RIPA法によるキュウリの3種ウイルス同時検定の改良

植 物 防 疫  第66 巻 第 4 号 （2012 年） ― 28 ― 224 は じ め に 植物ウイルス病の効率的な防除には，なにより迅速で 正確な診断技術が不可欠である。現在，ウイルス病の診 断法は，病原遺伝子の検出による遺伝子学的診断法 （PCR，RT―PCR，LAMP 等 ） が 主 に 用 い ら れ て い る。 しかし，高額な機材および試薬が必要であり，またその 操作手法も煩雑であるため，現地での発生調査や多試料 の診断には必ずしも適しているとは言えない。一方，血 清学的診断法の一つである迅速免疫ろ紙検定（RIPA） 法（TSUDA et al., 1992；亀谷，1993；OHKI and KAMEYA-IWAKI,

1996）は，検体を磨砕しガラス繊維ろ紙のストリップを その磨砕液に浸すという簡便な操作で，なんら機材を必 要とせず10 分程度で診断が可能である。このリトマス 試験紙のような簡便さと迅速性から，生産者・普及員等 が現場圃場で診断可能である。病気をおこしているウイ ルス種がわかれば，その後の防除対策（感染株の早期抜 き取り・作業器具の消毒・媒介虫の防除等）をただちに 行うことができる。また，別のウイルス抗体を処理する ことにより同時に2 種以上のウイルスを検出できるよう

に し た も の が， 多 重（Multi―）RIPA 法（TSUDA et al.,

1993）である。

キュウリには多くのウイルス病が知られている。なか でもモザイク病は，Cucumber mosaic virus（CMV）と Zucchini yellow mosaic virus（ZYMV）が主な病原で，全 国的に発生が見られるウイルス病である。これらは汁液 で伝搬するとともにアブラムシにより媒介される。また， キュウリ黄化えそ病は近年西日本を中心に発生が拡大し ている病害で，Melon yellow spot virus（MYSV）が病原 ウイルスである。MYSV は，汁液で伝搬するとともに， ミナミキイロアザミウマにより媒介される。 これら3 種のウイルスによる病徴は似ているため，素 人には病徴からの診断は困難である。また，キュウリで は生育初期にCMV と ZYMV の重複感染により急性萎 凋症状が引き起こされることが報告されており（IWASAKI and INABA, 1988；岩崎ら，1996），ウイルス重複感染の把 握は極めて重要であると考えられる。 そ こ で， 簡 便 さ・ 機 動 性・ 迅 速 性 に 優 れ たMulti― RIPA 法をこれらキュウリの 3 種ウイルス，すなわち CMV，MYSV，そして ZYMV の同時検出に応用できな いか検討した。本稿では，筆者が今回キュウリのMulti―

RIPA 法で改良した点（OSAKI et al., 2011）を紹介し，今

後の新たな他作物のMulti―RIPA 法の実用化の一助に供 したい。 I ウイルス病の診断法 植物ウイルス病の診断法としては，現在PCR（また はRT―PCR）法や LAMP 法等の病原ウイルスの遺伝子 情報に基づく遺伝子学的診断法と，ELISA 法等の血清学 的診断法が汎用されている。遺伝子学的診断法は，数時 間で微量の核酸試料から高感度にウイルス遺伝子を検出 可能である。しかし，遺伝子学的診断法はコストが高く， また検定作業も熟達を要し，さらに現地圃場など野外で の診断は不可能である。一方，血清学的診断法の一つで あるELISA 法は，比較的作業も簡便で多試料検定に適 しているものの結果が出るまで2 日間を要する。 他の血清学的診断法としては，簡易二重拡散法（匠原， 1980）や，赤血球（MOORHEAD and PRICE, 1953；安尾・柳

田，1963）， ラ テ ッ ク ス（ABU SALIH et al., 1968 ; BERCKS

and QUERFURTH, 1971 ; OMURA et al., 1984），高比重ラテッ

ク ス（ 河 野・ 高 橋，1997）， ゼ ラ チ ン（NATSUAKI et al., 1988）等を担体として用いる凝集反応法は，抗原抗体反 応を利用した植物ウイルス病の簡便な診断法として利用 されている。しかし，検定時間は数時間から一昼夜を要 する。 次に紹介するRIPA 法も，抗原抗体反応を利用したも のであるが，簡便な操作で10 分程度で診断が可能であ り，またなんら電気機器を必要としないため，現地圃場 での診断も可能である。 II RIPA 法の原理 RIPA 法の検定手順を図―1 に示した。あらかじめウイ ルス抗体で感作した白色ラテックス粒子液を面相筆でガ ラス繊維ろ紙（ワットマン社製，GF/A）のストリップ（幅 5 mm ×長さ 8 cm）に線状に塗布することにより感作白 色ラテックス粒子を固定しておく。

RIPA 法によるキュウリの 3 種ウイルス同時検定の改良

大  崎  秀  樹

Improvement of Simultaneous Detection of Three Viruses of Cucumber by RIPA.  By Hideki OSAKI

