古細菌Thermoplasma volcaniumの全ゲノムDNAの塩基 配列の決定と情報科学的解析

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

古細菌Thermoplasma volcaniumの全ゲノムDNAの塩基 配列の決定と情報科学的解析

川嶋, 剛

https://doi.org/10.11501/3180684

出版情報：Kyushu University, 2000, 博士（薬学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：

DNAの塩基配列の決定

3-5

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3-5-1

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で作成したM13mp19RFを使用した。 サブクローンライブラ ーの作成(2-5-3 )

DNAは図5 に示した。 サブクロ 凶 リーの作成にffJし1たλクローンのイン サ-ト

クローンとコスミドクローンのアガロ 一/ライフラリーの作成に用いた

BAC

BACクローンとコ これらの泳動像から、

ースケル電気泳動像を凶8に示した。

DNAの混入は少ないと判断して電気泳動 大腸菌ゲノム

スミドクローンには、

を超音波切断し、

T4

そのまま超音波切断をおこなった。

DNA

で粕製せずに、

ボリヌクレオチドキナーゼとDNAポリメラーゼクレノ-断片により5' 突出末

T4DNAポリメラーゼにより3' 突出末 品iの干滑化と末端リン酸化をおこない、

ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。 約 DNAは、

以jの平滑化した

1-2ktヲpのDNAI断片を多く含むゲルの部分を切り出した(図9)。約1-2kbpのDNA 大腸闘に対して形質転換を M13mp 19RF に組み込み、

lüj- ₎ �・をゲjレから[

[11収し、

100-200μl

おこなった。 形民転換をおこなった大腸関を懸濁したSOC培地の

〈

200前後の白プラークが得られることが分か aクローンを単離して培養するには適当であった。

1\113サプクローンの一本鎖DNAの調整 フレートt�にまいた場台、

このi密度は、

をLB ーた。

3-5-2

r ∞ 図

本鎖DNAの0.7%ア力口

[';(1 10にMI3サブクローンライブラリーからf尋た

よ)�)

ースゲル電気泳動{象をノ示した。いずれの一本鎖DNAも、3-4ng/μlの濃度のDNA

シークエンス反応をおこなうのに十分であった。

54

これらの量は、

であった。

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Ml

|χ19、 組rr�皮切断断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動{象。

Ml、 M2はともに分子量マーカ一、 Mlは入DNAのHind III分解物、

M2はめX174のH

inc

II分解物。 1と2はどちらも超音波切断をおこない、

末端処Jlnをした後のDNAの電気泳動像。

1、 2の黒抜きに見える部分を切出した。

56

M2

2

3・5・3 M13サプクローンインサートDNAのPCRによる増幅

M13ファージから a本鎖DNA を調整する実験 は、 煩雑で時間がかる。 シー クエンス以応 では、 占本鎖DNAを鋳型にした場合と比べて、 PCR産物を鋳型 にした場介では、 得られる DNA の塩基配列データの質が劣ると予想して手備 尖験をおこなった結果、 どちらも差が無いことが明かとなった。 そのためシー

クエンス反応に用いる鋳型DNAを、 M13サブクローンの一本鎖DNAからM13

サフクローンインサ-トDNAを増幅したPCR産物に変更した。 図11に、

M13

サフクローンのインサ-ト

DNAのPCR

産物の電気泳動像を示した。 ここで示 したPCR 産物は、 λクローンB17の M13 サブクローンを鋳型 として用いたも のである。

PCR

産物は、 すべて1kb以上の分子量であった。 濃度もシークエン ス反応に卜分な量が得られた。

PCRによる増幅が見られないサンプルも存在し

た(凶11 、 H10 )。 このようなサンプルの番地には、 予備のプレートから良好な サンプルを補充するか、 もしくはこのまま 96 サンプルに対して塩基配列決定

のための反応をおこなった。

3-5-4 M13サプクローンの塩基配列の決定

[';([ ^{1 1に'J}

\したサンプルをA

BIPrism37 7XLで解析した結果、 B02" C03、 B04、

806、 807、 G08、 FIO、 E12の8サンプルを除いて、 良好な塩基配列の波形デ ータが(�fられた。 、F均的な波形データの一部を図12 に示した。 塩基配列のア ヅ七ンブルを迅速に、 正佐に進めるためには凶12 と同程度の良好な波形デー タを仰ることが必要である。 このため、 関12 と[u]等の波形データのみ採用し た。 それより劣るものは全て破棄した。 塩基配列決定の成功率(配列データが 何られたケローン/反応した全クローン) は、 このサンプルの場合、

91.7%であ

58

った。

A 1からH6までの

48サンプルで、 破棄したサンプルが4 サンプル、 採用し たサンプル の平均読み取り塩基数(初めてN が出現するまでの塩基数)は753.7bp であった。

3・5・5 入クローンのインサートDNAの塩基配列の決定

λクローンの塩基配列の決定の一例として、 λクローン817のM13サブク ローン256本(96穴プレート3枚分) のシークエンスが終fしたときの、 M13 サブクローンの塩基配列の連結状態を図

13に示した。

この時点で、 矢印で心 したλ左アームの5'端からの距離が8，349 bpから8ヲ413 bpまでの65旬、9，094hp から9，221bpまでの127bp、 そして20，344 bpから20 ，773 bpまでの429bp の3問 所が1本のM13サブクローンのみで決定されていた(凶14の矢印lから3)。

