応用化学専攻森美紗樹 MORI Misaki

(1)

森美紗樹, 1

37 水耕栽培で育てたトマトの根、茎及び葉に取り込まれた Zn の化学形態別分析 Speciation analysis of Zn accumulated in roots,

stems and leaves of tomato cultured in hydroponics

応用化学専攻森美紗樹 MORI Misaki

【緒言】

近年、重金属等に汚染された土壌の浄化技術として、

植物が根から養分を重金属と共に吸収する能力を利用する“ファイトレメディエーション”が注目されている。この技術は低コストで環境に優しいという利点があるが、植物の吸収能力には限度があり、高濃度の汚染地域には不向きであるという欠点がある。この欠点を克服するためには、植物による重金属等の吸収能力を高める技術を開発する必要があり、植物による金属等の取り込みや輸送、蓄積の機構の解明が急務である。

これまでの研究において、植物には、根から有機酸を放出し、根圏に存在する金属と錯体を形成することで金属の無毒化や取り込みの促進を行う機構があることが報告されている

¹⁾

。また、植物体内のポリペプチドが金属と錯体を形成し、液胞等に隔離することで金属の無毒化を行う機構があることも示唆されている。

無毒化を行うとされるポリペプチドは

PCn

(phytochelatin)

であり、

PCn

の

SH

基が金属と結合することで金属を閉じ込め無毒化すると考えられている

2)

。しかし、これらの機構の詳細については、未だ明らかにされてはいない。そこで本研究では、根から取り込まれた金属の化学形態に着目し、植物による金属無毒化機構の解明を目的として研究を行った。

【実験】

植物は、生長が早く水耕栽培が容易であるトマトを用いた。トマトに取り込まれる金属には、植物にとって必須微量元素である Zn、毒性を示すとされる Cd 及び Pb を用いた。

明暗期 12 時間周期、室温 25°C の条件で

14

日間土耕栽培を行った後、生長度合が同程度の個体を 24 株選定し、6 株ずつ 4 群に分けた。それらを、50%

Hoagland

溶液 (生長に必須の栄養素として Zn 25 ng

mL^-1

添加) 及び 50% Hoagland 溶液に Zn 濃度 2.0

g mL^-1

、

Cd

濃度 0.5 g mL

^-1

、

Pb

濃度 0.5 g mL

^-1

となるように金属を添加した 4 種の溶液 (pH 4.8 に調整

)

にそれぞれ浸し、参照群、

Zn

添加群、

Cd

添加群、

Pb

添加群として土耕栽培と同じ条件で 30 日間水耕栽培を行った。

水耕栽培後、根、茎及び葉の 3 部位に分離し、乾燥器にて乾燥させた後、均質化した。粉末試料が

100

倍希釈となるように 30 mM 酢酸アンモニウム (pH 6.5) を加えて

1

時間超音波抽出を行った後、超遠心分離器

にかけ、

0.45 m

シリンジフィルターでろ過した。得

られた抽出液中の

³⁴S, ⁶⁶Zn, ¹¹¹Cd, ²⁰⁸Pb

を、溶離液条件により分離方法が異なる、マルチモードカラム

(Multi)

を用いた

Multi-HPLC-ICPMS

にて測定した。本研究で

は、イオン性相互作用

(アミノ酸やペプチドは pI

値) による分離が可能な

10 mM

酢酸アンモニウム (pH

6.5)

を溶離液として用いた。

Zn

添加群については、Multi-HPLC-ICPMS 測定にて

³⁴S

及び

⁶⁶Zn

が共溶出したピークを分取し、凍結乾燥を行った。その後、分取した試料を親水性や疎水性の性質により分離し、精製するため、逆相カラム

(RP)

を用いた

RP-HPLC-ICP-MS

にて

³⁴S

及び

⁶⁶Zn

を測定した。次に、

³⁴S

及び

⁶⁶Zn

が共溶出したピークを分取し、凍結乾燥した後

ESI-TOFMS

測定を行い、

トマトの根、茎及び葉抽出液中に存在する

³⁴S

及び

66Zn

が共溶出したピークの化学形態の同定を行った。

【結果及び考察】

1. Multi

カラムによる

Zn, Cd, Pb

の化学形態別分析

各群におけるトマトの根、茎及び葉抽出物の

Multi-HPLC-ICPMS

測定結果を図

1

に示した。

(2)