（ キ ー ワ ー ド：Multi―RIPA 法， キ ュ ウ リ，CMV，MYSV， ZYMV）

RIPA 法によるキュウリの 3 種ウイルス同時検定の改良 ― 29 ― 225 まず検体を緩衝液中で磨砕し，ストリップ下端をその 磨砕粗汁液に浸し，その液を吸い上げる（約5 分）。こ の過程で陽性であれば粗汁液中のウイルス粒子がストリ ップのガラス繊維ろ紙中を下端から上部へ移動し，感作 白色ラテックス粒子が線状に固定されている部位で捕捉 される。その後ストリップ下端の検体磨砕粗汁液で緑色 になった3 mm 程度をハサミで切除する。次に同様にウ イルス抗体で感作した着色ラテックス粒子液にストリッ プ下端を浸し着色ラテックス粒子を吸い上げさせる。ス トリップ中を吸い上げられた着色ラテックス粒子は，白 色ラテックス粒子に捕捉されているウイルス粒子と結合 し，陽性であると数分で着色したバンドが現れる。陰性 であると着色ラテックス粒子は，白色ラテックス粒子が 固定されているラインを越えてさらに上部に移動しバン ドは現れない。複数のウイルス抗体でそれぞれ感作した 白色ラテックス粒子をストリップ上の位置を変え固定す ることにより同時に複数のウイルスを診断できるように したものがMulti―RIPA 法である。 III 改  良  点 Multi―RIPA 法を初心者にも使いやすく視覚的に判別 しやすいものにするため，陽性バンドの色を増やすこと は で き な い か 検 討 し た。JSR 社 製 の 赤 色（cat. no. G0301R）と青色（cat. no. G0304B）のラテックス粒子 をそれぞれMYSV 抗体で感作し，それらを混合して着 色ラテックス粒子液として用いることにより見かけ上紫 色の陽性バンドを作り出すことが可能であった。口絵① 混合比を変えることにより，赤勝ちの京紫や青勝ちの江 戸紫等見かけ上色調が変わったバンドが形成されること が示された。すなわち混合比を調整し色調を変えること により，4 種以上のウイルスの陽性バンドの色による識 別が可能であると示唆された。 亀谷ら（1994）は，ひも状粒子であるポティウイルス 等，ろ紙中での移動が困難と考えられるウイルス種はで きるだけ下端に近いところに固定するよう推奨している ため，下端から15 mm の位置に ZYMV 抗体，20 mm の 位置にMYSV 抗体，25 mm の位置に CMV 抗体でそれ ぞれ感作した白色ラテックス粒子を固定し，三重複感染 したキュウリ葉を供試してMulti―RIPA 法を行ったが， CMV 陽性バンドは形成されたが，他のバンドは明瞭に 形成されなかった。そこでバンドがどの位置まで形成さ れるか検討したところ，CMV は 5 mm 間隔で下端より 15 mm ∼ 35 mm の位置に置いてバンドが形成されたが， MYSV は下端より 20 mm，ZYMV は下端より 15 mm の 位置までしかバンドが形成されず，また形成されたバン ドは不明瞭なものであった（図―2 A，C）。そこで磨砕 緩衝液の組成を検討したところ，牛血清アルブミン （BSA）濃度を 0.1％から 0.2％にしたところ，図―2 B， D に示すように，それぞれ 35 mm まで明瞭なバンドが 形成された。そこで0.2％含有磨砕緩衝液を用い，三重 複感染したキュウリ葉を検定してみると，3 種白色ラテ ックス粒子を下端より15，20，25 mm のどの位置に塗 布固定しても，CMV 陽性，MYSV 陽性，ZYMV 陽性を それぞれ示す明瞭な青色バンド，紫色バンド，赤色バン ドが形成された（口絵②）。 また，磨砕緩衝液のBSA 濃度を 0.1％から 0.2％に上 げることにより3 種ウイルス，それぞれの RIPA 法での 検出感度が，CMV では 2 倍に，MYSV では 4 倍に，そ してZYMV では 8 倍に向上し，より低濃度のウイルス を検出できることが明らかとなった（表―1）。これら結 果から，BSA 濃度を上げることによりウイルス粒子の ガラス繊維ろ紙中での移動度が増したと考えられた。ま た，図―2 からわかるように，BSA 濃度を上げることに より，着色ラテックス粒子のストリップ下部への停滞が ガラス繊維ろ紙 ストリップ （5 mm×8 cm） 感作白色ラテックス 粒子液を面相筆で線 状に塗布し風乾する 検体磨砕液を 吸い上げる 感作着色ラテックス 粒子液を吸い上げる 陽性ならば数分 後にバンドが出 現する 図−1 RIPA 法の検定手順

