December 1991
Jpn J Anim Reprod Vol 37 (5)
SATO
AWARD
LECTURE
FOR 1991
Studies
on Cryopreservation
of Mammalian
Embryos
Induction
of Ice Formation
with Droplets
of Silver
Iodide
Immobilized
in Alginate
Gel
Toshiyuki KOJIMA
Department of Animal Reproduction, National Institute of Animal Industry, Tsukuba-Norindanchi P.O. Box 5, Ibaraki, 305
Summary. The aim of the present study was to develop an automatic and reliable ice nucleation method by using silver iodide (AgI) as the ice nucleating agent. The effect of the introduction of ice nucleation by AgI was examined by observing the temperature rise due to the release of latent heat of fusion at temperatures where spontaneous freezing did not yet occur. AgI in distilled water was loaded into a plastic straw, and was separated from the freezing solution by air bubbles. By using a copper-constantan thermocouple to measure temperature of latent heat released, it was confirmed that AgI could be used for effective ice nucleation in freezing solutions. Rabbit morulae and bovine Day 7 to 8 embryos were frozen by the AgI seeding method. It became clear that AgI was an effective ice nucleating agent for freezing rabbit and bovine embryos. The original method was improved for practical application by immobilizing AgI in alginate gel. This method makes it possible to immerse AgI with embryos in any kind of freezing vessels. The reliability of seeding increased when this method was used, judging from the high post thaw survival of the bovine embryos. The process of ice crystal growth germinating from AgI alginate gel droplets was observed under a cryomicroscope. The droplets suspended in a solution containing 10% glycerol or 11% dimethyl sulfoxide germinated ice crystals at approximately -8•Ž. The start of freezing in the straw used to be detected indirectly with a thermocouple as a temperature increase due to the emission of the latent heat. Thus, it was uncertain whether the freezing was induced through the aid of AgI alginate gel droplets or not. This problem appeared to be clarified by the cryomicroscopic observation.
KEY WORDS: ICE NUCLEATION. CRYOPRESERVATION. SILVER IODIDE. ALGINATE GEL. SEEDING