これらの領域をはさんで、 それぞれプライマーを合成し、 これらの領域を合む

DNA断片を個々にPCR

で増幅した。

DNA断片が得られたことを佐itして(凶 15 )、 PCR産物精製用キットで処理した後シークエンス反応 をおこなった。

PCR 産物の塩基配列とλクローンB17のM13 サブクローンとの塩基配列を Sequencherによって連結した結果 を図16にï]えした。 この実験によって、 日立 しか塩基配列が読まれていない領域がPCR産物の直接塩基配列決定法により倣' 定した。 これにより、 入クローン817のインサ-トDNAの出幕配列が決定し た。 このようにして、 最終的には121制の入クローンのインサー卜DNAの出 基配列を決定した。

59

入OB17.H02.10クローンの波丹三ファイル。

このH02.10クローンは平均読み取り塩基数である753塩基自にNが始めて現われた。

このクローンの塩基配列、 753塩基をλクローンの塩基配列決定に使用した。

rITCGA'1TA位AGαYAAATA

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図12、

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|文113、 λクローンB17のM13サブクローン256本(96ン'(プレート3牧)のシークLノスかれfしたl立|柄ての、

サブクローンの塩基配列のSequencherによる述結状態。

矢印で示したi、 2、 3の部分が、 14，のクローンで決定されていた領域。

コンティグ

ー番ドの俸は連結の状態をあらわす。

黒線， lE逆liLj}jlílJで決定された倣減。

格子;同 -hrtl]で2つ以上のクローンが重悔している領域。 斜線とfi; 本のλで決定された領域c 俸の布端にλクローンB17の長さをぶした。 ii�f _tí.は_{わ p}。

62

OB17.E02.30 OB17.C04.30 OB17.H02.20

t8 2 8 1

OBI7.C04.30 OB17.H02.20

# 834 1

OBI7.H02.20 OB17.Fl1.20 OBI7.BIO.20 OBI7.AI0.20 OB17.A07.20

K 8401

OBI7.H02.20 OB17.Fl1.20 OBI7.BI0.20 OBI7.AIO.20 OBI7.A07.20

j 84 6 1

OBI7.H02.20 OB17.Fl1.20 OBI7.BI0.20 OBI7.AI0.20 OBI7.A07.20

# 852 1

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CATAACATAA AGTACTATGG CTACAGCATG CGAAAGGTTA TAGACAGGAT AATCTGGATT

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ACCAGGTATA TATATAAAAT AATTGCAAAG ATCAAGCTCC TCGTTTCTCA GACCATCGTC

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λク[lーン817の配列の内、

_l

本のM13クローンで決定されている図13、 矢印1の領域c

1本のMl3ケuーンで決定主れている領I或を黒線で[J司った。

63

OB17.A07.20 OB17.G06.10

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OB17.A10.20 OBI7.A07.20 OB17.G06.10

B061

OBI7.G06.10 B 121

OB17 .G06. 10 OBI7.A07.10 OB17.F07.30 OBI7.D06.10

19181

OB17.G06.10 OBI7.A07.10 OBI7.F07.30 OBI7.D06.10 OBI7.D02.10 OBI7.G06.30

#9 2 41

CAGCTGGCTG CTCAGCCGTA GTTTCCGTCT TATTCTGCTC CTCTCCCTTT CCCTTTTCGT TTCTGCTC CTCTCCCTTT CCCTTTTCGT

CAGCTGGCTG CTCAGCCGτA GTTTCCGTCT TATTCTGCTC CTCTCCCTTT CCCTTTTCGT

ACTTTTCAGT TATGAGTATA TCCAGACCTG GTA ACTTTTCAGT TATGAGTATA TCCAGACCTG GTA

ACTTTTCAGT TATGAGTATA TCCAGACCTG GTATATACTT CCTAGCGGTG TTGACTATAG

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TCACTTTTTC AGCCGTATCT GTTATTGTAC CATTTATCTT ATACτTATAA τATACTTTCT

図14-2、 入クローンB17の配列の内、 1本のM13クローンで決定されている凶13、 矢印2の領域。

1本のM13クローンで決定されている領域を黒線で闘った。

64

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矢印3の領域。

λクローンB17の配列の内、 1本のMl:1クローンで決定されていた図13、

1本のMI:1ク口一ンで決定されている領域を黒線で阿

った。

65

凶J

4

-:1、

OB17.E02.30 OB17.C04.30 OBI7.001.1F

OB17.H02.20 OBI7.001.1R

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OB17.C04.30

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OB17.001.1R

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OBI7. 001. lF

OB17.H02.20 OBI7. 001. lR

OB17.Fl1.20 OB17.B10.20 OB17.AIO.20 OB17.A07.20

N ^{8 401}

OB17.001.1F OB17.H02.20 OB17.001.1R

OB17.Fl1.20 OB17.B10.20 OB17.AIO.20 OB17.A07.20

#8461

TCTCTCAGTG ATCATAGATC TGCCAATTAT GCGTCTAAGC ATGACTTCTG CA

TCTCTCAGτG ATCATAGATC TGCCAATTAT GCGTCTAAGC ATGACTTCTG CATTGCGCAT T CTCTCAGTG ATCATAGATC τGCCAATTAT GCGTCTAAGC ATGACTTCTG CATTGCGCAT TCTCTCAGTG ATCATAGATC TGCCAATTAT GCGTCTAAGC ATGACTTCTG CATTGCGCAT TCTCTCAGTG ATCATAGATC TGCCAATτAT GCGTCTAAGC ATGACTTCTG CATTGCGCAT

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CATAACATAA AGTACTATGG CTACAGCATG CGAAAGGTTA TAGACAGGAT AATCTGGATT

lχ116 -1、 λケ口一ン817の配列の内、 1本のM13クローンで決定されていた図13の矢印1の領域。

1 4�のM13クローンで決定されていた領域を黒線で囲った。 PCR産物をシークエンスして

得た福本配列のドに線を入れた。

67

OB17.A10.20 OB17.A07.20 OBI7.002.1F OB17.G06.10

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OB17.AI0.20 OB17.A07.20 OBl7.002.1F

