 。 し か し 残 念 な が ら 、 置 換 基 を 有 さ な い 46f と 比 べ 両 化 合 物 の 活 性 は 大 幅 に 減 弱 し 、 こ の よ う な 薬 剤 設 計 は 有 効 で は な い こ と が 示 唆 さ れ た 。
そ こ で 次 に 、 ピ リ ジ ン 5 位 に フ ル オ ロ 基 を も つ 47c お よ び 47d を 評 価 し た 。 化 合 物
45 の ド ッ キ ン グ モ デ ル（ Figure 17）で は 、5 位 フ ル オ ロ 基 は CDK8 の Ile79 お よ び Phe97
66
の よ う に 末 端 位 の モ ル ホ リ ン 環 は 不 可 欠 で あ る 一 方 で 、 こ の 構 造 を も た な い 化 合 物
48b は CYP3A4 TDI 作 用 の 観 点 で は 低 リ ス ク で も あ り 、 や は り モ ル ホ リ ン 環 が TDI の
67
Table 7. B i o l o g i c a l a c t i v it i e s o f 4 6 f , 4 6 k a n d d e r i v a t i v e s 4 8 a − n
CDK8a pSTAT1b CYP3A4 TDIc Solubilitye
68
Table 7(co ntinued)
aInh ibition of kin ase tracer 236 bin ding to h uman CDK8 (n = 2, values in par enth eses in dicate
95% con fiden ce inter val). bInhibition of STAT1 ph osph or ylation (at Ser 727) in duced by IFN -γ in
SW480 cells fixed on a 384 -well plate (values in paren th eses in dicate 95% con fiden ce inter val).
c% r emainin g of CYP3A4 activit y. Tested comp oun ds wer e pr e -in cubated in human liver
micr osomes for 60 min. Test oster on e was added to micr osomes and in cubated for 20 min. dND:
n ot determin ed.
CDK8a pSTAT1b CYP3A4 TDIc Solubilitye
69
第 四 節 48k の in vitro 薬 理 試 験 および in vivo がん増 殖 抑 制 試 験
71 次 に 、 化 合 物 48k の 抗 が ん 剤 と し て の 有 用 性 を 評 価 す る た め 、 3 種 の 代 表 的 な が ん 細 胞 株 で あ る SW480（ 大 腸 が ん ）、 RPMI8226（ ヒ ト 骨 髄 腫 ）、 EOL1（ 急 性 骨 髄 性 白 血 病 ） を 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 試 験 お よ び 細 胞 増 殖 抑 制 試 験 を 実 施 し た 。 Table 8 に 示 す よ う に 、 い ず れ の 細 胞 株 に お い て も 、 化 合 物 48k に よ る STAT1 の リ ン 酸 化 阻 害 作 用 が 確 認 で き た 。 た だ し 、 SW480 株 の 増 殖 抑 制 作 用 に つ い て は 50%を 上 回 ら ず 、 GI50値 を 算 出 す る こ と は で き な か っ た 。 一 方 で 、 RPMI8226 株 と EOL1 株 に お い て は 強 力 な 細 胞 増 殖 抑 制 作 用 が 認 め ら れ た 。 こ う し た 結 果 は 、 リ ン 酸 化 STAT1 は 、 CDK8 阻 害 剤 の タ ー ゲ ッ ト ・ エ ン ゲ ー ジ メ ン ト ・ マ ー カ ー と し て 機 能 す る も の の 、 そ れ が 必 ず し も が ん 細 胞 の 細 胞 増 殖 抑 制 の 感 受 性 に 帰 結 す る わ け で は な い こ と を 示 し て い る 。 し た が っ て 、 今 後 の 臨 床 試 験 を 見 据 え た 際 に は 、 が ん 細 胞 の 感 受 性 を 予 測 し 効 果 の 見 込 め る 患 者 を 選 別 す る た め の バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 が 課 題 と な る 。 Ta b l e 8 . S T A T 1 s u p p r e s s i o n a f t e r 1 d a y t r e a t m e nt wi t h 4 8 k ( W e s t e r n b l o t t i ng : W B ) i n v a r i o u s c e l l l i n e s , a n d t h e c o r r e s p o n d i n g a n t i - p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y ( G I5 0) .