Jpn J Anim Reprod
37, 13p-24p, 1991
1991年度佐藤賞受賞講演論文
哺乳動物初期胚の凍結保存 に関する研 究,特 に固定化 ヨウ化銀法の開発
小 島 敏之
農林水 産省畜 産試験 場繁殖部 〒305 茨城県筑波農林研究 団地 内局私書箱5号
哺 乳 動 物 初 期 胚(以 下,「 胚 」 と略 称 す る)が 凍 結 融 解 後 も生 存 性 を維 持 し続 け る た め に は,細 胞 膜 透 過 型 の 凍 結 傷 害 保 護 物 質(以 下,「 凍 害 保 護 剤 」 と略 称 す る) の 存 在 を 必 要 とす る(Maurer,1978).ま た 現 在,胚 の 凍 結 保 存 法 と して汎 用 され て い る緩 速 冷却 ・急 速 融 解 法 で は,凍 結 媒 液 の融 点 近 くで氷 晶形 成 を誘起 し,細 胞外 液 を氷 晶 化 す る こ と(「 植 氷 」 と も称 され る)が 融 解 後 に生 存 性 を高 率 かつ 安 定 的 に維 持 させ る た め に 欠 か す ごとが で きな い処 置 と され て い る(Maurer,1978). 植 氷 とは,過 冷 却 状 態 の水 に そ の 温 度 で 成 長 で き る氷 核 を植 え る こ と を意 味 し,小 氷 片 を試 料 に投 入 す る か (Maurer,1978),よ く冷 却 した 金 属 片 で試 料 に 直 接 軽 く 触 れ れ ば達 成 さ れ る(Willadsen,1977). 1932年 にChambersとHaleが,細 胞 の 凍 結 過 程 を観 察 す る と き,十 分 に過 冷却 され た試 料 が 凍 る とそ の 視 野 が 一 瞬 の う ち に 暗化(可 視 光 下 で)す る こ と を防 ぐた め に,過 冷 却 が あ ま り進 行 しな い うち に 顕微 解剖 器 を使 っ て 植 氷 して凍 結 を 開始 させ た の が植 氷 とい う手 法 が 用 い ら れ た最 初 の報 告 で あ ろ う.そ の結 果,細 胞 外 面 で の氷 の成 長 に伴 い細 胞 が脱 水 され て収 縮 す る こ とが観 察 され た(Mazur,1977).後 に胚 を 凍結 保 存 す る試 み が な され た と きに,凍 害 保 護 剤 の存 在 下 で植 氷 した 試料 に 生 存 す る もの が得 られ た こ とか ら,植 氷 は細 胞 外 凍 結 を誘 起 し て 過 冷却 状 態 の細 胞 か ら水 を効 果 的 に 細 胞 外 へ 排 出 させ, 致 死 的 な細 胞 内凍 結 を未然 に 防 ぐの に 有 効 な 手 法 と して 認 め られ る に至 っ た.こ の と き正常 な機 能 を有 す る細 胞 膜 は細 胞 外 氷 晶 の成 長 か ら細 胞 内 を防 護 す る障 壁 と して 作 用 す る(Fujikawa,1987). 胚 の 凍結 融 解 後 の 生存 性 に 影 響 す る要 因 と して,植 氷 の 成 否 の他 に凍 害 保 護剤 の種 類 ・濃 度 ・胚 か らの 除 去 方 法,胚 の 品 質 ・発 育 ス テ ー ジ,凍 結 媒 液 の 量,冷 却 速 度, 予 備 凍 結 温 度,加 温 速 度 な どが 考 え ら れ るが(Leibo, 1986),こ れ ら の うち 植 氷 の 成 否 だ け が ほ ぼ悉 無 律 に従 って 生存 性 に反 映 す る こ とか ら判 断 して,確 実 な 植 氷 方 法 を採 用 す る こ とが 凍結 融解 胚 の 生 存性 を高 く維 持 す る た め に 重要 で あ る と思 考 され る.し か しな が ら,植 氷 操 作 自体 が 比較 的簡 単 で あ る こ とか ら,植 氷 操作 に つ い て の研 究 は今 まで皆 無 に 近 い状 態 で あ った. 凍 結 保 存 研 究 の初 期 の 頃 は,現 在 と異 な り凍結 容 器 に 開放 型 の試 験 管 や ア ンプ ル が使 用 され る こ とが多 か った の で,最 も確 実 な方 法 と思 わ れ る凍 結 媒 液 あ る い は蒸 留 水 の微 細 な氷 塊 を凍 結 媒 液 中 に投 げ入 れ る とか,パ ス ツ ー ル ピペ ッ トの先 端 に で きた氷 晶部 分 を凍結 媒 液 に 浸漬 す る な ど の方 法 を用 い る こ とが で きた.ま た,ア ル コー ル な ど の液 冷 媒 を使 用 す る装 置 で は氷 晶形 成 を直視 下 で 確 認 す る こ と も容 易 で あ っ た の で は な い か と推 測 され る. 現 在 の胚 の凍 結 保 存 は,衛 生 上 の観 点 か ら密 閉 され た凍 結 容 器 内 で行 わ れ る こ とが 多 く,一 部 の例 外 は あ る もの の,す べ て容 器 の外 側 か ら容 器 壁 を通 して媒 液 を 冷却 し て 植 氷 を行 う方 式 を採 用 して い る(Willadsen,1977). 