OB17.G06.10

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OBI7.002.1F OB17.G06.10

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OB17. 002. lF

OB17.G06.10 OB17.A07.10 OB17.F07.30 OB17.D06.10

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OB17.G06.10 OB17.A07.10 OB17.F07.30 OB17.D06.10 OB17.D02.10 OB17.G06.30

# 9241

CAGCTGGCTG CTCAGCCGTA GTTTCCGTCT TATTCTGCTC CTCTCCCTTT CCCTTTTCGT CAGCTGGCTG CTCAGCCGTA GTTTCCGTCT TATTCTGCTC CTCTCCCTTT CCCTTTTCGT Cr'1'r，に「ヤr， r'1'('Aにrrに中^A にT中中rCG1'Cヤ '1'A中中r1'にr'1'r r中r1'rrr中'1'1' rrr'1''1''1'中rr.'1'

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図16-2、 λクローン817の配列の内、 1本のM13クローンで決定されていた凶13の矢印2の領域。

1本のM13クローンで決定されて

いた領域を黒線で阿った。

PCR産物をシークエンスして得た

塩基配列の下に線を入れた。

68

OB17.E03.10 OB17.D04.10 OBI7.H06.10 OBI7.H11.30

OBl7.003.1F 120341

OB17.Hl1.30

OB17. 003. 1F 120401

OB17.Hl1.30

OB17.003.1F 120461

OB17.Hl1.30 OBl7.003.1F

120521

OB17.H11.30

OB17. 003. 1F

#20581

OB17.Hl1.30 OBl7.003.lF

#20641

OB17.Hl1.30

OB17.003.1F n ^{0 7 01}

OB17.H11.30 OBl7.003.1F OB17.GIO.20

#20761

TAA TAA TAA

TAAACCAAGT TTGATAGCGT AGτACTCAAG CGTTATGCCA GCATCCGCCC GTCCTTGTTC TAAACCAAGT TTGATAGCGT AGTACTCAAG CGTTATGCCA GCATCCGCCC GTCCTTGTTC

TM

I

ACCAAGT TTGATAGCGT AGTACTCAAG CGTTATGCCA GCATCCGCCC GTCCTT

�

TTC

TACTGCTCTG GCAACACCAG CTTCGGTGTT TGTCTCCCAG AGATACCCTT TCATATTTTT TACTGCTCTG GCAACACCAG CTTCGGTGTT TGTCTCCCAG AGATACCCTT TCATATTTTT

TACTGCTCTG GCAACACCAG CTTCGGTGTT TGTCTCCCAG AGATACCCTT TCATATTTTT

TCTTATACTT TCGTTGTTGC CTATAAGCTC CTCTATGAGA TCCCTTGTGC CAGATCCTTT TCTTATACTT TCGTTGTTGC CTATAAGCTC CTCTATGAGA TCCCTTGTGC CAGATCCTTT

TCTTATACTT TCGTTGTTGC CTATAAGCTC CTCTATGAGA TCCCTTGTGC CAGATCCTTT

ATTCCTATTT ACλAACACCA TTCCTTTATC CAATATCTCC TGAAAACTGG ATACTCCAGT ATTCCTATTT ACAAACACCA TTCCTTTATC CAATATCTCC TGAAAACTGG ATACTCCAGT

ATTCCTATTT ACAAACACCA TTCCTTTATC CAATATCTCC TGAAAACTGG ATACTCCAGT

TTTCGATACA AAGCCACGAT TCCTCAAGTA ACCTCTTACT AGATAACTCA CATTCCTTAG

TTTCGATACA AAGCCACGAT TCCTCAAGTA ACCTCTTACT AGATAACTCA CATTCCTTAG

‘

TTTCGATACA AAGCCACGAT TCCTCAAGTA ACCTCTTACT AGATAACTCA CATTCCTTAG

ATCGTTGTCA TAAACAGATA TGTTATAGAC GCCATTTTTA AGGATATGTA TACCTGATAC ATCGTTGTCA TAAACAGATA TGTTATAGAC GCCATTTTTA AGGATATGTA TACCTGATAC

A T C G T T G T C ð T A A A C A G A T A T G T T A T A G A C _BLC_Al'1'T T T A A G G A T A T G T A T A C C T G Þ. T A C

GTCAGCTTCA CCTGCCTTTA TTGCTGAGAT TCCACCCCAT GCTCCAACAT TTACTATCTT

ÇTCAGCー=面白 副長ーÇCCTTTð TIGCT面白面白= 中�白�両面白�ーー面白白面白ー �ー品=面中=

ー ー ・. ・.

GTCAGCTTCA CCTGCCTTTA TTGCTGAGAT TCCACCCCAT GCTCCAACAT TTACTATCTT

CGCGCTTTIA TCAGTTTCCA ATATGACTTC ATCCAGCAAC GGATC CGCGCTTTTA TCAGTTTCCA ATATGACTTC ATCCAGCAAC

GTTTCCA ATATGACTTC ATCCAGCAAC GGATC

CGCGCTTTTA TC

1

GTTTCCA ATATGACTTC ATCCAGCAAC GGATC

凶16-3

λクローン817の配列の内、 1本のM13クローンで決定されていた図13、 矢印3の領域。

l本のM13クローンで決定されていた領域を黒線で閲った。 PCR産物をシークエンスして得た

嵐基配列の下に線 を入れた。

69

3・5-6

λコンティグの作成

塩基配列の決定したλクローンのインサ-トDNAのコンセンサス配列を順 次Sequencherで連結した。 21例の入クローンのインサ-トDNAが決定した1 段階で、 凶17のlから6に示したように、 27倒のコンテfゲと、コンティゲ