植 物 防 疫  第66 巻 第 4 号 （2012 年） ― 30 ― 226 なくなり，上部への吸い上げが改善したことが示唆され た。口絵③に単独および重複感染キュウリでの検定例を 示した。陽性バンドの色により容易に感染しているウイ ルス種が判別可能であった。 もし3 種ウイルス病を診断する場合，ELISA 法ではそ れぞれの抗体で処理した三個のウェルが必要であるが， Multi―RIPA 法では 1 枚のストリップで十分である。ま たキュウリにおいても数種ウイルスを同時検出できるマ ルチプレックスRT―PCR 法（下元・竹内，2006；奥田ら， 2007）も開発されているが，PCR に基づく診断法は結 A B D C 図−2  BSA 濃度による白色ラテックス固定位置の検討

A と B は MYSV に対する，C と D は ZYMV に対する RIPA の結果を示した． それぞれ左から，ガラス繊維ろ紙ストリップ下端より15，20，25，30， 35 mm の位置に白色ラテックス液を塗布した． A，C：磨砕緩衝液中の BSA 濃度 0.1％． B，D：磨砕緩衝液中の BSA 濃度 0.2％． 表−1  磨砕緩衝液の牛血清アルブミン（BSA）濃度上昇による RIPA の検出感 度の改善 RIPA1） タイプ BSA 濃度 抽出粗汁液の希釈倍率2） 50 100 200 400 800 1,600 3,200 6,400 12,800 CMV 0.1％ 0.2％ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ − − − − MYSV 0.1％ 0.2％ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ − ＋ − − ZYMV 0.1％ 0.2％ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ − ＋ − ＋ − − − − − − 1）_{白色ラテックス液はそれぞれストリップ下端より15 mm の位置に塗布した．} 2）_{それぞれの罹病葉を半分に切除し，それぞれのBSA 濃度の抽出緩衝液で} 磨砕し検定した．希釈は同一の磨砕緩衝液で行った。＋は陽性を，−は陰性を 示す．

RIPA 法によるキュウリの 3 種ウイルス同時検定の改良 ― 31 ― 227 果が出るまで数時間を要する。Multi―RIPA 法は，迅速 性においてELISA 法および PCR 法より優れている。 お わ り に RIPA 法は上述したように簡便さと迅速性が優れてお り，ウイルス病診断には極めて有効であると考えられる が，現在RIPA 法は汎用されているとは言えない。その 原因の一つは，診断が1 種類のウイルス病のみに限定さ れていることが考えられる。そこで，多くの作物におい て2 種以上のウイルスを同時に検出できる Multi―RIPA 法の実用化を検討して，さらにRIPA 法を普及したいと 考えている。そこで本稿で紹介した改良点は，ポティウ イルスなど，ガラス繊維ろ紙中での移動が難しいと考え られるウイルス種の検定へのRIPA 法の応用に有効であ ると思われる。 また，ポティウイルスであるZYMV がストリップ下 端より35 mm の位置まで陽性バンドが形成されること から，5 mm 間隔で（下端より 15，20，25，30，35 mm） 5 種のウイルスの Multi―RIPA 法が可能であろうと考え られた。塗布し固定する位置の間隔を3 mm にすれば， さらに多くのウイルス種を検出できると思われる。キュ ウリにおいては，あと Papaya ringspot virus と Watermelon mosaic virus が本 Multi―RIPA 法に追加できればさらに 便利な診断法になるであろう。

引 用 文 献

1） ABU SALIH, H. S. et al.（1968）: J. Gen. Virol. 3 : 299 ∼ 302.

2） BERCKS, R. and G. QUERFURTH（1971）: J. Gen. Virol. 12 : 25 ∼ 32.

3） IWASAKI, M. and T. INABA（1988）: Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 54 :

584 ∼ 592.

4） 岩崎真人ら（1996）: 四国農試報 60 : 1 ∼ 88．

5） 亀谷満朗（1993）: 植物防疫 47 : 189 ∼ 192．

6） ら（1994）: 日植病報 60 : 784．

7） 河野敏郎・高橋義行（1997）: 同上 63 : 403 ∼ 405．

8） MOORHEAD, E. L. and W. C. PRICE（1953）: Phytopathology 43 : 73

∼77. l

9） NATSUAKI, K. T. et al.（1988）: Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 54 : 548

∼551.

10） OHKI, S. T. and M. KAMEYA-IWAKI（1996）: Ann. Phytopathol. Soc.

Jpn. 62 : 240 ∼ 242.

11） 奥田 充ら（2007）: 九病虫研会報 53 : 9 ∼ 13．

12） OMURA, T. et al.（1984）: Plant Dis. 68 : 374 ∼ 378.

13） OSAKI, H. et al.（2011）: J. Gen. Plant Pathol. 77 : 307 ∼ 311.

14） 下元祥史・竹内繁治（2006）: 日植病報 72 : 146 ∼ 149．

15） 匠原監一郎（1980）: 植物防疫 34 : 106 ∼ 110．

16） TSUDA S. et al.（1992）: Plant Dis. 76 : 466 ∼ 469.

17） et al.（1993）: Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 59 : 200 ∼ 203.