現 行 法 を用 い て も植 氷 後 に直 視 下 で氷 晶形 成 の成 立 を 確 認 す れ ば氷 晶 形 成 の不 成 立 を 回避 で きる可 能 性 が 高 い が,冷 却 操 作 を気 相 冷 却 方 式 の 密 閉 型 の プ ロ グ ラ ム ブ リ ーザ ーで 行 う場 合 に は,氷 晶 の 形 成 あ る い は形 成 され た 氷 晶 の 成 長 を直 視 下 で 確 認 す る こ と は試 料 の温 度 上 昇 を 起 こす 危 険 性 が あ る.そ の た め 多 くの 場 合1本 の ダ ミー 試 料 で 氷 晶 の 形 成 に伴 う潜 熱 の 放 出 を感 知 して 氷 晶 の 形 成 を 監 視 す る こ と に な る(Maurer,1978).た だ し,ほ とん どの 場 合 媒 液 中 に金 属 製 の 温 度 セ ンサ ー を浸 した 状 態 で 測 定 す るの で,ダ ミー試 料 の 凍 結 容 器 内 の 環 境 は実 際 の 試料 に 比 べ て 氷 晶 が 形 成 され や す い 状 況 にあ る と考 え られ る.そ れ ゆ え,実 際 の 胚 を納 め た 試 料 には 氷 晶 形 成 を誘起 し得 な い 冷 却 刺 激 に よ って も ダ ミー試料 で は氷 晶 が 形 成 され る こ と も起 こ り得 る と予 想 され る.以 上 の よ う な状 況 か ら,融 解 後 に高 い 生 存 性 を確 保 す るた め に は確 実 性 の 高 い 植 氷 方 法 を開 発 す る必 要 性 が あ る と思 考 され た.ま た 操 作 を簡 略 化 す る 目的 か ら,自 動 的 に氷 晶 形 成 を誘 起 す る機 能 を も合 わ せ 持 つ 方 法 が 必 要 で あ る. 氷 晶 形 成 機構 に は水 分 子 自体 の 凝 集 核 化 に よ る もの の 他 に,媒 液 中 に存 在 す る異 物 が 核 と な り氷 晶 が 形 成 され る機 構 が 存 在 す る.一 般 に,後 者 の 方 が 前 者 よ りも氷 晶 発 生 温 度 が 高 い.こ の こ と は,後 者 の 機構 の方 が 氷 晶 形 成 誘 起 の 可 能 性 が 高 い こ と を示 唆 して い る と推 察 され る. さ ら に,こ の 異 物 と な る物 質 に氷 晶 核 を形 成 し易 い 性 質 を有 す る物 質 を用 いれ ば その 確 実 性 は さ らに増 大 す る と 考 え られ る.実 際 に,寒 冷 地 に棲 息 す る あ る種 の 昆 虫 は 血 液 リ ンパ 液 内 や 消 化 管 内 に氷 晶 核 誘 起 物 質 を有 して い る た め に(Zachariassen et al,1982),零 下 の 低 温 に 曝 され た と き 自 らの 身 体 を植 氷 し凍 結 傷 害 か ら身 を守 る こ とが で き る.効 果 的 な氷 晶 核 誘 起 物 質 は非 常 に限 られ て い るが,そ の 条 件 に合 致 す る もの と して 臨 界 氷 晶 点 の 高 い 順 に各 種 氷 核 細 菌(Warren and Wolber,1987),ヨ ウ 化 銀(silver iodide;Vonnegut,1947)お よ び 硫 化 銅 (covellite;Mason,1962)が 挙 げ ら れ る.こ れ らの うち, 工 業 的 に 生 産 され て い る点,入 手 し易 さの 点,臨 界 氷 晶 点 が 比 較 的 高 い 点 お よ び滅 菌 が 可 能 な 点 で ヨ ウ化 銀 が 最 も適 して い る と考 え られ た.ヨ ウ化 銀 は,人 工 的 に 用 い られ る 氷 晶 核 誘 起 物 質 の う ち で 最 も高 い 温 度(臨 界 温 度;-4℃)で 氷 晶核 を誘 起 す る性 質 を有 す る.ヨ ウ化 銀 の この性 質 を利 用 して 人 工 降 雨 を誘 起 す るた め に 過 冷 却 の 雲へ の種 蒔剤 と して 応 用 され る こ と は広 く知 られ て
い る (Hatakeyama,1956;Asada et al.,1957;Mason,
1962)。 ヨ ウ化 銀 は 氷 晶 核 誘 起 物 質 と して 評 価 が 定 ま っ
て い る が(Vonnegut,1947),凍 結 媒 液 中 で 応 用 した場
合 の有 効 性 は未 知 で あ る.
液 へ の 氷 晶 核 誘 起 物 質 と して応 用 す る た め の基 礎 研 究 お よび応 用研 究 を実 施 した.確 実 性 の高 い凍 結 媒 液 へ の氷 晶形 成 誘 起 方 法 が 開 発 され れ ば,貴 重 で有 用 な遺 伝 資 源 の保 存 に 資 す る もの と期 待 さ れ る.
