博 士 （ 医 学 ） 小 野 寺 智 洋
学位論文題名
Specific Cell Behavior of Human Fibroblast onto Carbohydrate Surface Detected by Glycoblotting Films （糖鎖ブロッテイングフイルム上でのヒト線維芽細胞の特異的挙動）
学位論文内容の要旨
導 入： 細 胞表 面は 様々 な糖鎖に覆われており、 細胞ー細胞間や細胞―マト リックス間の相互作用に影 響を及 ばしている。それらの相互作用を通じて、糖鎖は細胞分化や接着、増殖などの生物学的機能に様々 な影響 を与えている。そのなかで も、特に複雑な糖鎖であるプ ロテオグリカンは腱、靭帯や軟骨に対し て重要 な役割を果たしていること が知られている。しかし、プ ロテオグリカンは非常に複雑な構造であ り、そ の構造をScaffold上に再現 することは困難である。
生物学 的機能を基盤に持たせるこ とを目的として、糖鎖を基盤 上に導入し、基盤上に細胞特異的な機能 を持た せることに成功した研究も 散見する。しかし、今までに 行われてきた糖鎖導入方法は、複雑で時 間のか かる合成方法が主体であっ た。そこで我々は、アミノオ キシル基をポリマー上に提示することに よって 糖を短時間で簡単に捕捉可 能な基盤を開発した。この糖 鎖捕捉基盤は、穏やかな条件下で水溶液 中の糖 を捕捉することが可能であ る。
本研究 の目的は糖鎖を表面に導入 することによって、基盤に線 維芽細胞に対する生物学的機能を持たせ ること ができるかどうかを検証す ることである。その目的のた めに、我々は糖鎖ブロッティングの技術 を用い ることにより、糖を基盤表 面に導入可能な糖鎖捕捉基盤 を開発した。加えて6種類の 糖を表面に 導入し た基盤を作製し、細胞に与 える生物学的影響を検討した 。本研究で用いられた技術及び結果は、
今 後、 生 理学 的機 能を 持つ 糖 を同 定し 、足 場 材料 とし て利 用で き る可能 性を示唆するものである。
実験方 法：アミノオキシル基をポ リマー上に提示した糖鎖捕捉 基板を独自に開発した。糖が基盤表面に 捕捉さ れていることを確認するた めに、螢光ラベルされたレク チンを用いて、螢光染色試験を行った。
ま た 、 実 際 に6種 類 の 糖 鎖 （Lactose，cellobiose，cellotriose，maltotriose，mannotriose， chitobiose)を吸着させた基板を作 製し（n 5）、ヒト線維芽細胞との細胞接着性、増殖性を評価した。
また、 細胞接着性の高かった糖を 培養液中に混入させることに よる接着阻害性を評価した。また、糖鎖 一 蛍光 ビ ーズ 複合 体を 作製 し 、細 胞膜 との 親和性を 評価した。統計学的評価には 分散分析(ANOVA)を 用いた 。
結果：蛍光レクチン染色に よる糖鎖捕捉能の評価では、 実際に糖が基盤表面に提示されていることが確 認さ れた 。ま た、 細 胞培養で用いる培養環境に おいても糖提示能を24時間 以上保つことが確認された (Fig.1）。
6種 類 の 糖 と ヒ ト 線 維 芽 細 胞 を 用 い た 細 胞 接 着 試 験 で はcellobiose（ コ ント ロ ール 比292％ ）、
cellotriose (249%)が他の 糖鎖より有意に高かった(Fig.2）。
次に6種類の糖の接着阻害性 を評価するために、培養液 中に糖を混入することによる 、接着阻害性の評 価を行った。基盤表面上で 細胞接着性の高かったcellobiose、cellotrioseが、培養 液中において高い ―410―
接着阻害性を持つ ことが確認された(Fig.3）。 また、糖鎖ビーズを用いた 螢光染色では、接着性の高い 糖鎖が、細胞との 親和性が高いことが確認され た(Fig.4）。
細胞増殖試験は細 胞接着試験の結果とは異なり 、糖鎖基板全てがコントロ ールと比較して有意に高かっ た(Fig.5）。
考察：