を形成しない7個のDNA断片が得られた。|吋17には決定した a本fì'! DNAの 片側の鎖のみ示した。 121何のλクローンのインサ-卜DNAには、1':(1 1 日にぷ すような、 λクローンのク口一二ングサイトである制限解系品川3AIの11ZJ抜サ イトGATC から先で塩基配列が不一致になるキメラクローンが{{- {じすることが 明かとなった。 キメラクローンの生じた原岡は、 λアームとゲノム DNA との うイゲーシヨンの際に、 短いDNA断片が長いDNAI新} �-とともに1Lli人くされたた めと考えられる。 このようなインサ-ト

DNAを持つλクローンは36

{[ðlで全人 クローンの29.7%であった。 不一致の部分の平均長は2，997.9bpであった。 こ れらのDNA断片の塩基配列は別に保存して後の解析にmL ìた。

121

(I�，lのλクTl

ーンのインサ-トDNAによる、 単独決定塩基数は、 1，304，003bp(全ケノムの

82.25% )であった。

残りのゲノムDNAの塩基配列を決定するためには2つの方法が考えられた。

1つは、

このまま残りのλライブラリーのクローンのIわから未決定ウノムDNA 領域を埋めるクローン を選択して未決定ゲノム

DNA領域を均める刀法、

他の

1つは、 人クロ一二ンクシステムとは異なるク口一二ングシステム を!日し1て作 成したライブラリーの中から未決定ゲノム DNA領I或を珂1めるケローンを選壮1 して未決定ゲノム DNA領域を埋める}j 法である。 残りのλライフラリー(

1 )

のクローンの中にも、 キメラクローンが存在することが考えられたため、 λラ イブラリー(1)と平行して作成したBACライブラリーから未決定ゲノムDNA 領域を埋めるクローン を選択し、 インサ-トDNAの塩基配列を決定して未ジL

70

定ゲノム DNA 領域を埋める}j法を選択した。 また、 キメラクローンの混在す る可能門iがλライフラリー(I)よりも少ないライブラリーを得るために 、 ゲノ ム DNA(II)を用いて、 新たにλライブラリー(11)とコスミドライブラリー

コンティグ lLR

n6 Fし一 一 - 一司tu

i--A 引一0・・:9

一 1

i圃1・

町一川一 ::“ 司ご nυ 一 ハU- nu一

ン .:.:.:.:.;.:.:.:.日�:.:���:.:.:.:�:・2・:・:・

を作成したr ^25.986

7Hll

3・6

λライブラリー(11)とコスミドライブラリー

OA 17.nuc 0814.ori

コンティグ 2LR ^{1 A 15}

0081

市IJf以内手みSUll 3AI、 0.08Uを用い て部分消化したゲノムDNA の 、 分子量約 20khpのDNA断片を切り出したものをλライブラリー(II) の作成に用いた。

何られたライフラリー のタイターはインサートDNAを0.5μl用いた時は、

1.1

x 10�ブラーク/μgλアーム、 インサートDNAを 1.0μl用いた時は、 l.7^x 10�

プラーク/μgλアーム、 インサートDNAを3 .0μi用いた時は、 5.3^x 10�プラ ーク/μgλアームであった。 タイター が最大となった、 インサ-ト

DNAを3

μI {史刑したものを人ライブラリー(II)とした。

)'x)

1りに、 PCRにより噌幅した、 人ライブラリー(II)クローンのインサート

DNAの

イタIJをぶした。 おこなったPCRはほとんとの場合、 インサ-ト

DNA

の明IpMが凡られたが、 自lに増幅が見られないものがあった(凶19Aのl、

14、

--l1なと)。

jJWMが見ちれなかったλク口一ンについては破棄した。 増幅したλ

OG19

0824.nuc

J

62.218

0122

OA 13.nuc

コンティグ 3LR ^OH1S.ori

00F2.ori

-

24，883

0023

クローンは、 十分な;互のj円州産物が得られた。

00K5

コンティグ 4LR ^OOMS_ori

コスミドケ口一ンのうイセ-卜によって形質転換した大腸菌を

4枚のLB/Am

フレートに怖いたところ、 それぞれ24個、

35側、 41制、 51個のコロニーが得

られ、 f?Ij|l引{I51のコロニーが得られた。 これらのクローンは-800Cで保存し、

コλミドライブラリーとした。

OL20

- FE--与

ーーー圃・-.:.:....::.:.;��:�:�:�:�:�:交;士;士己 掴圃 .

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48，497

図17-

1、 12 1個のλクローンのインサ-卜DNAからなるコンティゲ。

黒線 が入クローンのインサ-卜DNA 。 黒線上にクローン名を示した。

コンテイグを形成しない人クローンのインサ-トDNAの場合、 クローン名に続いて 長さを示した。 単位はbpo

コンティグ一番下の棒は連結の状態をあらわす。 黒線;正逆両方向で 決定された領域。

格子;同一方向で2つ以上のクローンが重複している領域。

斜線と点

ⁱ

一本のλ

^で

決定された領域。

棒の右端に コンティグの長さを示した。 単位はbpo

71 72

OC24 P22

7B7.right.temp Oc14 、

-tJ

--E' 内ヨ 「べ以 内/」 ， A『

と

ι�

コンティグ

8

00F6 _{- γ. ・ ・/ ・..'}

.'�' r • - s -b • J ・ ， - • • • ，. J

O

J占弓

^B

00N1

5L

コンティグ

OE 1 8.ori

，OG18.ori_A

OM21.ori

OK11

16，914 OC10

日不況・:J:百之・: .�主主・:主主主手R・R・:・:否定・:;:;:;:;:.:.:;:;:・:ミミミミ・:.:-�完号〈・:.:.:号・:・:ミ・ヌミ・:・:主主・. "ミ.:�，・:ミ・:.:.:・:・1号令:.:'・:・1・:.;:

コンティグ

8R

71，887

、..・...