aCell pr oliferation was deter min ed by ATP con tent (SW480 an d RPMI8226) or by n uclear coun t
72
化 合 物 48k は マ ウ ス に お け る PK プ ロ フ ァ イ ル も 悪 く な く 、 ヒ ト 肝 ミ ク ロ ソ ー ム で も 高 い 代 謝 安 定 性 を 示 す こ と が 確 認 さ れ た （Table 9） 。
Ta b l e 9 . G r o wt h i n h i b i t o r y a c t i v i t y , P K p r o f i l e i n m o us e , a nd m e t a b o l i c s t a b i l i t y o f c o m p o u n d 4 8 k
aInh ibition of RMPI8226 tumor cell gr owth. bC
ma x: maximum con cen tration (1 mg/kg, p.o., 0−8h ).
cAUC
p o: ar ea un der th e cur ve (1 mg/kg, p.o., 0−8h ). dMRTp o: mean r esiden ce time in a discr ete
stud y (1 mg/kg, p.o., 0−8h ). eF: bioavailabilit y (1 mg/kg, p.o., 0−8h). f Metabolic stabilit y in
human or mouse h epatic micr osomes.
そ こ で 、 in vivo に お け る 抗 腫 瘍 効 果 の 評 価 に 進 ん だ 。 化 合 物 48k を 1 日 2 回 、 2 週 間 、 15 お よ び 30 mg/kg の 用 量 で RPMI8226 マ ウ ス 異 種 移 植 モ デ ル に 経 口 投 与 し 、 各 群 に お け る が ん 細 胞 の 増 殖 の 経 日 変 化 を 測 定 し た 。 そ の 結 果 を Figure 23A お よ び B に 示 す 。 対 照 群 と 比 較 し て 、 化 合 物 48k 15 mg/kg お よ び 30 mg/kg 投 与 群 は 、 そ れ ぞ れ 29%お よ び 2%の T/C 値 （ 実 験 終 了 時 の 薬 剤 投 与 群 の 対 照 群 に 対 す る 相 対 腫 瘍 重 量 の 比 ） を 示 し 、 30 mg/kg 投 与 群 に お い て 有 意 な 抗 腫 瘍 効 果 が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 体 重 減 少 は 最 大 で も 30 mg/kg 投 与 群 に お け る 12%で あ っ た 。 こ の 値 は 、 こ の 時 点 で は 格 段 に 問 題 と な る 程 度 の も の で は な い が 、 今 後 の 試 験 に よ り 安 全 性 を 見 極 め る 必 要 が あ る （ Figure 23B） 。
Cell Growtha Cmaxb AUC poc MRT pod
73
F i g ur e 2 3 . ( A ) A n t i t u mo r a c t i v i t y a n d ( B ) b o d y w e i g h t l o s s o f 4 8 k i n a R P M I 8 2 2 6