森美紗樹, 2

参照群の根、茎及び葉において、保持時間 1070 秒に

³⁴S

及び

⁶⁶Zn

のピーク U1 が検出された。標品である GSH (glutathione) の

³⁴S

のピークと同じ保持時間であることから、ピーク U1 は GSH の SH 基に

Zn

が結合した GSH-Zn によるものと考えられる。

Zn

添加群の根、茎及び葉では、保持時間 960 秒に

³⁴S

及び

⁶⁶Zn

のピーク

U4

が検出された。標品である PC

2

(phytochelatin 2)

の

³⁴S

のピークと同じ保持時間であることから、ピーク U4 は

PC2

の SH 基に

Zn

が結合した

PC2-Zn

によるものと考えられる。また、参照群では GSH-Zn と考えられるピーク U1 が得られたが、Zn 添加群で検出された PC

2-Zn

と考えられるピーク U

4

に相当するピークは得られなかった。このことから、

Zn

添加群では、トマトの生長に必須である

Zn

が過剰に取り込まれたことで GSH が 2 つ結合した PC

2

が誘導合成され、

PC2-Zn

として錯体を形成することで過剰な Zn を無毒化したと考えられる。また、参照群や Zn 添加群において検出された

⁶⁶Zn

のみのピーク U2, U3 や U5 は、

S

を含まないアミノ酸やペプチド、または有機酸に Zn が結合した化学形態によるものであると考えられる。

Cd

添加群及び Pb 添加群の根、茎及び葉において、

保持時間 960 秒に

³⁴S

及び

¹¹¹Cd

または

²⁰⁸Pb

のピーク U7, U9 が検出された。ピーク U7, U9 は標品である PC

2

の

³⁴S

のピークと同じ保持時間であること

から、PC

2

の SH 基に Cd または Pb が結合した化学形態によるものと考えられる。また、

Cd

添加群及

び

Pb

添加群では、参照群では得られなかった

³⁴S

及

び

¹¹¹Cd

または

²⁰⁸Pb

のピーク (U7 及び U9) が検出された。このことから、

Cd

や

Pb

が取り込まれたことによって GSH が 2 つ結合した PC

2

が誘導合成され、

Cd

や Pb を SH 基でキレートすることで無毒化したと考えられる。また、

Cd

添加群の根において検出された

¹¹¹Cd

のみのピーク

U6

は、

S

を含まないアミノ酸やペプチド、または有機酸に

Cd

が結合した化学形態によるものであると考えられる。また、

Pb

添加群において検出された

²⁰⁸Pb

のみのピーク

U8, U10

は、

S

を含まないアミノ酸やペプチド、または有機酸に Pb が結合した化学形態によるものであると考えられる。

2. ESI-TOFMS

測定による Zn の化学形態の同定

Zn

添加群において、Multi-HPLC-ICPMS 測定により得られた

³⁴S

及び

⁶⁶Zn

の共溶出ピーク U4 の詳しい化学形態を調べるため、

Multi

カラム及び

RP

カラムを用いて分取を行い

ESI-TOFMS

測定を行った。

理論値と実験値との比較 ( [ppm]≦50) から、ピーク

U4

は PC

2

の 2 つの SH 基に Zn が結合し錯体となった

PC2-Zn

によるものであることがわかった。

【結論】

Zn

はトマトの生長において必須の元素であるが、

過剰に取り込まれた場合には PC

2-Zn

として Zn をキレートし、無毒化することがわかった。

トマトは、

Cd

や

Pb

を取り込むと

PC2

を誘導合成し、過剰な

Zn

と同様に

SH

基と結合して無毒化することが示唆された。

【参考文献】

1) Jones, D. L. Plant and Soil, 1998, 205, 25-44.

2) Heldt, H. W. et al. Plant Biochem. 2011, 4, 323-335.

【対外発表リスト】

1)

森美紗樹

,

中澤隆, 古田直紀: 第

75

回分析化学討論会, 2015, 山梨, 口頭発表.

図

1

各群における抽出物の

Multi-HPLC-ICPMS 測定結果 (a) 参照群、(b) Zn 添加群、(c) Cd 添加群、(d) Pb

添加群

U₅

34S 強度 [count]0

0 ⁶⁶ Zn 強度 [count]

U₄

0

34S 強度 [count]

0

34S 強度 [count]

500 2500

2000 (b) Zn 添加群 10000

根

(b) Zn 添加群茎

(b) Zn 添加群葉

34S

66Zn

34S

66Zn

34S

66Zn

34S 強度 [count]

PC₃ PC₂GSH 標品

10 ppm

0 500

34S 強度 [count]

PC₃ PC₂GSH 標品

10 ppm

0 500

U₂ U₃

34S 強度 [count]0

U₁

2000 10000

0

34S 強度 [count]

