痛風病因としての尿酸トランスポーターABCG2の病態生理学的重要性とレアバリアント解析

論文種目：総合論文

痛風病因としての尿酸トランスポーター ABCG2 の

病態生理学的重要性とレアバリアント解析

豊田 優

_{・高田龍平}

_{*・松尾洋孝}

_{・市田公美}

_{・Blanka Stiburkova}

_{・鈴木洋史}

SUMMARY

Adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette transporter G2 (ABCG2; also known as breast cancer resistance protein, BCRP) is a physiologically important urate transporter of which congenital dysfunction is identified as a strong genetic risk factor of gout as well as hyperuricemia, a common disease characterized by elevated serum urate concentrations. Since uric acid is the final metabolite in the purine catabolic pathway in humans, urate excretion from the body is necessary for the maintenance of uric acid homeostasis. Accumulating evidence suggests that the net amount of excreted uric acid is regulated mainly by urate transporters. Among them, ABCG2 is expressed on the apical membranes of intestinal and renal epithelial cells where it plays a pivotal role in urate excretion from the body as an ATP-dependent urate exporter. Moreover, recent studies show the clinical significance of both common and rare variants of ABCG2, suggesting the importance of further identification and validation of population-specific rare variants of ABCG2 to achieve more effective and accurate prediction of ABCG2-related gout/hyperuricemia risk. Via molecular analyses, we have characterized such ABCG2 variants, which disrupt ABCG2 function as a urate transporter, found in the Japanese population and the Czech Republic population. Additionally, given that ABCG2 is recognized to be an important determinant of pharmacokinetic characteristics of its substrate drugs, such infor-mation will also be useful in the field of pharmacogenomics. Here, we would like to introduce our recent findings about pathophysiological importance of ABCG2 that has been investigated through clinico-genetic analyses for gout/ hyperuricemia patients in combination with functional studies.

Key words: clinical sequence, life style-related disease, hyperuricemia, transporter, uric acid

はじめに ヒトにおけるプリン体の最終代謝産物である尿酸は，血 清中濃度が高値になると痛風や尿路結石を発症しやすくな る．高尿酸血症や痛風は，贅沢病という言葉があるように， 肥満や高プリン食の摂食過多といった環境要因に起因する と考えられてきたが，近年の研究により，遺伝的な要因に よる影響も大きいことが明らかとなっている．特に，ゲノ ムワイド関連解析（GWAS）をはじめとする臨床遺伝学的 解析により，血清尿酸値と関連する因子として，多くの膜 輸送体（トランスポーター）分子が見いだされてきた1, 2）_． このことは，受動的な細胞膜透過がほぼ不可能である尿酸 の体内動態制御には膜輸送体が必須であり，血清尿酸値の 個人差の遺伝的背景の多くが尿酸輸送体の変異・多型に より説明可能であることを示唆するものである．ところ が，腎性低尿酸血症の原因遺伝子として urate transporter

Pathophysiological impact of dysfunctional common and rare variants of urate transporter ABCG2 on urate-related diseases Yu Toyoda1_{, Tappei Takada}1_{, Hirotaka Matsuo}2_{, Kimiyoshi Ichida}3_{, Blanka Stiburkova}4_{, Hiroshi Suzuki}1

1 _{Department of Pharmacy, The University of Tokyo Hospital, Tokyo, Japan;} 2 _{Department of Integrative Physiology and Bio-Nano}

Medicine, National Defense Medical College, Saitama, Japan; 3 _{Department of Pathophysiology, Tokyo University of Pharmacy and Life}

Sciences, Tokyo, Japan and 4 _{Institute of Rheumatology, Prague, Czech Republic}

* Corresponding author: Tappei Takada; Department of Pharmacy, The University of Tokyo Hospital, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8655, Japan

E-mail: [email protected]

