列 を 網 羅 し た 673 種 類 の 合 成 ペ プ チ ド を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ に よ り ， 多 数 の 細 胞 接 着 活 性 配 列 が 同 定 さ れ て き た ． 同 定 さ れ た ペ プ チ ド の 中 に は ， イ ン テ グ リ ン や シ ン デ カ ン な ど の レ セ プ タ ー に 特 異 的 に 結 合 す る も の も 見 出 さ れ て い る ． こ れ ら の 活 性 ペ プ チ ド は 基 底 膜 の 主 成 分 で あ る ラ ミ ニ ン の 複 雑 な 機 能 を 選 択 的 に 再 現 で き る た め ， 基 底 膜 の 機 能 を 模 倣 し た 「 人 工 基 底 膜 」 を 開 発 す る た め の 材 料 と し て 応 用 が 期 待 さ れ る ． ま た ， ラ ミ ニ ン 由 来 の 活 性 ペ プ チ ド を 塩 基 性 高 分 子 多 糖 で あ る キ ト サ ン に 固 定 化 さ せ た ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 が ，細 胞 接 着 を は じ め と す る 生 物 活 性 を 示 し ，細 胞 の 足 場 材 料 と し て 有 用 で あ る こ と も 報 告 さ れ て き た ． 近 年 ， 細 胞 接 着 に お い て イ ン テ グ リ ン と シ ン デ カ ン が 協 調 的 に 働 い て い る こ と や ， シ ン デ カ ン 結 合 ペ プ チ ド が イ ン テ グ リ ン 結 合 タ ン パ ク 質 の 生 物 活 性 を 増 強 さ せ る 「 促 進 剤 」 と し て 機 能 す る こ と な ど が 報 告 さ れ て い る ． こ の よ う な 背 景 か ら 本 申 請 論 文 で は ， 効 率 よ く 細 胞 応 答 を 誘 導 す る イ ン テ リ ジ ェ ン ト 型 培 養 基 材 と し て の ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 の 創 製 を 目 的 に 研 究 を 行 っ た ．第 1 章 で は ， 多 機 能 分 子 の ラ ミ ニ ンα1 鎖 LG4 モ ジ ュ ー ル の 生 物 活 性 を 模 倣 し た 機 能 性 膜 を 作 製 し た ． 第 2 章 で は ， 2 種 類 の シ ン デ カ ン 結 合 ペ プ チ ド と 3 種 類 の イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ チ ド を 組 み 合 わ せ た 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 を 作 製 し 、シ ン デ カ ン と イ ン テ グ リ ン の 相 乗 作 用 を 解 析 し た ． 第 3 章 で は ， ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 の 足 場 効 果 に 着 目 し ， 生 物 学 的 機 能 を 効 率 よ く 誘 導 す る 足 場 材 料 と し て の キ ト サ ン 膜 の 最 適 化 を 行 っ た ． 第 1 章 ラ ミ ニ ンα1 鎖 LG4 モ ジ ュ ー ル の 機 能 を 模 倣 し た 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜1 ) ラ ミ ニ ン α1 鎖 LG4 モ ジ ュ ー ル 由 来 の ， シ ン デ カ ン 結 合 ペ プ チ ド AG73 （ RKRLQVQLSIRT, mouse laminin α1 chain 2719-2730） と α2β1 イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ
チ ド EF1zz
（ ATLQLQEGRLHFXDLGK GR, X: Nle, mouse laminin α1 chain 2749-2767）を 種 々 の 割 合 で 混 合 し て キ ト サ ン 膜 に 固 定 化 さ せ ， シ ン デ カ ン と イ ン テ グ リ ン の 両 レ セ プ タ ー に 作 用 す る 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 を 作 製 し ， HDF の 細 胞 接 着 ，細 胞 伸 展 活 性 を 測 定 し た （ Fig. 1）． 混 合 ペ プ チ ド - キ ト サ ン 膜 の 細 胞 接 着 ， 伸 展 は ， 混 合 比 AG73:EF1zz=1:9 の と き に 最 も 強 い 活 性 を 示 し ，接 着 し た HDF の 形 態 は 組 換 え LG4