74 第 五 節 小 括 本 章 では新 規 CDK8 阻 害 剤 のリード創 出 、最 適 化 研 究 について述 べた。HTS から見 出 され た化 合 物 45 を起 点 とし、CDK8 阻 害 活 性 の増 強 とともに、良 好 な PK と ADME プロファイルの 両 立 を指 向 して合 成 展 開 を進 めた。文 献 報 告 のあった結 晶 構 造 情 報 より、化 合 物 45 と CDK8 とのドッキング モデルを構 築 し、 化 合 物 の部 分 構 造 毎 に薬 剤 設 計 の指 針 を定 めた （"modular" アプローチ）。まず、化 合 物 45 のパラフルオロフェニル部 位 をヘテロ芳 香 環 へと 代 えて、CDK8 との間 に新 たな水 素 結 合 を形 成 させることを目 論 み検 討 したところ、in vitro 活 性 の大 幅 な向 上 と、良 好 な PK プロファイルを実 現 した。これにより、1-メチルおよび 1-シクロプロピルピラゾール 誘 導 体 を見 出 した。後 の精 査 過 程 において、これらの誘 導 体 は中 程 度 以 上 の CYP3A4 TDI リ スクを もつことが明 らかとなったものの、代 謝 物 解 析 の情 報 を活 用 することで、分 子 末 端 のモル ホリン部 位 が TDI の責 任 構 造 であるとの仮 説 に至 った。そして、この部 位 の変 換 に注 力 した結 果 、架 橋 モルホリンやアゼチジンといった立 体 ひずみの大 きな環 構 造 への変 換 が TDI 作 用 の 大 幅 な減 弱 に繋 がることを見 出 し、代 表 化 合 物 としてアゼチジン誘 導 体 48k を選 出 するに至 っ た。化 合 物 48k は 456 キナーゼパネル試 験 で非 常 に高 い CDK8 および CDK19 への選 択 性
75
第 三 章
がんおけるアミノ酸 代 謝 機 構 の制 御 を指 向 したGCN2 阻 害 剤 の探 索
第 一 節 がん微 小 環 境 下 におけるアミノ酸 代 謝 制 御 に GCN2 が果 たす機 能
76
ピラゾロン類 縁 体 が PKR 様 小 胞 体 キナーゼ（PKR-like endoplasmic reticulum kinase: PERK ） 阻 害 剤 として報 告 された86。PERK は GCN2 と同 じ eIF2キナーゼの一 種 であり、報 告 された化 合 物 のうち複 数 が GCN2 をも阻 害 することが判 明 している。代 表 化 合 物 90 は PERK を DFG-out 型 コンフォメーションに誘 導 し、ピラゾロン 2 位 のフェニル環 は PERK のC へリックス近 傍 の アロステリックポケットに配 置 されることが実 証 されている （type II 1/2 型 ）。 また、最 近 になり報 告 された、化 合 物 91 を含 むスルホンアミド誘 導 体 は、B-Raf 阻 害 剤 であ ると同 時 に GCN2 への結 合 活 性 をもつことが分 かっている87。研 究 チームは、化 合 物 91 が B-Raf に結 合 する様 式 を計 算 的 手 法 により類 推 しており、活 性 ループ部 位 である DFG が折 りたた まれ（DFG-in）、かつC へリックス近 傍 の空 間 が 91 のピリジルスルホンアミド部 位 により充 填 さ れることを提 唱 している（type I 1/2 型 ）。
Figure 24. Reported compounds possessing GCN2 inhibitory or binding activities. Presented
IC5 0 values were measured by in house GCN2 enzymatic assay.