500 2500

0

34S 強度 [count]

500 2500

(a)参照群根

(a)参照群茎

(a)参照群葉

34S

66Zn

34S

66Zn

34S

66Zn

0

34S 強度 [count]

0 111Cd 強度 [count]

U₆U₇

0 0

34S 強度 [count] 111Cd 強度 [count]

0 0

34S 強度 [count] 111Cd 強度 [count]

250 500

1000 (c) Cd 添加群 2000

根

(c) Cd 添加群茎

(c) Cd 添加群葉

34S

111Cd

34S

111Cd

34S

111Cd

保持時間[sec]

0 600 1200 1800

U₈ U₁₀

0 0

34S 強度 [count] 208Pb 強度 [count]

U₉

0 0

500 500

2000 2000

1000 1000

(d) Pb添加群根

(d) Pb添加群茎

(d) Pb添加群葉

34S

208Pb

34S

208Pb

34S

208Pb

保持時間[sec]

0 600 1200 1800

応用化学専攻 森 美紗樹 MORI Misaki

森 美紗樹, 1

37

水耕栽培で育てたトマトの根、茎及び葉に取り込まれた Zn の化学形態別分析 Speciation analysis of Zn accumulated in roots,

stems and leaves of tomato cultured in hydroponics

応用化学専攻 森 美紗樹 MORI Misaki

【緒言】

近年、 重金属等に汚染された土壌の浄化技術として、

これまでの研究において、植物には、根から有機酸 を放出し、根圏に存在する金属と錯体を形成すること で金属の無毒化や取り込みの促進を行う機構があるこ とが報告されている

。また、植物体内のポリペプチ ドが金属と錯体を形成し、液胞等に隔離することで金 属の無毒化を行う機構があることも示唆されている。

無 毒 化 を 行 う と さ れ る ポ リ ペ プ チ ド は

であり、

の

基が金属と結合す ることで金属を閉じ込め無毒化すると考えられている

。しかし、これらの機構の詳細については、未だ明 らかにされてはいない。そこで本研究では、根から取 り込まれた金属の化学形態に着目し、植物による金属 無毒化機構の解明を目的として研究を行った。

【実験】

植物は、生長が早く水耕栽培が容易であるトマトを 用いた。トマトに取り込まれる金属には、植物にとっ て必須微量元素である Zn、毒性を示すとされる Cd 及び Pb を用いた。