材料 と方法
ヨウ化 銀 を ど うい う形 状 で 応 用 す る かが 問題 で あ る が, 著 者 らは,ま ず 蒸 溜 水 中 に懸 濁 す る方 式(Kojima et al., 1986,1987a),次 い で ア ル ギ ン酸 カ ル シ ウ ム の ゲ ル 中 に 固定 化 す る 方式(Kojimaetal.,1988a,b)を 採 用 した. 前 者 で は,1%の 濃 度 に な る よ う に ヨ ウ化 銀(和 光 純 薬,試 薬 一 級)を 蒸 溜 水 に 添 加 し,Fig.1に 示 す よ う に 0.25ml容 量 の プ ラ ス チ ック ス トロ ー(A-201,I.M.V., L'Aigle,France)に 凍 結 媒 液(11%DMSO-PBS+20% 家 兎 血 清,凍 結 点:-4.3℃)と 気 泡 を隔 て て 吸 引 した. 対 照 と して,ヨ ウ化 銀 蒸 溜 水 懸 濁 液 の 代 わ りに気 泡 を隔 て て何 も吸 引 しな い もの,蒸 溜 水 の み の もの,お よ び凍 結 媒 液 を吸 引 した もの,さ ら に従 来 の 方 式 に よ る植 氷 を 行 っ た もの を そ れ ぞ れ設 け た.ヨ ウ化 銀 の 氷 晶 形 成 誘 起 効 果 の 有 無 を調 べ る た め に,ま ず 銅 コ ンス タ ン タ ン熱 電 対 の温 度 セ ンサ ー(径1mm,株 式 会 社 チ ノ 製作 所)を 装 着 した ダ ミー試 料 を用 い て,潜 熱 の発 生 を記 録 した. 次 い で,家 兎 胚 を用 い て 各 々 の 実 験 区 につ い てinvitro の 生 存 性 を検 討 した.す な わ ち,家 兎胚 を室 温 域 で 直 接 凍 結 媒 液(11%DMSO-PBS+20%家 兎 血 清)に 移 し, 10個 ず つ 各 凍 結 容 器 に 吸 引 し室 温 か ら-7℃ まで 分 速 1℃ で 冷 却 した.さ らに,そ の 温 度 で10分 間 保 持 した 後, 同速 度 で-30℃ ま で達 した 時 点 で胚 を含 む 凍 結 容 器 を液 体 窒 素 中 に浸 漬 した.融 解 は,37℃ の 温 湯 に 入 れ て 行 い, 家 兎 胚 を 凍 結 媒 液 か ら直 接PBS+20%家 兎 血 清 に 移 し て 洗 浄 した 後(Kojimaetal.,1985,1987b),パ ラ フ ィ ン オ イ ル 下 の 培 養 液(BMOC-3+20%家 兎 血 清)に 移 して37℃,5%CO2,95%空 気 の気 相 下 で培 養 を行 い, 48時 間 の培 養 に よ っ て拡 張 期 胚 盤胞 まで発 育 した もの を 生 存 胚 と判 定 した.さ らに 牛胚 を用 い て 同 方 法 の 有 効 性 を確 か め る た め に凍 結 融 解 胚 の 受胚 動 物 へ の 移植 後 の 生 存 性 を検 討 した.す な わ ち,凍 結 媒 液 の 組 成 は10%グ リ セ ロ ー ル ーPBS+20%牛 胎 児 血 清(実 測 凍 結 点: -3 .8℃)で7∼8日 目胚(発 情 を示 した 日 を0日 とす る) を室 温 下 で 直接 凍 結 媒 液 に 移 し,Fig.1(a)に 示 す よ うな 方 法 で,ス トロ ー容 器 中 に,1個 ず つ 吸 引 した.30分 経 過 後 室 温 か ら-7℃ ま で分 速1℃ で 冷 却 し,そ の 温 度 で 10分 間保 持 した後,分 速0.3℃ で-36℃ まで 冷 却 を続 けた. 冷 却 層 温 度 が-36℃ に達 した 時 点 で,胚 を含 む 凍 結 容 器a
b
c
d
e
を液 体 窒 素 中 に浸 漬 した.凍 結 試 料 の融 解 は37℃ の 温 湯 に入 れ て行 い,そ の後0.75∼1.OMの シ ョ糖 を用 い て, 急 速 に胚 か ら グ リセ ロ ー ル を 除去 した.こ う して 得 られ た7個 の 凍 結 融 解 胚 を性 周 期7日 目に あ る7頭 の 受 胚 牛 の 黄 体 側 子 宮 角 腔 内 に頸 管 経 由法 に よ り1個 ず つ 移 植 し た.移 植 に よ って 受 胎 した牛 につ い て は分 娩 を待 って 産 子 の 正 常 性 を確 認 した. 後 者 の ヨ ウ化 銀 を 固定 化 す る方 式 で は,ま ず ヨ ウ化 銀 を2%(W/V)ア ル ギ ン酸 ナ トリ ウ ム(Sigma, A-2033) 水 溶 液 中 に2%の 濃 度 に な る よ うに添 加 しマ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ーで よ く掩 拝 した.そ の後,注 射 器 を用 い て 先 が 鈍 の23G注 射 針 か ら,先 に 記 した ゾ ル 状 の ヨ ウ化 銀 アル ギ ン酸 ナ トリ ウ ム懸 濁 液 を110mM塩 化 カ ル シ ウ ム 水 溶 液 中 に滴 下 して,固 定 化 ヨウ化 銀 を作 製 した.そ の 後,球 状 の 固定 化 ヨ ウ化 銀 を塩 化 カ ル シ ウ ム 液 中 か ら取 り出 し蒸 溜 水 で 洗 浄 した.オ ー トク レー プ に よ り滅 菌 しFig. 1. Diagram of 0.25-ml straw employed to detect the
