序 文
尿道カテーテル留置は，医療現場で日常的に行 われている治療手段の一つである．通常，留置期 間が 1 カ月を越える場合を長期留置というが，こ の場合にはカテーテル表面に細菌バイオフィルム が形成され，慢性持続感染症の発症が避けられな い．長期留置例における合併症としてのカテーテ ルの閉塞，結石形成，有熱性感染症（前立腺炎，
精巣上体炎，腎盂腎炎，敗血症）などはすべてこ の 細 菌 バ イ オ フ ィ ル ム に 起 因 す る と 考 え ら れ る
1）．
クエン酸銀とレシチンを配合した新しい抗菌性コーティングカテーテル 素材のバイオフィルム形成阻止効果に関する検討
―Robbins device を用いた解析―
岡山大学泌尿器科（＊現・川崎医科大学附属川崎病院泌尿器科）
橋本 英昭
＊（平成 13 年 4 月 16 日受付）
（平成 13 年 5 月 9 日受理）
クエン酸銀，レシチン，液状シリコンを 2：2：8 で配合した新しい抗菌性コーティングカテーテル素 材の抗バイオフィルム効果を modified Robbins device を使用するin vitro実験系で検討した．Pseudo-
monas aeruginosa2 株，Escherichia coli1 株を用いて，細菌付着抑制効果，付着菌に対する増殖抑制効果お
よびその持続性を観察した．P. aeruginosa1 株とE. coliでは，強い細菌付着抑制効果を認めた．バイオフィ ルム形成能の極めて強いP. aeruginosa14―210 株は，シリコンでは mature なバイオフィルムを形成した のに対して，本抗菌性カテーテル素材では散在性に付着するのみであった．また，表面に一旦付着した
P. aeruginosa14―210 株は，本抗菌性カテーテル素材より溶出する銀イオンにより，その増殖が抑制され
た．さらにこれらの抗バイオフィルム効果は少なくとも 48 時間の人工尿処理後にも減弱を認めなかっ た．
〔感染症誌 75：678〜685，2001〕
要 旨
別刷請求先：（〒700―8505）岡山市中山下 2―1―80 川崎医科大学附属川崎病院泌尿器科
橋本 英昭
Key words： urethral catheter, silver citrate, lecithin, anti-biofilm effect
Fig. 1 Experimental system using a modified Rob- bins device
A
A B B
C
C D D
われわれは，先にクエン酸銀とレシチンを液状 シリコンに配合し，シリコンシートに塗布した新 しい抗菌性素材が抗菌力および持続性にすぐれて いることを報告した
2）．次いでこの抗菌性素材を 内腔面および外表面に使用した抗菌カテーテルの 抗菌力および持続性を，管内性，管外性実験モデ ルを考案し市販の抗菌カテーテルよりも明らかに 優れていることを報告した
3）．今回は， この新しい 抗菌性素材の細菌バイオフィルムに対する効果
を，modified Robbins device を 用 い た in vitro 実 験モデルで検討したので報告する．
材料と方法
1．使用菌株
岡山大学泌尿器科で尿路感染症患者の尿から分 離した Pseudomonas aeruginosa OP 14―210 株，OP 14―291 株 お よ び Escherichia coli K108AC 株 を 使 用した．
2．材料
Fig. 2 SEM of uncoated silicon（A, B）and silver lecithin coated-silicon（C, D）after contact withP. aeruginosa14―210
A, C：8hrs contact. B, D：24hrs contact
A
A B B
通常のシリコン （N S） とクエン酸銀，レシチン，
液状シリコンを 2：2：8 で配合し，シリコンシー トの表面にコーティングした抗菌性シリコン（SL
S）を使用した．
3．細菌付着抑制効果の検討
細菌バイオフィルムの作成には，当教室におい て以前より使用している人工尿路モデル
4）〜6）を用 いた（Fig. 1） ．バイオフィルムサンプラーである modified Robbins device の 10 個の sampling port に，直径 10mm の円形に切り抜いた SL S あるい は N S のディスクを装着した．試験菌を 2 代継代 培養し，人工尿
7）に終濃度が 10