77
Table 10. Comparison of t he general classification of kinase inhibitors
Type I Type II Type I 1/2 Type II 1/2
Binding region ATP binding
site ATP binding site + DFG-out allosteric site ATP binding site + pocket around C-helix ATP binding site + DFG-out allosteric site + pocket around C-helix DFG
co nformatio n DFG-in DFG-out DFG-in DFG-out
Pocket aro und
C-helix No No Yes Yes
ATP
competitive Yes Yes Yes Yes
Estimated pros and co ns of inhibitors ○ : Small size ×: Selectivity ○ : Potency ×: Large size Selectivity ○ : Small size Selectivity ×: Potency ○ : Potency Selectivity ×: Large size Marketed drug to date Gefitinib, Erlotinib Imatinib,
78
Figure 25. Illustration of binding modes of kinase inhibitors. Hydrogen bonds are represented
80
第 二 節 GCN2 高 選 択 的 な type I 1/2 型 阻 害 剤 を指 向 した SBDD を活 用 したリード創 出 戦 略
現 在 までに、GCN2 と低 分 子 リガンドとの共 結 晶 構 造 は報 告 されていない。そこで SBDD によ る合 成 戦 略 の立 案 のため、GCN2 ホモロジーモデルの構 築 、活 用 を検 討 した。
81
Figure 26. Docking study of compound 91 with GCN2 homology model. (A) Chemical
structure of Vemrafenib and compound 92. (B) Left; overview of modeling of compound
91/GCN2 homology model. Right; overlay of a solvent accessible protein surface for the
82 <合 成 > Scheme 20 に 本 章 で 検 討 し た ス ル ホ ン ア ミ ド 誘 導 体 93 a−g の 一 般 的 な 合 成 法 を 示 す 。 一 つ 目 は 、 置 換 芳 香 族 ス ル ホ ニ ル ク ロ リ ド 95 と 3-エ チ ニ ル -2,4-ジ フ ル オ ロ ア ニ リ ン （ 94）8 4と の 縮 合 反 応 か ら 始 ま る 合 成 法 で あ る 。 得 ら れ る ス ル ホ ン ア ミ ド 誘 導 体 96 と ハ ロ ゲ ン 化 芳 香 族 試 薬 97 と の Sonogashira カ ッ プ リ ン グ 反 応 を 行 っ た 後 、 還 元 ・ 脱 保 護 ・ 置 換 反 応 な ど の 各 種 反 応 に よ り 目 的 と す る 誘 導 体 93 へ と 導 い た 。 も う 一 つ は 、 出 発 原 料 94 と 97 と の Sonogashira カ ッ プ リ ン グ 反 応 を 先 に 実 施 し た 後 に 、 中 間 体 98 を 合 成 し 、 95 を 用 い て ス ル ホ ン ア ミ ド 化 す る 合 成 法 で あ る 。 こ れ ら 二 つ の 合 成 法 を 適 宜 使 い 分 け た 。 個 別 合 成 法 に つ い て は Scheme 21 以 降 に 示
す 。
Scheme 20. General synthetic procedure for sulfona mides 93a−g. Reagents and conditions:
83 化 合 物 93a、 93b は Scheme 21 に 示 す 経 路 で 合 成 し た 。 は じ め に 、触 媒 と し て PdCl2(Amphos) と CuI を 用 い て 3-エ チ ニ ル -2,4-ジ フ ル オ ロ ア ニ リ ン（94）と 5-ブ ロ モ -1H-ピ ラ ゾ ロ [3,4-b]ピ リ ジ ン（ 99）と を Sonogashira 反 応 で カ ッ プ リ ン グ さ せ て 得 ら れ た 98 を 、 ピ リ ジ ン 溶 媒 中 で ス ル ホ ニ ル ク ロ リ ド 試 薬 95a も し く は 95b と 反 応 さ せ る こ と に よ り 、 目 的 物 で あ る 93a お よ び 93b を 得 た 。
84
化 合 物 93c の 合 成 法 を Scheme 22 に 示 す 。 ま ず 、 市 販 品 3-ア ミ ノ -2,5-ジ ク ロ ロ 安 息 香 酸 （ 100） の ア ミ ノ 基 を Sandmeyer 反 応 に よ り ク ロ ロ ス ル ホ ニ ル 基 へ と 変 換 し 、 精 製 ・ 単 離 す る こ と な く 先 述 の 中 間 体 98 と 反 応 さ せ る こ と に よ り 101 を 得 た 。 化 合 物