temperature rise due to the release of latent heat of fusion. a) 70 mm of 11% dimethyl sulfoxide, freezing solution (FS), was separated by a 3 mm air bubble from
10 mm of silver iodide (1% AgI in distilled water). b) 70 mm of FS only. c) 70 mm of FS and 10 mm of distilled water (DW) were separated by 3 mm of air. d) 70 and 10 mm of FS were separated by 3 mm of air. e) 70 mm of FS only. Following a cooling at 1 •Ž/min from 25•Ž to -7•Ž with a programmable freezer (FFP-190, Osaka Sanso Kogyo, Japan), the respective straws were held at -7•Ž for 10 min. Then, they were cooled further at 1•Ž/min to -20•Ž . Straws a)-d) were cooled without intentional ice-seeding; Straw e) was seeded at -7•Ž with an automatic seeding device of the freezer. (From Kojima et al., 1986).
使 用 時 まで4℃ の 蒸 溜 水 中 に保 存 した.Fig.2に 示 す よ う に,固 定 化 ヨ ウ化 銀 を ス トロ ー お よ び ポ リプ ロ ピ レ ン 製 チ ュ ー ブ等 の凍 結 媒 液 中 に胚 とと もに直 接 浸 漬 した. 前 者 の 場 合 と 同様 に潜 熱 発 生 開始 温 度 の測 定(凍 結 媒 液 と して10%グ リセ ロ ー ル ーPBS+20%牛 胎 児 血 清 を使 用 した)お よ び家 兎 胚 と牛 胚 を用 い て 加 沈in vitro あ る い は in vivo の 生 存 性 を 検 討 し た.冷 却 プ ロ グ ラ ム,融 解 方 法 お よ び培 養 方 法 は そ れ ぞ れ前 者 の方 法 に準 じて行 った. 固定 化 ヨウ化 銀 あ る い は ヨウ化 銀 を含 ま な い ア ル ギ ン 酸 ゲ ル ドロ ップ レ ッ トか らの氷 晶 の発 生 を観 察 し撮 影 す る た め に,ビ デ オ カ メ ラ(浜 松 フ ォ トニ ク ス,C2400; 松 下 電 器,AG-2320)お よ び ビ デ オ プ ロ セ ッサ ー(三 菱 電 機,SCT-P70)を 接 続 し た低 温 顕 微 鏡(ニ コ ン ダ イ ア フ ォ トTMDお よ び コ レ ッ ト)を 使 用 した.そ の低 温 顕 微 鏡 の ク ラ イ オ ス テ ー ジ は,液 体 窒 素 ガ ス に よ る冷 却 お よ び ヒ ー タ ー に よ る 加 温 シ ス テ ム(大 倉 電 気, EC1103A)に よ り制 御 さ れ て い る.試 料 の 温 度 は,デ ジ タル 式 温 度 記 録 計(竹 田 理 研,TR2114)に 接 続 した 38ゲ ー ジの 銅 コ ンス タ ン タ ン熱 電 対 で 測 定 した.本 試 験 で は,3種 類 の 水 溶 液(蒸 溜 水,10%グ リセ ロ ー ル ・蒸 溜 水 溶 液 お よ び11%DMSO・ 蒸 溜 水 溶 液)を 準 備 した. − つ あ るい は複 数 の 固 定 化 ヨ ウ化 銀 を含 む極 少 量(直 径 4mm,厚 さ1.5mm)の 各 水 溶 液 を雰 囲 気 の 冷 気 に よ る植 氷 を避 け るた め に,ク ラ イ オス テ ー ジ の 中央 に置 い た.試 料 を ク ラ イ オス テ ー ジ にセ ッ ト した後,15℃ か ら 0℃ ま で 分 速7℃ で,次 い で 氷 晶 が 発 生 す る ま で 分 速 0.25℃ で 冷 却 した.各 固 定 化 ヨ ウ化 銀 の 変 化 を ビ デ オモ ニ タ ー を 通 じ て 観 察 し,経 時 的 に ビ デ オ プ ロ セ ッサ ー に よ り画 像 撮 影 を 行 っ た(Kojima et al,1988c).