，. . .

置・:.:・:・:・:・:.:・:・:

•

-EE- - -

OF10.nuc

OL23 0005 A

5

コンティグ

00C4 00E3

0023

9LR

コンティグ

OG20 日・:.:;:・:・:.:.:・:.:.�;:・干t

0113 OG18.ori B

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27，714

48，953 Fち千三守�:;:;:;:ミ祝日記号:干:.:侃

00K3 0005_B

コンティゲ

5R

OK 17.ori ^A -!"

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に二

29，561

OL15

10LR

コンティグ

31，969

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Ja-"_.ー周J'J'ー.ー.・..ー.ー

.. _.・.・.:.:.:

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じ;J4ii

‘ ON12 、 0持⁷

， OC15

、 OC12 、

，00M1.on 0012

OB10

コンティグ

6LR

00J5

11 L

コンティグ

『・4・4 ‘ QJ 7d ro F0 7f A 一 l vv' O ハU

31

一nu m 一 o

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一 争L【 :

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VI­ フニ 噌，E・圃 戸U 一

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哩堕哩里

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OG24 、

ト主主L→

，0018.5巴q1 ^- 豊里

い 一

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じ--- h・

121の入クローンのインサ-卜DNAからなるコンティグ。

図1

7 -3"

1 :2 1のλケローンのインサ-卜DNA

からなるコンティグ。

|刈17-2、

73

OH21.seq OC17

OF12 ON19.ori_B

OA10 OD10.ori B

00J3

17LR

コンティグ

00J1.ori

] ] R

コンティゲ

OJ15

00D9.ori

ー一一1

72.370

『『邑M'咽Et

.' ・・E22;交ど':�:����:.-:.'_" 〆�:�:�:'克:没:��Ó�Ò�Ó白I�Õ� :�:�:���.:一三〆:万<:

1

396

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00P6

21，436

J:.-' ..< ♂ /...:...

1

59，241 28，086

25，111

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00N9

12 ]の入クローンのインサー卜DNAからなるコンティグ。

76

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OA21.nuc

OF11

里里哩哩

00K7.nuc

OM24

00J9

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_

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OE 1 6.seq

日.、

00C2.ori

00F4.ori

-_. - /.�

巳立ニ5

OH19.ori

「トrL'可l

図1

7

^-

5，

[

-1

18LR

20LR

23LR

24LR

コ^ンテ ィグ

コ ンテ^ィグ

コンティグ コンテ^ィグ

、 OOl5.ori

、 OOA1

‘OG17.ori‘

、OOB5.nuc‘

OF17

0OL7.nuc‘

00B6

斗m

斗

21，655 -・E

120，998

121のλクローンのインサ-トDNAからなるコンテイグ。

豊里里里

巴

.

・^.. -.. - .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ・・・ ・・・ ・ ・ ・・・・・ ・ ・ ・.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ・ ・・・・・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ・・・・・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ... .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . ・・ ・ .-.-.、-.

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0117 OK17.ori B 〉一一令^ー

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OG16

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^・2

、OC21.sea

OC 11

OB19 0OB8.sea

2A15

1ち

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..

4EE， i -

l叫1 7-4、

12LR

14LR

16LR

コン子ィゲ

コンティゲ

コンティグ

コンティグ

^26L

コンティク 26R

コンティゲ 27LR

コンティゲ

^OE20

コンティゲ

^OOH4

00L9， 20889

OH11， 17881

OK15.seq， 16519

.t ， .'ペ . .

00D3_temp

07C8 OK22

OE20

ON15

OH23_8

00C5

. . . ... .

・...・'...・.'

OH23_A

OE12

0011

主

J

31. 794

=ヨ

37，196

520A.temp

-ー

OOH4.seq 8A 11.temp

00A3_A

+

;;... ...・../....

j

36，767

l

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�

0784， 18146

OF14.nuc， 14890

ON11.seq， 19194

18，157

07B7 _Ieft， 6158

|刈)

^{7-6、 1:2} 1の人クローンのインサー卜DNAからなるコンティグ。

77

OK11

OK11

OK11 OC10

OK11 OC10

OK11 OC10

OKl1 OC10

OK11 OC10

11201

0261

#1321

#1381

11441

#1501

#1561

GCCAGCCACA GGGACAAGGA TGGGTAATCG TGGCTTCTTC TTCCCGTATT TTGACGAAGA

. . . . . . . . . ー 白色一一一 一一 一 一 一一 一 一 一. . . ・ ・ ・ ・ ・ . . . ・ ・ ・ ・ ・ .

TCATGGATGG GACGTAGTGG AGGAAGTTAA GAAGGTGGCC CAAGAACAGG GCTGCAAGCC

G:TCGCAAGT TGCCCT��TG CTTGGATTAT ATCGAAGTCG CACGTAGC:T ATACTGGGAG GATCTT TTTGAGAGGT AATATTTAAA ATAATTTGGT TTCTC:CATA TCATATAC:G

CTAGAl\GCA ょ TGGAACAACT CGAAGAAAAC CTTGGTTCGC TTGATGTGCA ACTCACTAAA GGAT:TACTA TCTGTTCTTA AACGTTAATA TCGGGτAAGT TATCATAAAT T:: AG: T: : ;

GAGCAGAT

q

^{G AT}

q

GCCTCGA TAATGTATCC AAAAACAGGG AAATTTATCC GAACTGGATG T���GA��

�

^{G AT}

q

GCCTCGA TAATGTATCC AAAAACAGGG AAATTTATCC GAACTGGATG

1111 .