101 の エ チ ル エ ス テ ル 基 を LiAlH4に よ り 還 元 し 、ヒ ド ロ キ シ メ チ ル 体93c を 合 成 し た 。
Scheme 22. Synthetic pr ocedure of the compounds 93c. Reagents and conditions: (a) 100,
NaNO2, HCl, SOCl2, CuCl, water, 0 °C; (b) 98, pyridine, 0 °C, 27 % in 2 steps; (c) LiAlH4, THF, 0 °C to room temperature, 48%. 2-ア ミ ノ ピ リ ミ ジ ン 誘 導 体 93d も 、 や は り 市 販 の 100 を 用 い て 2 工 程 で 合 成 し た （ Scheme 23）。化 合 物 100 の ア ミ ノ 基 を ク ロ ロ ス ル ホ ニ ル 基 へ と 変 換 し た 後 、化 合 物 94 と 縮 合 さ せ 、さ ら に 、エ ス テ ル 基 を 水 素 化 ホ ウ 素 リ チ ウ ム で 還 元 し た 。得 ら れ た 化 合 物 102 の 粗 生 成 物 の 末 端 ア ル キ ン 部 位 と 2-ア ミ ノ -5-ヨ ー ド ピ リ ミ ジ ン （ 103） と を Sonogashira 法 で カ ッ プ リ ン グ さ せ る こ と で 、 目 的 と す る 93 d を 得 た 。
85 化 合 物 93e は Scheme 24 に 示 す 方 法 で 合 成 し た 。 は じ め に 、 市 販 の 5-ク ロ ロ -2-メ ト キ シ ピ リ ジ ン -3-ア ミ ン （ 104） の ア ミ ノ 基 を ジ ベ ン ジ ル ジ ス ル フ ィ ド を 用 い て ベ ン ジ ル チ オ ー ル 基 へ と 変 換 し た 後 、NCS に よ っ て ス ル ホ ニ ル ク ロ リ ド 中 間 体 106 へ と 導 い た 8 9。 次 に 、 ピ リ ジ ン 溶 媒 中 、 中 間 体 106 と ア ニ リ ン 94 と を 縮 合 さ せ 、 続 い て 、 ア ル キ ン 体 107 と ヨ ー ド ピ リ ミ ジ ン 体 103 と を
Sonogashira カ ッ プ リ ン グ さ せ た 。 得 ら れ た 化 合 物 93e の 粗 生 成 物 を DMSO/水 /酢 酸 混 合 液 を 用 い て 再 結 晶 操 作 に 付 す こ と に よ り 、 化 合 物 93e を 酢 酸 塩 と し て 得 た 。
Scheme 24. Synthetic pr ocedure of the compounds 93e. Reagents a nd conditions: (a)
PhCH2SSCH2Ph, CH3(CH2)4ONO, CH3CN; (b) NCS, AcOH, water, 53% in 2 steps; (c) 94,
86
化 合 物 93f の 合 成 法 を Scheme 25 に 示 す 。 ま ず 、 先 述 の ア ル キ ン 中 間 体 107 を Sonogashira 法 で 2-ク ロ ロ -5-ヨ ー ド ピ リ ミ ジ ン と カ ッ プ リ ン グ さ せ て 108 を 合 成 し た 。 続 い て 、 ピ リ ミ ジ ン 部 位 の ク ロ ロ 基 を trans-4-ア ミ ノ ヘ キ サ ノ ー ル に よ っ て 求 核 置 換 反 応 す る こ と に よ り 、 目 的 と す る 93f へ と 導 い た 。
Scheme 25. Synthetic procedure of the compounds 93f. Reagents and conditions: (a) 2
-chlor o-5-iodopyrimidine, DIE A, CuI, Pd(PCy3)Cl2, DMSO, 60 °C; (b) 109, DIEA, C H3CN,
87 化 合 物 93g も や は り 市 販 の ア ニ リ ン 誘 導 体 100 を 利 用 し て 7 工 程 で 合 成 し た（ Scheme 26） 。 す な わ ち 、 ま ず 、 化 合 物 100 を 、 対 応 す る ジ ア ゾ ニ ウ ム 塩 を 経 由 し て ジ ス ル フ ィ ド 110 へ と 変 換 し た 後 、 エ ス テ ル 部 位 を 水 素 化 ホ ウ 素 ナ ト リ ウ ム に よ り 還 元 し て ヒ ド ト キ シ メ チ ル 基 を も つ 化 合 物 111 を 得 た 。次 に 、水 酸 基 を ア セ チ ル 基 で 保 護 し た 後 、NCS と の 反 応 に 付 す こ と で ス ル ホ ニ ル ク ロ リ ド 中 間 体 113 へ と 誘 導 し 、 定 法 に 従 い ア ニ リ ン 体 94 と の 縮 合 反 応 に よ り 化 合 物 114 を 合 成 し た 。 続 い て 、 2-ク ロ ロ -5-ヨ ー ド ピ リ ミ ジ ン と の Sonogashira カ ッ プ リ ン グ 反 応 に よ り ア ル キ ン 115 と し た 後 、最 後 に (R)-2-ア ミ ノ プ ロ パ ン -1-オ ー ル を 用 い て 化 合 物 115 の ピ リ ミ ジ ン 2 位 ク ロ ロ 基 を 置 換 し た 。 こ の 際 ア セ チ ル 基 の 脱 離 も 同 時 に 進 行 し 、 目 的 物 で あ る 化 合 物 93g を 得 た 。