6cfu ml となるよう modified Robbins device 内 を 37℃ に て 40ml hr の流速で灌流し，装着した SL S および N S ディ スク表面を走査型電子顕微鏡で観察した．
P. aeruginosa OP 14―210 株 で は，灌 流 開 始 後 8,24 時間，P. aeruginosa OP 14―291 株では灌流開 始後 24 時間，E. coli K108AC 株では灌流開始後 72 時間で観察した．
4．付着菌に対する増殖抑制効果の検討 N S 及び SL S を modified Robbins device に 装着し，試験菌を 3 時間灌流した後，
1）LVFX 1MIC 含有人工尿 2）LVFX 3MIC 含有人工尿
に交換し，24 時間灌流後に表面を走査型電子顕微 鏡で観察した．試験菌は P. aeruginosa OP 14―210 株を使用した．なお， P. aeruginosa OP 14―210 株に 対する LVFX の 1MIC は 3.125
µg ml を示した．
5．付着菌に対する増殖抑制効果の持続性 N S 及び SL S を modified Robbins device に 装着し，人工尿で 48 時間前処理した後，4．と同様 に試験菌を 3 時間灌流後，LVFX 3MIC 含有人工 尿に交換し，24 時間後に観察した．試験菌は P.
aeruginosa OP 14―210 株を使用した．
6．走査型電子顕微鏡用試料の作成
試料を 2.5％ グルタールアルデヒドーリン酸緩 衝 溶 液 （phosphate-buffer saline；PBS） （PH 7.4） ， タンニン酸および 1％ 四酸化オスミウムー PBS
（PH 7.4） にて固定，エタノール系列で脱水した後，
臨界点乾燥，白金―パラジウム蒸着を行った．S- 570 型 走 査 電 子 顕 微 鏡（Hitachi Ltd. Tokyo, Ja- pan）を用いて，加速電圧 15kV で観察した．
成 績
1．細菌付着抑制効果
1）P. aeruginosa OP 14―210 株
N S では 8 時間の灌流で，菌は全面に付着・増 殖し強固なバイオフィルムを形成していた（Fig.
2A） ．さらに，24 時間の灌流ではバイオフィルム
Fig. 3 SEM of uncoated silicon（A）and silver lecithin coated-silicon（B）24hrs aftercontact withP. aeruginosa14―291
A
A B B
は重層化し，より強固になっていた （Fig. 2B） ．こ れに対して， SL S では 8 時間の灌流では菌は一部 集塊状に付着を認めるものの，細菌付着のない面 の方がはるかに優位であった （Fig. 2C） ．また，24 時間の灌流でも菌の付着は部分的であった（Fig.
2D） ．
2）P. aeruginosa OP 14―291 株
N S では 24 時間の灌流で全面に菌の付着が認 められ，一部重層化している（Fig. 3A）のに対し て，SL S では細菌の付着は全く認められなかっ た（Fig. 3B） ．
3）E. coli K108AC 株
N S では全面一様に菌の付着を認めた（Fig. 4 A） ．これに対して SL S ではごく一部に菌の付着 を極めて散在性に認めるのみであった （Fig. 4B） ．
2．付着菌に対する増殖抑制効果
N S で は P. aeruginosa 14―210 株 の 3 時 間 灌 流 後にディスク表面に散在性，一部集塊状に付着し た菌が認められた （Fig. 5A） ． これらの付着菌は，
LVFX 1MIC 含有人工尿で 24 時間灌流する間に，
菌体は伸長化しながらシリコンディスク表面で増 殖し， バイオフィルムを形成していた （Fig. 5B） ． また，LVFX 3MIC 含有人工尿においても同様に バイオフィルムの形成が認められた （Fig. 5C） ．一
方，SL S では，3 時間の灌流ではごく一部に菌の 付着を認めるのみであった（Fig. 5D） ．LVFX 1 MIC 含有人工尿に交換して 24 時間灌流後には，
菌の付着は散在性ではあるが明らかに増加してい たが，付着菌の溶菌に伴うと思われる多数の cell debris と，微小顆粒物質を認めた （Fig. 5E） ．一方，
LVFX 3MIC 含有人工尿の 24 時間灌流後には付 着菌の増殖は完全に抑制されていた（Fig. 5F） ．
3．付着菌に対する増殖抑制効果の持続性 48 時間の人工尿での前処理を行った場合，P.