り込まれた ABCG2 基質薬物を管腔内へと排出する（押し 戻す）活性が弱まる結果，薬物の吸収が上昇することに よって説明される．このように，薬物トランスポーター ABCG2の薬物動態制御因子としての重要性は認識されて いた一方で，ヒトにおける生理的基質や生理機能について は不明であった． 2004年，台湾の研究グループにより，ヒト第 4 染色体 長腕に未知の痛風病因遺伝子が存在する可能性が報告され た．ところが，その候補領域には多くの遺伝子が含まれ ており，具体的な病因遺伝子は同定されていなかった14）_． ABCG2 遺伝子がこの領域に存在すること，既知の輸送基 質との比較から尿酸は ABCG2 の基質になりうると考えら れたことなどの理由により，ABCG2 による尿酸輸送に関 する検討が進められた． 尿酸輸送活性の有無を調べるために，ABCG2 発現細胞 から調製した細胞膜小胞を用いた in vitro 輸送実験を行っ たところ，ABCG2 は生理的濃度では飽和しない高容量性・ 低親和性の尿酸輸送を担うことが明らかとなった．すなわ ち，尿酸の溶解度が比較的高い高 pH 下で求められた Km 値は 8.24 ± 1.44 mM であり，血清尿酸値（例：7.0 mg/dL =約 420 μM）と比べて，はるかに高いものであった15）_． また，変異体解析の結果，他の輸送基質の場合と同様，尿 酸輸送においても p.Q141K では機能が半減し，p.Q126X では機能が消失することが示された． つづいて，ABCG2 の機能低下が血清尿酸値に与える影 響を調べるために，日本人の健康診断受診者のサンプルを 用いて，ABCG2 変異と血清尿酸値の関係について検討した． その結果，p.Q141K 変異の保有数が多いほど，血清尿酸値 が上昇していた15）_{．また，ハプロタイプ頻度解析により，} p.Q126Xと p.Q141K の両変異は同じ染色体上には存在し ないことが示された．そこで，両変異の頻度について日 本人男性の痛風症例と健常者で比較した結果，p.Q126X と p.Q141Kの組み合わせから推定される尿酸輸送活性の低下 に伴い，オッズ比で示される痛風発症リスクが顕著に高ま 1（URAT1）3）_{および glucose transporter 9（GLUT9）}4）_と

いう尿からの尿酸再吸収を担う尿酸輸送体が同定されてい たものの，逆向きの輸送である体外への尿酸排出を担う尿 酸輸送体は長らく不明であった．本稿では，その分子実体 のひとつであり，機能低下が高尿酸血症・痛風の強力な リスク因子となることが知られる adenosine triphosphate-binding cassette transporter G2（ABCG2）（Fig. 1） に つ い て，尿酸輸送の観点から著者らの研究結果を中心に紹介す る．なお，本稿では第 70 回日本電気泳動学会シンポジウ ムでの講演内容に基づく執筆が求められているため，すで に著したいくつかの総説5–7）_{と内容が重複することをあら} かじめお断りしておく． 尿酸排出輸送体ABCG2 の遺伝子多型と 高尿酸血症・痛風発症リスク

ABCG2は，breast cancer resistance protein（BCRP） と いう別名があるように，多剤耐性に関与する因子として発 見された膜輸送体である8）_{．2000 年代に入り，広範な組}

織分布と広い基質認識性を有することが次第に明らかと なり9, 10）_{，現在では多様な視点から研究が進められている．}

日本人における ABCG2 の一塩基多型（single nucleotide polymorphisms, SNPs）のアレル頻度は高く，なかでもタ ンパク質レベルが約半分に低下する c.421C>A（p.Q141K） は 31.9％，終止コドンが生じ機能欠損となる c.376C>T （p.Q126X）は 2.8％であると報告されている11）_．これら の SNPs のうち，頻度が高く機能低下を伴う c.421C>A （Q141K）については臨床的にもよく研究されており，薬 物動態の変動としては，スルファサラジンの消化管吸収の 上昇12）_{，ロスバスタチンやフルバスタチンの経口投与時} の薬物血中濃度−時間曲線下面積（AUC）や最高血中濃度 （Cmax）の上昇が観察されている13）．これらは，ABCG2 が 様々な物質の細胞内から細胞外への物質輸送を担うこと， および小腸上皮細胞の管腔側膜に発現していることを踏ま えると，ABCG2 機能の低下に伴い，小腸上皮細胞内に取