Scheme 26. Synthetic procedure of the compounds 93g. Rea gents and conditions: (a)
(CH3)2CHCH2CH2ONO, PhCH2SSCH2Ph, C H3CN, 70 °C; (b) NaBH4, CaCl2, THF, 0 °C; (c)
Ac2O, DMAP, NEt3, THF, 50 °C, 66% in 3 steps; (d) NCS, AcOH, THF, water, 0 °C to room temperature, 97%; (e) 94, pyridine, 70 °C, 79%; (f) 2 -chloro-5-iodopyrimidine, DIEA, CuI, Pd(PCy3)Cl2, DMSO, 60 °C, 56%; (g) ( R)-2-a minopropan-1-ol, DIEA, THF, 60 °C, 83%.
90
Table 11. Biological activities of compounds 91 and 93a−g
aValues in parentheses indicate 95% confidence interval . bInhibition of human GCN2 enzymatic
activity. cSuppression of ATF4 induction in U2OS cells with amino acid -free medium. dKinetic
solubility was measured at pH 6.8.
Solubilityf compd. Ring A Ring B Enzymeb p-eIF2c ATF4d (μg/mL)
91
筆 者 が 見 出 し た 化 合 物 が 、 細 胞 内 で GCN2 を 介 し た eIF2リ ン 酸 化 を 抑 制 す る こ と を よ り 直 接 的 に 評 価 す る た め 、 化 合 物 91 及 び 93c−e を 用 い 、 ア ミ ノ 酸 飢 餓 条 件 下 の
U2OS 細 胞 株 に お け る eIF2 の リ ン 酸 化 を 評 価 し た 。 そ の 結 果 、 93c−e は eIF2リ ン 酸 化 阻 害 作 用 を 示 し（ Table 12）、Table 11 で 認 め ら れ た ATF4 発 現 抑 制 作 用 の 傾 向 と 一 致 す る こ と が 分 か っ た 。 さ ら な る 解 析 に よ り 、 筆 者 が 合 成 し た ス ル ホ ン ア ミ ド 誘 導 体 の 酵 素 試 験 系 に お け る GCN2 阻 害 活 性 は 、細 胞 試 験 系 に お け る 活 性（ eIF2リ ン 酸 化 阻 害 活 性 及 び ATF4 発 現 抑 制 作 用 ） に 良 く 相 関 す る こ と も 確 認 し た （ Figure 27） 。 一 方 で 、 別 途 合 成 し た PERK へ の 高 い 選 択 的 阻 害 作 用 を も つ 化 合 物 群 で は 、 そ の よ う な 明 確 な 相 関 が 認 め ら れ な か っ た （ Figure 28） 。 こ れ ら の 結 果 よ り 、 筆 者 が 同 定 し た ス ル ホ ン ア ミ ド 誘 導 体 は 、 細 胞 内 で の GCN2 阻 害 作 用 を も つ も の で あ る と 結 論 付 け た 。
Table 12. Inhibitory activities of eIF2 phosphorylation of compounds 91 and 93c–e in U2OS cells during amino acid starvation
compd. 91 93c 93d 93e p-eIF2a IC5 0 (nM) >10000 78 (35 - 170) 160 (110 - 240) 460 (350 - 610)
aInhibition of eIF2 phosphor ylation in U2OS cells with amino acid -free medium. Values in
92
Figure 27. Correlation of GCN2 enzyme inhibition with suppression of eIF2
phosphorylation (A) and ATF4 expression (B) in U2OS cells with amino acid -free medium b y sulfonamide derivatives. Pearson's correlation coefficient and number of compounds are shown in each graph. Compounds with good cellular permeabilities (PAMPA (pH7.4) > 50 nm/s) were used for this analysis, and the compounds reported in this manuscript are highlighted in red.