aeruginosa OP 14―210 株 の 3 時 間 灌 流 後 の SL S デ ィ ス ク 表 面 へ の 菌 の 付 着 は ご く 少 数 で あ り
（Fig. 6A） ，未処理の場合とほぼ同様の成績であっ た．また，LVFX 3MIC 含有人工尿に交換後，24 時間では伸長化し菲薄化した細菌の付着を散在性 に認めるものの（Fig. 6B） ，対照の N S（Fig. 5C 参照）とは全く異なる様相を呈していた．
考 察
一般に，尿路へのカテーテル留置は，院内感染 症の主因であり，院内でみられる致死的なグラム 陰性菌敗血症の最大の誘因と考えられている．閉 鎖式導尿回路をいかに無菌的に管理しても，尿路 への細菌の定着は 10 日から 2 週間以内に半数の 患者に生じる
8）．また， ひとたび生じた尿路への細
Fig. 4 SEM of uncoated silicon（A）and silver lecithin coated-silicon（B）24hrs aftercontact withE. coliK108AC
A
A B B C C
D
D E E F F
菌の定着は，カテーテルを抜去しないかぎり困難 であり，留置期間の延長に伴い尿路感染症はほぼ 全例に発症する．しかも，カテーテル留置患者か らの分離菌は，P. aeruginosa を中心とする弱毒グ ラム陰性桿菌が多数を占める．複数菌感染症の占 める割合も，カテーテル非留置例での複雑性尿路 感染症の 10〜15％ に対して 20〜30％ と有意に高 率となり
9），個々の患者の管理だけではなく院内 感染対策上の主要課題となる．この難治化の主た
る要因として，尿路に侵入してきた細菌が，留置 カテーテル表面に付着・定着し，バイオフィルム を形成することが挙げられる． そこで， バイオフィ ルム対策を施した種々の新しい抗菌性素材，抗菌 性カテーテルが研究・開発され，なかでも，銀イ オンはバイオフィルム形成菌に対して他の抗菌剤 よりも極めて低濃度で有効であり
6），銀イオンの 抗菌作用を応用した抗菌性カテーテルが最も種類 が多く開発・市販されている．
Fig. 5 SEM of uncoated silicon（A, B, C）and silver lecithin coated-silicon（D, E, F）3 hrs after contact withP. aeruginosa14―210（A, D）and subsequently 24hrs after con- tact with artificial urine containing LVFX 1MIC（B, E）or LVFX 3MIC（C, F）.