GTCGAAAGGC AAAATCATGA AAGAGACTTC GAAATAATTA ATTAATATCT ACTCGTTTTA GTCGAAAGGC AAAATCATGA AAGAGACTTC GAAATAATTA ATTAATATCT ACTCGTTTTA

TTCTCAAAτT TCGGAAGTTT AGATGTTTAA ACGAATTTCT TGTTTAAAGT TCCTAATCCT TTCTCAAATT TCGGAAGTTT AGATGTTTAA ACGAATTTCT TGTTTAAAGT TCCTAATCCT

図18、 λクローンのインサー卜DNAの不一致の一例。

λクローンOK

11とキメラクローンであるOCI0の連結。

太線で示した部分の 塩基配列にに不一致が見られる。 太線で示した部分はOCI0の5 ' 側末端。

斜線とその上の黒枠でおおわれた部分はλクローンのクロ一二ングサイトである 制限酵素Sau 3AIの認識配列であり、 OCI0の5

'

末端に短いゲノムDNA断片が 混入したキメラクローンであることが分かる。

78

AJ、 D12、 A13、

それ そして

B OH

¹

2

BACクローン8000 4

'--

『

20、 20・2)0 BACクロ ーン 007はどちらに対しても|場性反応をノj\したので、 BAC

そしてBOE06を選択してクローンDNAのnμ11�円以IJを決定した。i!}ら λクローンN

11とはJsi.対側にイ寸rt

をプロ ー_ブにして陽性クローンを_ハイフリダイゼ - _シヨ

、‘ ，aE‘、，

.

、

.

，f，.、、p

クローンD07(

B

OD07 ) は入

ク

ローンF

¹

4と

^N

11の_イン _サ

ー

卜

O N Aの !

日j

を

JiI�

人クローンF14と!え対{Jlリに{il ì?1�するケU ーンて

O N A

O N A

を _プ^口-ブと してf1jいたと _きの似 未決定ゲノムONA領域を珂!めるBACクローンを.ilrれするための

そしてH12の4 ク ローンであった([刈

G14

とH1 4はTE緩衝j夜pH8.0 をブロットしたlí�性コントlJールであ ロールで

とのコンティゲともつながら

lつのコンティクを形j点した(凶21

)。

B A C

_クローン

B

OH

⁰ 7

れた

B A C

クローンのイン _サ-ト

^O N

Aの塩 基 配 列をコ _ンテ _ィク化した結果、

そして

コンティグを形成しなかった入クローン のうち5伽|をj選択し、

F14 のインサ-ト そしてA14はT.volcanillmのゲノムONAをブ口ッ卜した防門コン|

007、

未決定ゲノムDNA領域を埋めるBACクローンの選択

BOH07、

ハイブリダイゼ-ションの結果の例を心した。いずれの結I�も

00斗、

未決定ゲノムDNA領域のDNAの塩基配列の決定

また、

を _プロー _フと _して用いたと _き^の陽性

B

^{AC ク口一ンは、}

これらの結果から、

どのコン_ティ_グともつながらなかったλクロー _ン

クローン B

OE0

3 (凶21)。

[r5J様に、

入クローンF14をはさんで、

80

めるクロ ーンであることが明かとなった

20-1)。

なかったλクロ ーン

^N

ll _のインサー

^卜 H07、

れ らのクローンのイン _サート^ONAは、

BAC

あることが明かとなった(凶21)。

E03、

(図

20 、

はλクロ ーンNllをはさんで、

(図21)、

007、

クロ ーンであった

ONA

性B

A C

クローンは、

するクロ ーンであり

らのインサ-卜 とBOE06は、

図20に、

同様に、

130007、

あり、

3-7-1

の3 る

。 3・7

。

川K

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クローンを示した。 最も左側 ンにより検出した。 友2 に、 得られた陽性

BAC

げ1vー『

表It1に陽件BACクローン名が示してある。

の列にλクJJーン名、

BACクローンB0007がλクローンNllとF14をつなぐこと、

この結果から、

NH-Ho-

BACケローンBOE06かλクローンF14とL9をつなぐことが示された。 BOE06 BOE06 はλク ONA の出基配列を決定しコンテイグ化したところ、

のクローン

入クローン

L9

とは共通の配列を持た 。、

[1ーンF14 とは共通の配列を持ったが、

αコ

?、

L9 をフ。ローフ"としたハイブリダイゼーショ したがって入クローン

なかった。

国

z

。

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弘司

Lム 凶

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凸

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....-1

ノ\イ フリダイゼ-ションに用いたプローブにキメラクローンが含まれることにある

コンティグ末端のλクローンのインサ-卜ONAをプ

.&4にはコンティゲ|商末端から約1.Skbp内側に30塩基長のオリゴONAをプ

ーンをぶしている。

コンティグ 人クローンの列に各

れらの陽性BACクローンの中には

BOE06のように擬陽性のクローンが含まれ

図 コンテ た。 阪陽性のクローンを除くために各コンティグの両末端から約1.Skbp内側に コンティグ末端の入クローンの番号を示した。

AからHまでにはその人クロ-

30塩基からなるオリゴONAを そのオリゴ ONA をプロープとして陽性ク口

l_ 『

クロ この番号は、

ンのインサ-トONAをプローブに用いた時の陽性BACクローンを示した。

BAC

この原因は、

末端のλクローンをプローフとしたハイブリダイゼーションの結果と、

プローブとしたハイブリダイゼーションの結果が共に陽性であった クローンを示した。 表5には、

表の中央にコンティグ番号を示している。

ンの際のBOE06のシグナルは擬陽性であることが分かった。

ローブに用いたハイブリダイゼーシヨンの結果を示した。

ィゲ末端から約1.Skbp内側の位置の塩基配列、

ーンをハイブリダイゼ-シヨンで+食出した。

81 17のコンティゲ岳号と対応している。

口一ブとして用いた時の陽性BAC ヌo J品基のオリゴONA を設計し、

ぷ3 -1と友3 -2には、

と考えられた。

。。

υ」

801107

〉

、

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一一一→

ON 1 I.seq

・ ・ ・・ ・ ・・・ ・ ・・・・・ ・ ・ ・ ・・--- - - -- - ----.