本報告ではオキシ ルアミノ基をポリマーに導入 することによって、水溶液 中の糖との簡便な反応を可能 にしている。過去 にはポリアクリルアミドやポ リスチレンなどの合成ポリ マーを用いた糖鎖捕捉基盤の 報告があるが、い ずれも合成に複数のステップ を必要とし、その合成には 時間が必要となる。その点、
今回、我々が用い たポリマーは糖鎖還元末端と アミノオキシル基とのオキ シム結合を利用することによ り、簡便な合成を 可能にしている。
また、今回の結果 ではcellobiose、cellotrioseといった、ヒト組織内ではあまり存在しない糖が高い細 胞と の 親和 性を 持つ こと が 確認 され た。Kimらの報告によると、 肝細胞とcellobioseとの細胞 接着性 はLactoseなどの糖と比べて低いという報告がある。そのことを考慮すると、今回確認されたcellobiose、 cellotrioseとヒト 線維芽細胞との親和性は細 胞特異的な現象である可能性 が高い。また本結果より、
今後 、 細胞 親和 性の 高い基盤をデザイ ンする際に、非動物由来の 物質も有用な候補となり得る 可能性 を示している。
本研 究 で確 立さ れた 糖鎖捕捉基板を用 いることで、まだ明らかに されていない糖鎖と細胞との 関係を 明 ら か に す る こ と が 可 能と なる 。更 に、 今 回発 見さ れた 細 胞接 着性 の高 い糖 鎖 は、 新規Scaffold materialとして再 生医療に応用できる可能性が ある。
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
Specific Cell Behavior of Human Fibroblast onto Carbohydrate Surface Detected by Glycoblotting Films （糖鎖ブロッテイングフイルム上でのヒト線維芽細胞の特異的挙動）
細胞表面は様々な糖鎖に覆われており、細胞ー細胞聞や細胞一マトリックス間の相互作 用に影響を及ぼしている。それらの相互作用を通じて、糖鎖は細胞分化や接着、増殖など の生物学的機能に様々な影響を与えている。そのなかでも、特に複雑な糖鎖であるプロテ オグリカンは腱、靭帯や軟骨に対して重要な役割を果たしていることが知られている。し かし、プロテオグリカンは非常に複雑な構造であり、その構造をScaf fold上に再現するこ とは困難である。
生物学的機能を基盤に持たせることを目的として、糖鎖を基盤上に導入し、基盤上に細 胞特異的な機能を持たせることに成功した研究も散見する。しかし、今までに行われてき た糖鎖導入方法は、複雑で時間のかかる合成方法が主体であった。そこで我々は、アミノ オキシル基をポリマー上に提示することによって糖を短時間で簡単に捕捉可能な基盤を開 発した。この糖鎖捕捉基盤は、穏やかな条件下で水溶液中の糖を捕捉することが可能であ る。
本研究の目的は糖鎖を表面に導入することによって、基盤に線維芽細胞に対する生物学 的機能を持たせることができるかどうかを検証することである。その目的のために、我々 は糖鎖ブ口ッテイングの技術を用いることにより、糖を基盤表面に導入可能な糖鎖捕捉基 盤を開発した。加 えて6種類の糖を表面に導入した基盤を作製し、細胞に与える生物学的 影響を検討した。本研究で用いられた技術及び結果は、今後、生理学的機能を持つ糖を同 定し、足場材料として利用できる可能性を示唆するものである。
最初に、アミノオキシル基をポリマー上に提示した糖鎖捕捉基板を独自に開発した。糖 が基盤表面に捕捉されていることを確認するために、螢光ラベルされたレクチンを用いて、