結果 と考察
ヨウ化 銀 を蒸 留 水 中 に懸 濁 して用 い る 方 法 お よ び ヨウ 化 銀 を ア ル ギ ン酸 カ ル シ ウ ム ゲ ル 中 に 固 定化 す る方 法 の ダ ミー試 料 を用 い た 潜 熱発 生 開 始 温 度 の 測 定結 果 をFig. 3お よびTable 1に 示 す.そ れ ら か ら明 らか な よ うに, 両 者 の方 法 と も,ス トロ ー 中 に ヨウ化 銀 を含 む試 料 で は 氷 晶形 成 開始 が 概 ね-6∼-7℃ に 開始 す る もの と推 定 さ れ た.凍 結 媒 液 間 の違 い を補 正 した過 冷却 度(二 潜 熱 発 生 開始 温 度 一 凍 結 媒 液 の凍 結 点)に お い て も概 ね2∼ 3℃ を示 した.対 照 区 で は,過 冷 却状 態 が 進 み,-10℃ 以下 の温 度 で の 自然 発 生 的 な氷 晶 形 成 開 始 が見 られ た. しか し,こ れ らは あ く まで もセ ンサ ー が 装 着 され た試 料 で の温 度 変 化 で あ り,実 際 に胚 を用 い て そ の有 効 性 を調 べ る必 要 が あ っ た. Table 2に は蒸 溜 水 に ヨ ウ化 銀 を懸 濁 す る方 法 を用 い て 凍 結 した 家 兎 胚 のin vitro生 存 性 を示 す. Table 2か ら明 らか な よ うに,ヨ ウ化 銀 を用 い た 区 で は従 来 の 方 法 で植 氷 を行 っ た 区 と同 等 の 発 育 成 績 を示 し,ヨ ウ化 銀 を 含 む蒸 溜 水 が ま ず氷 晶 化 し,そ の 氷 晶 が 予 め 設 け られ た 気 泡 を越 え て 凍結 媒 液 の 氷 晶 形 成 を安 定 的 か つ 自動 的 に 誘 起 した こ とが 推 察 され た.こ の 方 法 に よ り植 氷 して 凍 結 保 存 され た 牛 胚 か ら正 常 な 雄 子 牛2頭 が 分 娩 さ れ た (Kojima et al.,1987a).こ の 方 法 は,従 来 の植 氷 方 式 と 異 な り手動 に よる操 作 が 全 く不 要 で あ る,植 氷 時 の 温 度 変 化 が 全 くな い,氷 晶 の 成 長 速 度 が 緩 や か で あ る,多 数 の 試料 の 同 時植 氷 が 可 能 で あ る,お よ びス トロー の 水 平 保 持 が 可 能 で あ る な ど多 くの 利 点 を有 す る.し か しな が ら,こ の 方法 は ス トロ ーの 吸 引 方 法 が 煩 雑 で あ り,気 泡 が大 きす ぎる と氷 晶 の 成 長 が 停 止 す る,凍 結 媒 液 と ヨウ 化 銀 が混 ざる可 能性 が あ る,あ るい はス トロー 以 外へ の 応 用 が 難 しい な どの 改 善 す べ き点 が 見 い 出 され た. ヨ ウ化 銀 を固 定化 す る方 法 は これ らの 欠 点 を改 善 す べ く考 案 され た.Table 3に 家 兎 胚 を, Table 4に 牛 胚 を 用 い たin witro生 存 性 試 験 の 成 績 を そ れ ぞ れ 示 す. Table 5に は,牛 胚 を用 い た移 植 に よ る受 胎 試 験 の 成績 を示 す.両 者 と も凍 結 容 器 にス トロ ー を用 い た 場 合 に は 前 法 と変 わ らな い 高 い 生 存 率 を示 した.こ れ らの 成績 か ら,本 法 は実 用 レベ ル で 十 分 に使 用 に耐 え る氷 晶 形 成 誘 起 法 で あ る と考 え られ る.実 験例 数 が 少 ない が ガ ラス ア ンプ ル とポ リプ ロ ピ レ ン製 チ ュー ブ を用 い た場 合 は,ス トロ ー を用 い た場 合 に比 べ て 生 存 性 が 低 い 傾 向 に あ った.Fig. 2. Diagram of 0.25-ml straw and 1 ml capacity polypropylene tube with a droplet of silver iodide immobilized in alginate gel.