80007

、、、〆f OFl4.nuc

80E06 A 1

、、/ /

閃21、

BACクローンとλクローンとの整列化。

ギャップを埋めるBACクローンのインサートDNAの塩基配列と、 プローブとして用いたλクローンのインサー卜DNAの海基配列と のコンティゲ化。 実線;ギャップを埋めるとBACクローンのインサートDNA、 点、線;入クローンのインサ-トDNA。

コンティグ一番下の俸は連結の状態をあらわす。 格子;同一方向で2つ以上のクローンが重複している領域。

斜線と点;一本の入で決定された領域。 棒の右端にコンティグの長さを示した。 単位はbpo

ニに

二疋

表2、 コンティグを丹5成しなかった入クローンのインサ-トDNAをプロープとして用いた ハイブリタイゼーションの結果得られた陽性BACクローン

N ¹¹ 007 EOヌ

K ^{15 A07 803 804} C09 CII 008

日^{I1 A06 AI2 811} C05 C08 C12 CI3 009 E02

L9 A06 AI2 803 804 811 C05 COR C09 C13

FI4 A04 004

己

⁰⁷

N ^{J 1 H07} HI2

K ^{15 E 1 2 FJ2 FJ4}

H J 1 G08 Gl1 G 14 H02 HOó

L9 F09 GOR G09 GJ4 HOl H02 H06

FI4

最も左側の列にλクローン名、 表中に陽性BACクローン名が示しである。

EOó EOó

太枠で囲んだBACクローンは、 左端の2つのλクローンによるハイブリダイゼーシヨンにおいて陽性であったことをあらわす。

表3 - 1、 コンティグ末t;討に位置するλクローンのインサートONAをプロープに用いた時の陽性BACクローン

A

_B

C

D E F G H

A05 BI0

EI0 GOl HOl

A08 ₀₁₃

G

0

4

A02，A04

B06 Cll E07，E12、E14 G02 H07.H09

B03

E03

A05

.

A

0

6.A

⁰7、

B05‘B06‘B09

C08、C09，ClO，Cll

0

08 F11 H0

5 ，

^H08

A08，A09，All.A12

AI

0

A05

^J 1

八03

F0

9 G05

H06 F04

B03，B09

COLC04.CI4

0

08

， ⁰

^{14 E01.E11 F02，F13 G1}

³

H02，H08‘HlO

B02，B03，B09，B12

_B 0

02

司 ⁰

⁰⁸

^{， 0}

^{12 F01 H08}

I()

009 _EI0

B02.B

¹²

C

⁰3

0 0

2 F01

B03.BO斗

C09

013 G07 H0

3

0

1

2

^F05，F08 G06、G

I

O F03

F0

4

G05

C l) n t IロのljlJに1斗コ〉二子〆クの用:;;ーを、 λクローンのI，ÎIJには行コンティゲ木端のλクローンの吊号を示しに。

λケ[lーンの聞の同作は、 λ勺ローンDN^力、何られなかったことを心す。

八から11までじはそのλヲローンのインサートONAをプローフにH]t \た時の限nBACクローンを'J\したι 八からHはりのうg〈プレートの肝�Jc:吋見、しているc

1

^{λクローン1川iの}

|

A7

i22

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C 24

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L23 i 1 3 RI0

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1

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2LR

1LR 4T.R 5

L

5

R 6LR

8R 9LR

10LR 11L 11 R 12LR

14R 16LR 17LR 18LR 20LR 23LR 24LR 26L 26R L-27-R

コこ

ヨこ 司、l

-1<3 -:2、 コンヲィグL目指!こ(立iFJするλクローンのインサー卜ON八 をプロープに111l

\た11与の問↑lB八Cク口一、

contlg 3' t瑞iの

λクローン

A B C D E

F (ì I!