たな病型分類として「腎外排泄低下型」高尿酸血症が提唱 された17）_{．これら一連の成果は，予防医学や個別化医療} に貢献しうるものと考えられ，今後の臨床応用が期待され ている． ABCG2 のレアバリアントと人種差 集団におけるアレル頻度が低い遺伝子変異をレアバリア ントとよぶ．GWAS によって疾患との関連が精力的に解析 されてきたコモンバリアント（たとえば，痛風・高尿酸血 症における ABCG2 p.Q141K など）と比べて，レアバリア ントの解析は疾患感受性の観点からは十分に研究がなされ ているとはいえなかったが，昨今におけるシーケンス技術 の向上により，レアバリアントが果たす役割にも注目が集 まっている．そこで，より精度の高い疾患発症リスク予測 の実現に資する，疾患感受性遺伝因子に関する情報のさら なる蓄積を目的として，ABCG2 レアバリアントに着目し た研究が進められた． まず，日本人の痛風患者と尿酸値正常コントロールを 対象として，ABCG2 の全エキソン領域を標的とするター ゲットシーケンス解析が実施された．見出された非同義レ アバリアントのうち，ABCG2 の機能低下をもたらすとい う点で機能的意義が明らかとなったものに着目し，痛風発 症に対するリスクの大きさを遺伝統計学的に評価したとこ ろ，そのオッズ比（OR=2.7）は，コモンバリアントであ る p.Q141K（OR=2.3）および p.Q126X（OR=3.4）とほぼ 同等であった19）_{．同一遺伝子におけるコモンバリアント} とレアバリアントのいずれもが多因子疾患の疾患感受性に 大きな影響を及ぼすという報告はこれまでにほとんどなさ れておらず，痛風における遺伝要因の強さを改めて示す結 果が得られたといえる． さらに筆者らは，日本人のみならず，世界的に見ても 高尿酸血症・痛風の発症率が高いチェコ人症例に着目し， ABCG2のレアバリアントと尿酸関連疾患との関連を検討 した20–22）_{．遺伝学的解析の結果，ABCG2 の非同義変異を} 2つ以上有する患者では，痛風の発症年齢が有意に低い ことが見出され21）_{，ABCG2 の機能欠損と家族性の若年性} 高尿酸血症／痛風との関連を示唆する結果も得られた20）_． なお，日本人集団の場合においても，ABCG2 機能が低い ほど若年性痛風リスクが高まるという同様の傾向が見出さ れている23）_{．また，in vitro 機能解析を通じて，ABCG2 の}

機能低下／欠損を伴う ABCG2 レアバリアントを新たに 9 種類同定することにも成功した．興味深いことに，チェ コ人集団と日本人集団で見出された機能低下／欠損型 ABCG2レアバリアント19）_{の間には，重複が認められな} かった．この人種差を踏まえると，尿酸関連疾患に寄与す る日本人の遺伝的要因に関する理解を深めるためには，日 体内において尿酸の体外への排泄に関与しており，その機 能低下が血清尿酸値15, 16）_{および痛風発症リスク}15）_の上昇 をもたらすことを示すものであった． ABCG2 の機能低下と腎外排泄低下型高尿酸血症 ABCG2は腎臓，肝臓，小腸などの頂端膜に発現し，輸 送基質の体外への排出に関わることが知られている．また， 尿酸は尿中のみならず糞中にも排泄されることが報告され ていたことから，ABCG2 はこれらの組織からの尿酸排泄 に関与している可能性が考えられた．そこで，ABCG2 に よる生体内の尿酸輸送経路，および，ABCG2 機能低下に よる高尿酸血症発症のメカニズムを明らかにするため，さ らなる研究が進められた17）_． まず，ABCG2 の機能低下が腎臓からの尿酸排泄に与 える影響について，高尿酸血症患者における SNPs 情報 と尿検体を用いた解析が実施された．その結果，ABCG2 が尿中への尿酸排泄に関与するという大方の予想に反し， SNPsの組み合わせのパターンから推測される ABCG2 の 機能低下に伴い，尿中への尿酸排泄量が増加することが見 出された17）_． 次に，ABCG2 の欠損が尿酸の体内動態に与える影響に ついてさらなる詳細な検討を行うため，マウスを用いた実 験が進められた．マウス Abcg2 タンパク質がヒト ABCG2 タンパク質と同様の高容量性・低親和性の尿酸輸送能を持 つことを確認したのち，野生型マウスと Abcg2 遺伝子欠 損（KO）マウス18）_{の比較がなされた．なお，尿酸の全身} 動態制御には，多くの哺乳類（マウスを含む）の場合と異 なり，ヒトでは尿酸分解酵素ウリカーゼの遺伝子機能が消 失しているという種差がある．そのため，ウリカーゼ阻害 条件下における尿酸動態が調べられた．その結果，Abcg2 KOマウスでは野生型マウスと比べて高い血清尿酸値が認 められるとともに，尿中への尿酸排泄は低下せずむしろ亢 進しているという，ヒトでの結果と一致する傾向が認めら れた．さらに，腸管への経時的な尿酸排泄を評価した結果， Abcg2 KO マウスでは野生型マウスの半分以下しか腸管内 に尿酸が排泄されていないことが見出された17）_．胆汁中 への尿酸排泄がわずかであったことも考慮し，単位時間当 たりの各組織からの尿酸排泄量を比較したところ，Abcg2 KOマウスにおける血清尿酸値の上昇は，腸管からの尿酸 排泄の低下によるものであると考えられた． 以上の結果を踏まえると，ABCG2 の機能低下に伴う高 尿酸血症は，腎臓以外（腸管）からの尿酸排泄低下による ものであると考えられ，無視されがちであった腸管からの 尿酸排泄の生理的重要性を示すという点からも新しい発見 であった．そのため，従来の高尿酸血症の病型分類：尿中 への尿酸排泄が低下している「（尿中）排泄低下型」，およ