a) b) c) d) e) こ の理 由 と して,そ れ らの 凍結 容 器 を用 い た サ ン プル で は,ス トロ ー の 場 合 と比 べ て 潜 熱 発 生 開 始 温 度 が 低 い(過 冷 却 度 が 大 きい),容 器 の 熱 伝 導 性 が 劣 る た め に 潜 熱 発 生 後 の 冷却 再 開 まで 時 間 が 経 過 して,冷 却 プ ロ グ ラ ム通 りの冷 却 条 件 が得 られ な い な どが 考 え られ た.本 研 究 の 目的 の ひ とつ で あ る 凍結 媒 液 に 高 い 再 現 性 を も って 容 易 に しか も確 実 に氷 晶 を誘起 す る こ と に関 して は,特 に固 定 化 ヨウ化 銀 法 を用 い る こ とで 一 応 そ の 目的 が 達 成 され
Fig. 3. Temperature changes in the various samples (for detail see Fig. 1) not containing embryos in freezing
solution (FS). a) Straw loaded with 11% dimethyl sulfoxide containing FS and silver iodide, latent heat occurred immediately before temperature of the sample reached -7•Ž. In straws loaded with FS only (b), FS and distilled water (c) and FS and air (d), the samples were supercooled excessively and spontaneously nucleated at about -10•Ž . In the straw loaded with FS only and induced to freeze by an automatic seeding device (e), latent heat occurred while the temperature of the sample was held at -7•Ž. Temperature changes during cooling were monitored by a copper-constantan thermocouple connected to a thermocouple recorder. Each straw treatment had 3 replicates. Formation of ice crystals before supercooling was monitored by occurrece of latent heat during holding at -7•Ž. (From Kojima et al., 1986).
Table 1. The differences of the releasing temperature of the latent heat of fusion between with and without the immobilized silver iodide in the freezing solution (10% glycerol in PBS+ FBS)c
た と考 え られ る.し か しな が ら,融 解 後 の 生存 率 の低 下 を 防止 す る とい う観 点 で は,本 研 究 の 範 囲 内 で は そ の 効 果 は 明瞭 に現 れ な か っ た. 以 上 の結 果 は,一 方 で ヨウ化 銀 が胚 の 生存 お よび発 育 に対 して毒 性 を発 揮 して い る可 能 性 は きわ め て少 な い こ と を示 して い る と考 え られ た.成 績 に は示 さな か った が, 家 兎 桑 実 胚 を 固定 化 ヨウ化 銀 の ドロ ップ レ ッ ト1個 と培 養 液 中で 共 存 させ た状 態 で培 養 した 結 果,そ の胚 は透 明 帯 か ら脱 出 す る まで発 育 した.ま た,今 まで に こ の 方法 に よ り凍 結 した 家 兎 桑 実 胚(Kojima et al.,1990)お よ び豚 の脱 出 胚 盤 胞(Fujino et al.,1991)か ら も正 常 な産 子 が 得 ら れ て い る.し か し,ヨ ウ化 銀 が胚 に与 え る影 響 につ い て は今 後 も引 き続 き監 視 して い く必 要 が あ ろ う. Steponkusら(1984)の 方 法 に よ り,低 温 顕 微 鏡 の ク
Table 2. The effect of silver iodide as an inducer of ice crystal formation on morphological state and in vitro viability of frozen-thawed rabbit morulae
Table 3. Post-thaw development of rabbit morulae frozen by using the silver iodide alginate-gel droplet seeding method
Table 4. Post-thaw development of bovine Day 7 or 8 embryos frozen using the immobilized silver iodide seeding method
Table 5. Survival after transfer of bovine embryos seeded by the method of a AgI droplet immobilized in alginate-gel and frozen
Fig. 4. The germination of ice crystals from a AgI-alginate gel droplet in 11% DMSO. (a) The droplet is in a state before cooling to subzero temperatures (0.5•Ž). An arrow indicates a thermocouple. A scale bar represents 1 mm. (b) The droplet is slightly swelled by the formation of ice crystals in its inside (-8•Ž). A small projection of ice (indicated by an arrow) has just germinated from the droplet at -8.5•Ž. (c) An ice dendrite is growing on the droplet. (From Kojima al., 1988c).