ILR _D3

A05 B10 009 E07.EI0

2

^LR

824

COl，CO札C14

014 EOLEO:2 Hll

3LR F2

AO沢

4LR _L20

806 GOl、G04

5L

5

^R

K17

^COl EOl.E04王09 ^F03

óLR n I.R

おR

CIO E06 G09

9LR

G20 B03、805 010

HOユH05

lOLR L!') A09 BOR G05

11 [

11 R .11')

C13

12LR L7

A03 005 HOl

14R

i 17 AOR E0

⁸

G09

16LR Gló _EOお

llLR 09 ClO

L8LR K7 802、812 002 F01 H03

20

^LR

2lLR M24 H03

24I.R 上-19

26L

26

^R

E 12 C08

I

^-77-R

_Dl1 E05 F04

contlgのダIJに各コンテイグの罫号を、 λクローンの列には科コンテイゲ末端のλクローンの罫号を点した。

λクロ ンの欄の間作は、 λクローンONAが{ザられなかったことをぶす。

AからHまでにはそのλクローンのインサートONAをプローブに!日l \たH与の防刊:BACクローンをぶした。

AかちHは96プ〈プレー卜の罫可に刈"��している。

友4、 コンティグ[Irrj末端からが11.5キ目指革対内側に301信基良のオリゴONAをプローブとして用いた時の陽性BACクローン。

A B C D E

^F

G H contlg

C03

^lLR

A0 8

C03

^2LR

3LR 4LR

B03.B04

C09

5

^L

5R

6

^LR

8R 9LR

A12 B11 C13 F09

H0

6

^10LR

B03.B04 C09 003

1

1

^L

11 R

C04 El1

^{FI3 12LR}

14R

008 HOR

^16LR

009

^17LR

B12

^F

O

l 18LR

803、B04

^C

09

^20LR

日03 23LR

F05 G06.GI0

^24LR

C03 FOl 26L

26R

A03

^{2 7LR}

contigの列に各コンテイゲの需弓を不した。

AからHまでには丹オリゴON八をフロープにflJ L、た11与の問↑lBAC句ローンを，戸した。

AからH

は96穴プレートの罫りに吋I，�; Lている。

A

R C D F 下

AO'i

AOゥ RO';

C

^ll n09 Flフ

COl

_{FOI FOq Fm}

FO';

A09

R

O

R

An，;

Rll

CI3

Am Anfl Rl1 C13

nn

R

F1ウ FI) 円。ι

CO:2

C06

Rn�

C

⁰8

C02 F(l弓

口 H

口no 口n.::;

..(l� ..1.1 H()fI

HI1 口07

HOフ

tb{JA配列 以下に示す1

3

{同のBACク[1-ンをiされし、

これらの結果から 、

コンテ

λL 9、

(つながることが予想された州f::λK1S、

BOB03

を決定した。

コンティグ

1 6、

コンテ コンティグ12 、

コンティグ1 1 、 コンティグ9、

ィグ5、

BOB08 (つながることが子怨された利子:コ そしてコンティグ24)、

ィグ2 0 、

ンティグ10の末端)、 BOD07 (つながることが予加された相手:人Nllと入F14) BOE06 (つな BO E 04 (つながることが予想された相子:コンティグ5の末端)、

BOE07

(つ そしてコンティグ8)、

λF14、

がることが予想された相手:λL9、

80E09 (つなが とコンティグ4)、

ながることが予想された相手:コンティゲ l

(つながることが予知

80E12

ることが予想された相手:コンティグ5の末端)、

コンティゲ4、 そしてコンティク14)、ßOF Oり された相手:λK15、 コンティグ3、

(つながる

80GOl

とコンティグ 10)、

(つながることが予想された相手:λL9

8 0 G03 (未決定領域を ことが予想された相手:コンティグ1とコンティグ4)、

BO G06 (つながることが予想、された相手:コンティ とコンティケ

とベクタ 制限酵素Not 1によりインサ-トDNA

これらのBACクローンを、

パルスフィールドゲル電気泳動システムを用いて泳動した ーを切り離した後、

パルスフィールドゲル電気泳動の結架から予想された 結果を図22-1に示した。

DNAのt1K)lt配列から クローンの インサ-ト

DNA の長さと、

BAC

インサート

DNA の長さには BOBCßを除いて大きく宍ならなかっ 日日の出J-itrqcダ1]を決定し、未決定。〕ケノムDNA

BACクローンのインサートDNAのtM1i主配タIJをコンティゲ化した市吉宋をlヌ] 22 ー部、2 5，929bpを決定した。

末端が連結され、

jミ2崩とコンテイグ9LRの3' 80H07 (つながることが予想された相手:人Nl1 埋めることが予想された)、

グ24の末端)、

た。80B03はインサ-トDNAの 明かとなったインサ-ト

の領I或だけを埋めた。

の2 から4に示した。 BOB03はインサ-卜DNAの これによりコンティクSLの'"1'

。

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B03 007 E06 E09 F09 G03 H07

BOG01.nuc 00D5_A

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コンティグ 4LR ^OL20

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(コンティグ4LR+コンティグ 5) _00K5

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也迫 史投手:-::==./:'>・-'�:(メ....:/:.>:..../..>国拓政人・・・・ベタ'園田タレンンメ"ィ.・〆:メ〆ン

113，115

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23.1

OL23

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00C4

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00E3

〉・・・・・・・・〉

OD23 OG20

〉・・・・・・・・-→

80803 OM21

〈・・・・・・・・・〈

OG18

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コンティグ5L

(コンティグ 5L+コンティグ 9LR)

ー-

9.4

_OE18

〉・・・・・・・・・・・・・〉

00N1

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00F6

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6.6

^OJ1斗^B

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圃圃圃4.4

J30E04_1.teJmp

コンティグ 5R

00K3

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32，198

閃22- I、 インサ-卜DNAの塩基配列を決定したBACクローンのパルスフィールドゲル電気泳動像。

tr:_イiの数字は分チ量をあらわす。

単位はkbp。 左端のVはベクターのバンドをあらわす。

上部の数字はクローン番号、

Mは分子量マーカーを示す。

泳動条件は、

1%アガロース、

0.5

xTBE、 140C、 14時間、 6Y/cm、ramp 2秒-1 0秒である。

90

図22-2、 BACクローンのインサートDNAの塩基配列を加えたコンティグ。

点線はλクローン、 新たに加わったBACクローンを実線矢印で示した。

コンティグ一番下の棒は連結の状態をあらわす。

黒線;正逆両方向で決定された領域。

格子;同一方向で2つ以上のクローンが重復している領域。

斜線と点;一本のλで決定された領域。

棒の右端にコンティグの長さを示した。 単位はbpo

91