A
A B B
我々も，クエン酸銀，レシチン，液状シリコン を 2：2：8 で配合し，シリコンシートに塗布した 新しい抗菌性素材 （SL S） を開発し， クエン酸銀，
レシチンの選択に至る過程とその抗菌効果，なら びに内外面に SL S を使用した試作カテーテルの 抗菌効果を管内性，管外性モデル実験を行い報告 した
2）3）．SL S のバイオフィルム形成阻止効果と しての抗菌効果と細菌付着抑制効果のメカニズム については， 以前にも報告したが
2）3），SL S より溶 出する銀イオンが最も主要な役割を担っている．
銀イオンの抗菌作用そのものは紀元前より知られ ており，グラム陽性菌，グラム陰性菌，好気性菌，
嫌気性菌と幅広いスペクトラムを有する作用が認 められ，その殺菌作用機構として 1）電子伝達系 阻害，2）細胞膜損傷，3）DNA との結合，の 3 つ が報告され，このうち 2） の機構が有力であるとい われている
10）．もう 1 つは，SL S に配合されてい る界面活性剤であるレシチンによる細菌付着抑制 効果があげられる．界面活性剤は菌表面の細胞壁 に吸着され，菌の働きを妨害することにより細菌 付着を抑制するとされている
11）．バイオフィルム はカテーテル表面に細菌が付着，定着後，菌体外 多糖が産生され形成されていくため，細菌のカ
テーテル表面への付着を抑制することによりバイ オフィルムの形成が抑制されると考えられる．今 回は，この新しい SL S の抗バイオフィルム効果 を modified Robbins device を使用する in vitro 実 験系で検討することを目的とした．本実験系にお いても，SL S は，細菌付着抑制効果および付着菌 の増殖に対する抑制効果を示すことが確認され た．
本実験系では 10
8cfu ml を超える菌量が灌流さ れ，実際の臨床での感染防止を考える条件に比べ て格段に菌量が多いこと，また今回，主に使用し た P. aeruginosa OP 14―210 株は，他菌株に比較し，
極めてバイオフィルム形成能の高い菌株であるこ と
4）から，細菌付着抑制効果の評価は 24 時間の時 点で実施した．文献的にも modified Robbins de- vice を使用する実験系では，同様に比較的短時間 で評価している．McLean らは，modified Robbins device を使用する実験系で，銀・銅コーティング カテーテル素材 へ の P. aeruginosa の 付 着 は，14 時間では，対照のカテーテル素材に比べ，有意に 少 な か っ た と 報 告 し て い る
12）．ま た，Liedberg らも modified Robbins device を使用す る 実 験 系 で，ラテックスと金属銀コーティング素材の P.
Fig. 6 SEM of uncoated silicon（A）and silver lecithin coated-silicon（B）48hrs after prewashing, 3hrs after contact withP. aeruginosa14―210 and subsequently 24hrs af- ter contact with artificial urine containing LVFX 3MIC.
aeruginosa によるバイオフィルム形成過程を比較 観察し，10 時間では，金属銀コーティング素材で 細菌付着抑制が認められたと効果を報告してい る
13）．
さらに，今回はバイオフィルム形成能の極めて 高い P. aeruginosa OP 14―210 株を用いて，3 時間 灌流後の付着菌の，その後の増殖を観察すること とした．この場合， P. aeruginosa を含まない新しい 人工尿に交換するだけで，3 時間の灌流で付着し た菌のみの増殖様式が観察できると理想的であ る．しかし，実際にはシステム内に残存する細菌 により交換した人工尿中で時間の経過とともに
P. aeruginosa が増殖し，結果としては先の実験と
同様に高い菌量の浮遊液を再灌流することにな る．そこで，新たに交換する灌流液に 1MIC ない し 3MIC の LVFX を添加した．LVFX 1MIC を添 加した系では，modified Robbins device を含む全 体のシステム内で菌の増殖が完全に抑制できない ため，灌流時間の経過とともに，新たな付着菌が 増加していた（Fig. 5E）．しかし，SL S 素材から 溶出する銀イオンの効果により付着菌の多くは溶 菌することが確認された．一方，LVFX 3MIC は modified Robbins device を 含 む 全 体 の シ ス テ ム 内での浮遊菌の増殖を抑制するのには充分な濃度 であるが， 付着菌には必ずしも殺菌的に作用せず，
時間の経過とともに明らかなバイオフィルム形成 を認めた
14）．ただし，バイオフィルム形成のある 程度の抑制を認め，1MIC の場合（Fig. 5B）と異な り，伸長化した菌の溶菌像と溶菌に伴う顆粒状物 質の付着を認めた （Fig. 5C） ．この 3MIC の LVFX 添加の系では，SL S 上での菌の付着は 24 時間後 に認められないことから，3 時間で付着した菌の 増殖は完全に抑制できるものと考えられた．
今 回 は P. aeruginosa 及 び E. coli に 対 し て 実 験 を行い，他の菌種に対しては検討を行っていない が，SL S を内腔面および外表面に使用した試作 カテーテルの管外性実験において
3），S. aureus に