ライ オス テ ー ジに セ ッ ト した 試 料 の 温 度 勾 配 を0℃ 付 近 の 蒸 溜 水 の 水 と氷 の 界 面 の 置 換 に よ って 測 定 した 結 果, 中 心 部 が 周辺 部 よ り,表 層 部 が 底 部 よ り もそ れ ぞ れ 温 度 が 高 か っ た.し か し,そ の 差 は ±0.2℃ 以 内 で あ っ た. 一連 の低 温 顕微 鏡 写真(Figs .4,5, and 6)は 固定 化 ヨウ 化 銀 の ドロ ップ レ ッ トか らの氷 晶 の発 生 の様 子 を現 して い る.要 約 す る と,固 定 化 ヨウ化 銀 の ドロ ップ レ ッ トは, 凍 結 媒 液 中で 恒 常 的 に-8℃ で氷 晶 を発 生 させ た.そ の 氷 晶発 生 に先 立 ち ドロ ップ レ ッ ト内 部 が まず 氷 晶 化 す る た め に膨 化 現 象 を起 こす.複 数 の ドロ ップ レ ッ トの 存 在 下 で は必 ず し も一 斉 に氷 晶 の 発 生 が 起 こ ら ない こ とか ら, 複 数 の ドロ ップ レ ッ トを凍結 媒 液 中 に胚 と共 に浸 漬 した 方 が 過度 の過 冷 却 か ら胚 を 防 ぐ確 率 が よ り高 ま る と推 察 さ れ る.こ の低 温 顕 微 鏡 の観 察 結 果 か ら,高 い零 下 温 度 域 で の細 胞 外 液 へ の氷 晶 の形 成 が 固 定 化 ヨ ウ化 銀 ドロ ッ プ レ ッ トの 働 き に よ って 起 こ っ てい る こ とが 証 明 さ れ た (Kojima et al.,1988c). こ の方 法 で は,恒 常 的 に-2∼-3℃ の 過 冷 却 度 で 氷 晶 形 成 が 誘 起 され るが,過 冷 却 度 を さ ら に小 さ くす るた め に 臭 化 銀 との 混 合 使 用 が 考 え られ る(Vonnegut and Chessin,1971;Chessin and Vonnegut,1971).ま た,牛 の 凍 結胚 移植 の た め の ワ ンス テ ップ 法 や ダイ レク ト法 に
Fig. 5. (a) The germination in distilled water starts at -4.4•Ž. The temperature around the thermocouple is increasing with the growth of ice dendrites. (b) The germination of ice crystals from an alginate gel droplet without AgI. The germination in 10% glycerol occurs at -13.5•Ž. (From Kojima et al., 1988c).
対 処 す る た め に,凍 結 用 ス トロ ー のス トロ ーパ ウ ダ ー に ヨ ウ化 銀 を混 ぜ て お く方 法 が 考 案 され て い る(Nogami et al,1990). 終 わ りに,本 研 究 に対 し栄誉 あ る家 畜 繁 殖 学 会 佐 藤 賞 を与 え て下 さ っ た家 畜 繁 殖 学 会 に心 よ り感 謝 す る.ま た, 推 薦 の労 を とっ て戴 い た酪 農学 園大 学 堤 義 雄 教 授,本 研 究 を ま とめ る にあ た り終 始 御 指 導 戴 い た北 海 道 大 学 金 川 弘 司 教 授 に深 謝 す る.本 研 究 は,農 林 水 産 省 畜 産 試 験 場 繁 殖 部 生 殖 細 胞 移 植 研 究 室 に お い て元 室 長 小 栗 紀 彦 博 士 (現帯 広 畜 産 大 学),故 相 馬 正 主 任 研 究 官,富 塚 常 夫 主 任 研 究 官,依 頼 研 究 員 遠 藤 健 治 氏(現 森 永 乳 業)お よび依 頼 研 究 員 小 野 寺 邦 男 氏(青 森 県 畜 産 試 験 場)の 御 援 助 に よ り達 成 され た もの で あ る.以 上 の方 々 に謹 ん で感 謝 の 意 を表 す る.原 稿 作 成 に協 力 して戴 い た銭 谷 由美 江 嬢 に お 礼 申 し上 げ る.
文
献
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crystal on the surface of a crystalline silver iodide. In:
Research Data of the Research Organization for
Rainmaking (Kansai Electric Power Co.,) pp 1-15 (in
Fig. 6. The variation in germination temperature among the Agl-alginate gel
droplets. (a) One of the 3 droplets in 10% glycerol germinates ice crystals at
-7.7•Ž. The other 2 droplets remain supercooled. (b) One droplet in 11% DMSO germinates at -8•Ž. The remaining 2 are swelling with the internal ice formation. (From Kojima et al., 1988c).
Japanese).
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