明暗期 12 時間周期、室温 25°C の条件で

日間 土耕栽培を行った後、生長度合が同程度の個体を 24 株選定し、6 株ずつ 4 群に分けた。それらを、50%

溶液 (生長に必須の栄養素として Zn 25 ng

添加) 及び 50% Hoagland 溶液に Zn 濃度 2.0

、

濃度 0.5 g mL

、

濃度 0.5 g mL

と なるように金属を添加した 4 種の溶液 (pH 4.8 に調 整

にそれぞれ浸し、参照群、

添加群、

添加群、

添加群として土耕栽培と同じ条件で 30 日間水耕 栽培を行った。

水耕栽培後、根、茎及び葉の 3 部位に分離し、乾燥 器にて乾燥させた後、均質化した。粉末試料が

倍 希釈となるように 30 mM 酢酸アンモニウム (pH 6.5) を加えて

時間超音波抽出を行った後、 超遠心分離器

にかけ、

シリンジフィルターでろ過した。得

られた抽出液中の

を、溶離液条件 により分離方法が異なる、マルチモードカラム

を用いた

にて測定した。 本研究で

は、イオン性相互作用

値) による分離が可能な

酢酸アンモニウム (pH

を溶離液として用いた。

添加群については、Multi-HPLC-ICPMS 測定に て

及び

が共溶出したピークを分取し、凍結 乾燥を行った。その後、分取した試料を親水性や疎水 性の性質により分離し、精製するため、逆相カラム

を用いた

にて

及び

を測定した。次に、

及び

が共溶出したピーク を分取し、凍結乾燥した後

測定を行い、

トマトの根、茎及び葉抽出液中に存在する

及び

が共溶出したピークの化学形態の同定を行った。

【結果及び考察】

カラムによる

の化学形態別分析

各群におけるトマトの根、茎及び葉抽出物の

測定結果を図

に示した。

森 美紗樹, 2

参照群の根、茎及び葉において、保持時間 1070 秒 に

及び

のピーク U1 が検出された。標品で ある GSH (glutathione) の

のピークと同じ保持時 間であることから、ピーク U1 は GSH の SH 基に

が結合した GSH-Zn によるものと考えられる。

添加群の根、茎及び葉では、保持時間 960 秒に

及 び

のピーク

が検出された。標品である PC

の

のピークと同じ保持時間であ ることから、ピーク U4 は

の SH 基に

が結 合した

によるものと考えられる。また、参照 群では GSH-Zn と考えられるピーク U1 が得られた が、Zn 添加群で検出された PC

と考えられるピ ーク U

に相当するピークは得られなかった。このこ とから、

添加群では、トマトの生長に必須である

応用化学専攻森美紗樹 MORI Misaki

森美紗樹, 1

応用化学専攻森美紗樹 MORI Misaki

近年、重金属等に汚染された土壌の浄化技術として、

これまでの研究において、植物には、根から有機酸を放出し、根圏に存在する金属と錯体を形成することで金属の無毒化や取り込みの促進を行う機構があることが報告されている

。また、植物体内のポリペプチドが金属と錯体を形成し、液胞等に隔離することで金属の無毒化を行う機構があることも示唆されている。

無毒化を行うとされるポリペプチドは

基が金属と結合することで金属を閉じ込め無毒化すると考えられている

。しかし、これらの機構の詳細については、未だ明らかにされてはいない。そこで本研究では、根から取り込まれた金属の化学形態に着目し、植物による金属無毒化機構の解明を目的として研究を行った。

植物は、生長が早く水耕栽培が容易であるトマトを用いた。トマトに取り込まれる金属には、植物にとって必須微量元素である Zn、毒性を示すとされる Cd 及び Pb を用いた。

日間土耕栽培を行った後、生長度合が同程度の個体を 24 株選定し、6 株ずつ 4 群に分けた。それらを、50%

となるように金属を添加した 4 種の溶液 (pH 4.8 に調整

添加群として土耕栽培と同じ条件で 30 日間水耕栽培を行った。

水耕栽培後、根、茎及び葉の 3 部位に分離し、乾燥器にて乾燥させた後、均質化した。粉末試料が

倍希釈となるように 30 mM 酢酸アンモニウム (pH 6.5) を加えて

時間超音波抽出を行った後、超遠心分離器

を、溶離液条件により分離方法が異なる、マルチモードカラム

にて測定した。本研究で

添加群については、Multi-HPLC-ICPMS 測定にて

が共溶出したピークを分取し、凍結乾燥を行った。その後、分取した試料を親水性や疎水性の性質により分離し、精製するため、逆相カラム

が共溶出したピークを分取し、凍結乾燥した後

森美紗樹, 2

参照群の根、茎及び葉において、保持時間 1070 秒に

のピーク U1 が検出された。標品である GSH (glutathione) の

のピークと同じ保持時間であることから、ピーク U1 は GSH の SH 基に

及び

のピークと同じ保持時間であることから、ピーク U4 は

が結合した

によるものと考えられる。また、参照群では GSH-Zn と考えられるピーク U1 が得られたが、Zn 添加群で検出された PC

と考えられるピーク U

に相当するピークは得られなかった。このことから、

が過剰に取り込まれたことで GSH が 2 つ結合した PC

として錯体を形成することで過剰な Zn を無毒化したと考えられる。また、参照群や Zn 添加群において検出された

のみのピーク U2, U3 や U5 は、

を含まないアミノ酸やペプチド、または有機酸に Zn が結合した化学形態によるものであると考えられる。

のピーク U7, U9 が検出された。ピーク U7, U9 は標品である PC

の SH 基に Cd または Pb が結合した化学形態によるものと考えられる。また、

のピーク (U7 及び U9) が検出された。このことから、

が取り込まれたことによって GSH が 2 つ結合した PC

が誘導合成され、

や Pb を SH 基でキレートすることで無毒化したと考えられる。また、

添加群の根において検出された

を含まないアミノ酸やペプチド、または有機酸に

が結合した化学形態によるものであると考えられる。また、

添加群において検出された

を含まないアミノ酸やペプチド、または有機酸に Pb が結合した化学形態によるものであると考えられる。

添加群において、Multi-HPLC-ICPMS 測定により得られた

の共溶出ピーク U4 の詳しい化学形態を調べるため、

カラムを用いて分取を行い

の 2 つの SH 基に Zn が結合し錯体となった

として Zn をキレートし、無毒化することがわかった。

を誘導合成し、過剰な

基と結合して無毒化することが示唆された。

森美紗樹

中澤隆, 古田直紀: 第

回分析化学討論会, 2015, 山梨, 口頭発表.