対して E. coli と同等以上の効果を認めたこと，ま
た，グラム陽性菌は尿路への定着性が低いことか らも他の菌種に対しても問題はないと考えられ る．
最終的には，これらの付着抑制ならびに増殖抑 制効果の持続期間が最も問題となる．本モデルで の実験条件は通常の臨床レベルに比べて極めて厳 しい条件であると考えられるが，結果として，人 工尿の 48 時間での前処理後にも SL S の細菌付 着抑制効果は変わらず （Fig. 6A） ，しかも付着菌の 増殖に対する抑制効果も持続していた （Fig. 6B） ． このことは，SL S を内腔面および外表面に使用 した試作カテーテル片の抗菌力試験において
3），7 日間の人工尿処理後にも E. coli に対する抗菌効 果が持続していたこと，さらに，この試作カテー テルの溶出銀濃度の測定では，7 日後にも約 200 ppb の銀濃度が認められたことから考えると，少 なくとも 7 日間程度の効果は期待されると思われ る．今後は，この抗菌効果ならびにバイオフィル ム形成阻止効果の持続力を実際のヒトでの臨床で 確認する必要があると考えられる．
稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を頂いた恩師公文 裕巳教授， 研究遂行にあたり御協力頂いた大野勝雄技官，
光畑律子技術補佐員に深謝いたします．
文 献
1）公文裕巳：尿路におけるバイオフィルム感染症．
臨泌 1999；53：7―16.
2）橋本英昭，小野憲昭，門田晃一，公文裕巳，斯波 徹，安達俊明，他：抗菌性尿道留置カテーテルの 開発に関する基礎的研究（第 1 報）―抗菌性コー ティング素材の開発―．感染症誌 2000；74：
431―40.
3）橋本英昭，小野憲昭，門田晃一，公文裕巳，斯波 徹，安達俊明，他：抗菌性尿道留置カテーテルの 開発に関する基礎的研究（第 2 報）―新しい抗菌 性 カ テ ー テ ル 抗 菌 力 と 持 続 性―．感 染 症 誌 2000；74：441―9.
4）西谷嘉夫：In vitro実験モデルによる複雑性尿路 感染症の解析．西日泌尿 1991；53：717―27.
5）小野憲昭：緑膿菌バイオフィルム解析法として の glycocalyx 簡易定量法と ATP 測定法．日泌尿 会誌 1995；86：1440―9.
6） Kumon H ： Pathogenesis and management of bacterial biofilms in the urinary tract . J Infect Chemother 1996；2：18―28.
7）Minuth JN, Musher DM, Thorsteinsson：Inhibi- tion of the antimicrobial activity of gentamicin by urine. J Infect Dis 1976；133：14―21.
8） Kunin CM , McCormack RC ： Prevention of catheter-induced urinary-tract infections by ster-
ile closed drainage. N Engl J Med 1966；274：
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9）公文裕巳：カテーテル留置複雑性尿路感染症の 病態と治療学．化学療法の領域 1990；6：267―
73.
10）山本則幸，加藤秀樹：無機物系抗菌剤の特長とそ の応用．防塵防黴 1998；26：581―6.
11）鎌田薩男：界面活性剤．臨 床 検 査 1986；30：
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12）McLean RJC, Hussain AA, Sayer M, Vincent PJ, Hughes DJ, Smith TJN：Antibacterial activity of
multilayer silver-copper surface films on catheter material. Can J Microbiol 1993；39：895―9.
13）Liedberg H, Lundeberg T：Silver coating of uri- nary catheters prevents adherence and growth of pseudomonas aeruginosa. Urol Res 1989；17：
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14）Kumon H, Ono N, Iida M, Nickel JC：Combina- tion effect of fosfomycin and ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm . Antimicrob Agent Chemother 1995；39：1038―
44.
Evaluation of the Anti-biofilm Effect of a New Anti-bacterial Silver Citrate Lecithin Coating in an In-vitro Experimental System Using a Modified Robbins Device
Hideaki HASHIMOTO
Department of Urology, Okayama University School of Medicine