タ ン パ ク 質 に 接 着 し た も の と 同 様 で あ っ た ． 次 に EDTA と ヘ パ リ ン の 細 胞 接 着 阻 害 効 果 を 評 価 し た 結 果 ，混 合 比 AG73:EF1zz=1:4 と 1:9 の と き に EDTA と ヘ パ リ ン の 両 方 で 阻 害 さ れ ， そ の 阻 害 効 果 は 組 換 え LG4 タ ン パ ク 質 に 対 す る 接 着 阻 害 と 同 様 で あ っ た ． こ の 結 果 か ら ， 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 （ AG73:EF1zz=1:4, 1:9） は ， 組 換 え LG4 タ ン パ ク 質 と 同 様 に シ ン デ カ ン と イ ン テ グ リ ン の 両 レ セ プ タ ー を 介 し て HDF に 接 着 し て い る こ と が 示 さ れ た ．以 上 の 結 果 よ り ，AG73/EF1zz-キ ト サ ン 膜（ AG73:EF1zz=1:9） は ， シ ン デ カ ン と イ ン テ グ リ ン の 両 レ セ プ タ ー に 同 時 に 作 用 し ， 各 ペ プ チ ド の 活 性 を 相 乗 的 に 増 強 さ せ る こ と に よ っ て 、 多 機 能 分 子 の ラ ミ ニ ンα1 鎖 LG4 モ ジ ュ ー ル の 生 物 活 性 を 模 倣 し た 機 能 性 膜 と な る こ と が 示 さ れ た ． 第 2 章 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 の 生 物 活 性2 ) 2 種 類 の シ ン デ カ ン 結 合 ペ プ チ ド AG73（ シ ン デ カ ン の み に 結 合 ）と C16（ シ ン デ カ ン とβ1 イ ン テ グ リ ン に 結 合 ： KAFDITYVRLKF, mouse laminin γ1 chain 139-150）， 3 種 類 の イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ チ ド EF1zz（α2β1 イ ン テ グ リ ン に 結 合 ），A99a（ αvβ3 イ ン テ グ リ ン に 結 合 ： ALRGDN, mouse laminin α1 chain 1145-1150） と A2G10（ α6β1 イ ン テ グ リ ン に 結 合 ： SYWYRIEASRTG, mouse laminin α2 chain 2223-2234） を キ ト サ ン 膜 に 固 定 化 さ せ ， シ ン デ カ ン と イ ン テ グ リ ン の 両 レ セ プ タ ー に 同 時 に 作 用 す る 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 を 作 製 し ，HDF の 細 胞 接 着 活 性 ，細 胞 伸 展 活 性 を 評 価 し た ．C16 を 混 合 し た と き は A99a の み 活 性 が 増 強 さ れ た が ，AG73 を 混 合 し た と き は 3 種 類 の イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ チ ド の 活 性 が 増 強 さ れ た （ Fig. 2）． AG73 は シ ン デ カ ン の み に 作 用 す る た め ， イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ チ ド と 混 合 す る の に 適 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た ． 次 に ，シ ン デ カ ン -1 を 過 剰 発 現 さ せ イ ン テ グ リ ン を 発 現 し て い な い B-リ ン パ 球 細 胞 を 用 い て 細 胞 接 着 活 性 を 評 価 し た と こ ろ ， AG73-， C16-キ ト サ ン 膜 は 細 胞 接 着 活 性 を 示 し た が ，混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 の 細 胞 接 着 活 性 は 増 強 さ れ な か っ た ．こ の 結 果 は ，相 乗 的 な 活 性 増 強 に は ， シ ン デ カ ン と イ ン テ グ リ ン の 2 種 類 の レ セ プ タ ー に 同 時 に 作 用 す る こ と が 重 要 で あ る こ と を 示 し て い る ． 次 にα6β1 イ ン テ グ リ ン に 結 合 す る A2G10 に 着 目 し ， AG73 と の 最 適 な 混 合 比 を 調 べ た 結 果 ，