Figure 28. Correlation of PERK enzyme inhibition with suppression of eIF2
93
そ こ で 、GCN2 阻 害 活 性 お よ び 水 へ の 溶 解 度 に 優 れ た 化 合 物 93d−g を 選 択 し 、PK プ ロ フ ァ イ ル お よ び GCN2 へ の 結 合 反 応 速 度（ binding kinetics）を 解 析 し た 。結 果 を Table 13 に 示 す 。
Table 13. Pharmacokinetic parameters and kinetics data of compounds 91 and 93d−g
PKa
Cmaxb CLc AUCpod MRTpoe
Ff(%) fupg Dilution assayh compd. (ng/mL) ( mg/h/kg) (ng/mL*h) (h) T1/ 2 (min.) 91 45 801 93 1.8 7.0 NTi NTi 93d 1201 313 2588 1.7 79.9 0.03 >1440 93e 2469 48 13389 3.2 63.5 0.04 381 93f 1372 150 3578 1.9 51.9 <0.01 236 93g 124 835 163 1.6 13.5 <0.01 >720
aCassette dosin g test in C57BL/6J mice (1.0 mg/kg, p.o. an d 0.1 mg/kg, iv). bCmax: maximum
con centr ation (1 mg/kg, p.o., 0−8h ). cCL: clearan ce. dAUCpo: ar ea un der th e cur ve (1 mg/kg, p.o.,
0−8h). eMRTpo: mean r esiden ce time (1 mg/kg, p.o., 0−8h). fbioavailability (1 mg/kg, p.o. an d
0.1 mg/kg, i.v., 0−8h). gFr action un boun d in plasma. hAssay pr otocol is sh own in exper imen tal
section. iNot tested.
化 合 物 91 に お い て は 、そ の PK プ ロ フ ァ イ ル が 課 題 の 一 つ で あ っ た が 、マ ウ ス カ セ ッ ト ド ー ジ ン グ 試 験 の 結 果 、 化 合 物 93d−f は 良 好 な プ ロ フ ァ イ ル を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。化 合 物 91 と 93d−f と の 間 に 、肝 ミ ク ロ ソ ー ム に お け る 安 定 性 や 細 胞 膜 透 過 性 に 大 き な 差 異 は 認 め ら れ ず 、一 方 で 、化 合 物 93d−f の 水 に お け る 溶 解 度 が 、91 に 比 べ 向 上 し て い る こ と （ Table 11） か ら 、 こ れ が 良 好 な PK に 寄 与 し て い る と 推 察 し た 。
さ ら に 、GCN2 へ の 結 合 滞 留 時 間（ target residence time）の 測 定 に よ り 特 筆 す べ き 点 が 明 ら か と な っ た 。す な わ ち 、分 子 右 端 の 環 B の メ タ 位 に ヒ ド ロ キ シ メ チ ル 基 を も つ
93d お よ び 93g に お い て 、 当 該 置 換 基 を 有 さ な い 93e お よ び 93 f と 比 較 し て 結 合 滞 留