排泄を阻害しているのであれば，本来の血清尿酸値降下作 用の一部が相殺され，期待よりも治療効果が減弱している かもしれない．今後，ABCG2 を阻害しない尿酸合成阻害 薬や尿酸排泄促進薬が開発されれば，より強力な尿酸降下 作用を有する薬となることが期待される． おわりに 本稿では，ABCG2 の尿酸輸送体としての（病態）生理 学的重要性に加え，臨床上重要となる ABCG2 遺伝子多 型・レアバリアントの同定，および ABCG2– 薬物間相互 作用に関する知見を中心に概説した．ABCG2 は，尿酸排 泄臓器において体外へ尿酸を排泄する生理的に重要な尿酸 輸送体であり，痛風・高尿酸血症の主要病因遺伝子であ る．痛風と関連する遺伝子は ABCG2 以外にも複数同定さ れているが，ABCG2 ほどの高いリスクを呈し，高頻度に 遺伝子多型が認められるものはこれまでに報告されていな い．ABCG2 が重要な薬物動態規定因子のひとつでもある ことを踏まえると，著者らの研究を通じて得られた成果は， ファーマコゲノミクスの観点からも有益であり，個別化医 療や予防医学への応用が期待される． 高田，松尾，市田，鈴木は本論文の内容に関連した特許 を出願・取得している．その他の著者は，本論文に関して 開示すべき利益相反状態は無い． 文 献

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本人検体を用いた地道な解析が今後も重要になると考えら れる．将来，民族固有の変異がさらに同定されるものと予 想され，その機能的意義（遺伝子機能への影響）の解明を 通じて，疾患リスクの予測・予防医学の実践に活用される ことが期待される． 血清尿酸値変動薬と ABCG2 機能阻害 上述した一連の研究により，遺伝的要因による ABCG2 の機能低下が血清尿酸値の上昇をもたらすことが示された． この知見を踏まえると，薬物などによる ABCG2 の機能変 動が血清尿酸値の変動要因となることが予想された．とこ ろが，ABCG2– 薬物間の相互作用と血清尿酸値に関する研 究はほとんどなされておらず，不明な点が多いのが現状で あった．そこで，ABCG2 と薬物との相互作用に着目した 研究を進めた． まず，血清尿酸値を変動させることが知られる薬物（血 清尿酸値変動薬）が，ABCG2 の尿酸輸送能に与える影響 を検討した．実験に耐えうる最大濃度（10 μM–1 mM）の 各薬物存在下でのスクリーニングを行った結果，25 薬物 中 10 薬物が ABCG2 の尿酸輸送活性を野生型の 25％以下 に低下させることが見出された24）_． 血清尿酸値の低下を効果的に達成するためには，腎臓で 尿からの尿酸再吸収を担う URAT1 を阻害する一方で，腸 管からの尿酸排泄を担う ABCG2 を阻害しないことが望 ましい．そこで，各血清尿酸値変動薬（3 μM）が URAT1 および ABCG2 の尿酸輸送活性に与える影響を比較し た．その結果，今回選択した薬物の多くが URAT1 よりも ABCG2を強く阻害する傾向にあることが明らかとなっ た24）_． 特に，尿酸合成阻害薬の中には，他の多くの薬物と同 様に URAT1 をほとんど阻害しない一方で，ABCG2 をき わめて強く阻害するものが複数存在していた．そこで，in vitro 実験において ABCG2 を強く阻害した薬物が，臨床用 量でヒト体内においても ABCG2 の尿酸輸送を阻害しうる かどうかを検討するために，薬物濃度依存的な ABCG2 阻 害実験の結果から算出した IC50値と，推定されるヒト血 漿中非結合型薬物濃度を比較した．その結果，尿酸合成阻 害薬のひとつであるフェブキソスタットが，臨床上到達し うる濃度で ABCG2 の尿酸輸送を阻害する可能性が強く示 唆された24）_{．なお，この知見に基づいて実施されたヒト} での薬物吸収試験において，臨床用量のフェブキソスタッ トが腸管の ABCG2 を阻害することを示唆する結果が報告 されている25）_． 本研究の結果，尿酸降下薬の中には ABCG2 による尿酸 輸送を強く阻害するものが存在すること，臨床濃度におい て ABCG2 を介した尿酸輸送を阻害しうる薬物が存在する ことが示された．これらの尿酸降下薬が消化管からの尿酸

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