螢光染色試験を行った。また、実際に6種類の糖鎖（lac tose，cellobiose，cellotriose， maltotriose，mannotriose，chitobiose)を吸着させた基板を作製し（n二ニ5）、ヒト線維芽 細胞との細胞接着性、増殖性を評価した。また、細胞接着性の高かった糖を培養液中に混 入させることによる接着阻害性を評価した。また、糖鎖一螢光ピーズ複合体を作製し、細 胞膜との親和性を 評価した。統計学的評価には分散分析(ANOVA)を用いた。螢光レクチン 染色による糖鎖捕捉能の評価では、実際に糖が基盤表面に提示されていることが確認され た。また、細胞培養で用いる培養環境においても糖提示能を24時間以上保つことが確認さ れた。
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則 宏
男
和
明
田 水
浪
安 清
三
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
6種 類の糖と ヒト線 維芽細胞 を用い た細胞接 着試験ではcellobiose（コントロール比 292％）、cellotriose (249%)が他の糖鎖より有意に高かった。次に6種類の糖の接着阻害性 を評価するために、培養液中に糖を混入することによる、接着阻害性の評価を行った。基 盤表面上で細胞接着性の高かったcellobiose、cellotrioseが、培養液中において高いゝ接 着阻害性を持つことが確認された。また、糖鎖ピーズを用しゝた螢光染色では、接着性の高 い糖鎖が、細胞との親和性が高いことが確認された。
細胞増殖試験は細胞接着試験の結果とは異なり、糖鎖基板全てがコントロールと比較して 有意に高かった。
本報告ではオキシルアミノ基をポリマーに導入することによって、水溶液中の糖との簡 便な反応を可能にしている。過去にはポリアクリルアミドやポリスチレンなどの合成ポリ マーを用いた糖鎖捕捉基盤の報告があるが、いずれも合成に複数のステップを必要とし、
その合成には時間が必要となる。その点、今回、我々が用いたポリマーは糖鎖還元末端と アミノオキシル基とのオキシム結合を利用することにより、簡便な合成を可能にしている。
また、今回の結果ではcellobiose、cellotrioseといった、ヒト組織内ではあまり存在し ない糖が高い細胞との親和性を持つことが確認された。Kimらの報告によると、肝細胞と cellobioseとの 細胞接着性はLac toseなどの糖と比べて低いという報告がある。そのこ とを考慮すると、今回確認されたcellobiose、cellotrioseとヒト線維芽細胞との親和性 は細胞特異的な現象である可能性が高い。また本結果より、今後、細胞親和性の高い基盤 をデザ インする 際に、非動物由来の物質も有用な候補となり得る可能性を示している。
口頭発表にあたり、副査清水宏教授から、細胞表面の分子の中で糖鎖の占める割合と、
糖鎖が接着性に与える影響に関して、また、糖鎖を利用するコストに関して、更に各臓器 による糖鎖の特異性に関する質問があった。また主査安田和則教授から、通常の培養基盤 と本研究で用いたポリマーとの性能の違いに関して、また糖鎖が細胞の分化に対して与え る影響に関して質問があった。最後に副査三浪明男教授からヒト線維芽細胞以外の細胞と 糖 鎖 基 盤 と の 関 係 に 関 し て 、 ま た 基 盤 の 方 向 性 に 関 す る 質 問 が あ っ た 。 これらの質問に対して、申請者は学位論文に使用したデータや過去に発表された論文に 基づぃて概ね妥当な回答を行った。
本論文で確立された糖鎖捕捉基板を用いることで、まだ明らかにされていない糖鎖と細 胞との関係を明らかにすることが可能となる。更に、今回発見された細胞接着性の高い糖 鎖 は 、 新 規Scaffold materialと し て 再 生 医 療 に 応 用 で き る 可 能 性 が あ る 。 審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども 併せ申 請者が博 士（医 学）の学 位を受 けるのに 充分な資 格を有 するものと判定した。
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