A2G10/AG73-キ ト サ ン 膜 （ A2G10:AG73=25:1） は 強 い HDF の 細 胞 接 着 活 性 を 示 し た ． A2G10/AG73 (25:1)-キ ト サ ン 膜 は ，α6β1 イ ン テ グ リ ン の 生 物 学 的 な 機 能 を 解 析 す る た め の ツ ー ル と し て 有 用 で あ り ，ECM を 模 倣 し た バ イ オ マ テ リ ア ル と し て の 応 用 が 期 待 さ れ る ． 第 3 章 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 の 足 場 効 果3 ) 6 種 類 の 異 な る 量 の キ ト サ ン を プ レ ー ト に コ ー ト し （ 1.5-1500 ng/mm2），αvβ3 イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ チ ド A99a と シ ン デ カ ン 結 合 ペ プ チ ド AG73 を 固 定 化 さ せ た ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 を 作 製 し た ． HDFの 細 胞 接 着 活 性 ，細 胞 伸 展 活 性 と PC12 細 胞 の 神 経 突 起 伸 長 活 性 を 測 定 し ， ペ プ チ ド - キ ト サ ン 膜 の キ ト サ ン 量 に よ る 足 場 効 果 を 評 価 し た （ Fig. 3 ）． A99a-キ ト サ ン 膜 の 細 胞 接 着 ，細 胞 伸 展 活 性 ， 細 胞 骨 格 形 成 は キ ト サ ン 量 に 依 存 し ，キ ト サ ン 量 3 ng/mm2の と き に 最 大 と な っ た ．一 方 ， AG73-キ ト サ ン 膜 の 細 胞 接 着 活 性 ，細 胞 伸 展 活 性 は キ ト サ ン 量 に は 依 存 せ ず ， 全 て の キ ト サ ン 量 で 大 き な 変 化 は な か っ た ． 次 に 神 経 突 起 伸 長 活 性 を 評 価 し た 結 果 ，A99a-キ ト サ ン 膜 で は ，キ ト サ ン 量 30 ng/mm2以 上 で 強 い 神 経 突 起 伸 長 活 性 を 示 し た ．一 方 ，AG73-キ ト サ ン 膜 は ，キ ト サ ン 量 で 大 き な 変 化 は な か っ た ． 以 上 の 結 果 よ り ， イ ン テ グ リ ン を 介 す る 生 物 活 性 は 足 場 の 影 響 を 強 く 受 け ， シ ン デ カ ン を 介 す る 生 物 活 性 は 足 場 の 影 響 を 受 け に く い こ と が 示 唆 さ れ た ． ま た ， 混 合 A99a/AG73-キ ト サ ン 膜（ A99a:AG73=9:1）は ，キ ト サ ン 量 が 多 い と き（ 150-1500 ng/mm2） に 効 果 的 に 細 胞 応 答 を 誘 導 す る こ と が 示 さ れ た ． 以 上 よ り ， タ ー ゲ ッ ト と す る 細 胞 や レ セ プ タ ー に 合 わ せ て 足 場 材 料 を 最 適 化 す る こ と が ， 細 胞 応 答 の 効 果 的 な 誘 導 に 重 要 で あ る こ と が 示 さ れ た ． 本 申 請 論 文 で は ， ラ ミ ニ ン 由 来 の レ セ プ タ ー 特 異 的 に 結 合 す る 細 胞 接 着 ペ プ チ ド を キ ト サ ン 膜 に 固 定 化 し ， 足 場 機 能 の 評 価 を 行 っ た ． シ ン デ カ ン 結 合 ペ プ チ ド は ， イ ン テ グ リ ン 結 合 ペ プ チ ド と 混 合 し て キ ト サ ン 膜 に 固 定 化 す る こ と で そ の 生 物 活 性 を 相 乗 的 に 増 強 さ せ る こ と を 見 出 し た ． こ の よ う に 2 種 類 の 異 な る レ セ プ タ ー に 同 時 に 作 用 す る 混 合 ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 は ，各 ペ プ チ ド の 生 物 活 性 を 相 乗 的 に 増 強 さ せ る こ と が で き ，ECM を 模 倣 し た バ イ オ マ テ リ ア ル と し て 有 用 で あ る と 考 え ら れ る ．ま た ，キ ト サ ン 量 に よ る ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 の 足 場 効 果 は ，作 用 す る レ セ プ タ ー に よ っ て 異 な る こ と が 明 ら か に な り ，用 い る ペ プ チ ド の 種 類 に よ っ て ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 を 最 適 化 で
き る こ と が 示 唆 さ れ た ．本 研 究 で 作 製 し た ペ プ チ ド -キ ト サ ン 膜 が ，組 織 に 近 い 環 境 を 提 供 す る イ ン テ リ ジ ェ ン ト 型 培 養 基 材 と し て 組 織 工 学 や 再 生 医 療 な ど の 医 薬 分 野 へ の 応 用 に 役 立 つ こ と が 期 待 さ れ る ．
本 研 究 成 果 の 掲 載
