インターフェロン誘発性抑うつモデルラットにおける海馬神経細胞新生に対するミルナシプランの効果

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(1)脳と精神の医学第 20 巻第 4 号 2009 年. 355. Research Report 355-362. インターフェロン誘発性抑うつモデルラットにおける海馬神経細胞新生に対するミルナシプランの効果竹本恵子 1），大山建司 1），工藤耕太郎 2），神庭重信 3）要約：本研究は，hIFNα慢性投与によるうつ状態のモデルラットを用いて，hIFNα慢性投与によるうつ状態の発症とミルナシプラン投与による改善の行動及び海馬の神経細胞新生の役割を検討した。強制水泳試験とテールサスペンション試験においては， hIFNα単独投与によって無動時間の延長がみられ，この延長は hIFNα・ミルナシプラン同時投与によって消失した。海馬歯状回の新生神経細胞の数は hIFNα単独投与群では対照群と比較して有意に減少していた。このような新生神経細胞数の減少は hIFN α・ミルナシプラン同時投与群では認めなかった。この結果，hIFNα慢性投与による海馬神経細胞新生の減少を阻止するのに抗うつ薬が有効であることが明らかとなった。これは，hIFNα療法の有害作用であるうつ状態の発症および，ミルナシプランによる症状改善において海馬の神経細胞新生が関与する可能性を示唆している。脳と精神の医学 20（4）： 355-362, 2009 Key words ： interferonα, milnacipran, neurogenesis, depression, hippocampus. １．緒言インターフェロン（hIFN）はサイトカインの一種で，分子量 2 万前後のタンパク質であり，大きく分けてα，β，γの 3 つに分類することができる。α，βは抗ウイルス作用が強く，γは抗腫瘍作用が強いため，hIFN 療法は慢性ウイルス感染や悪性疾患に用いられ，本邦でも B 型肝炎，C 型肝炎など使用頻度は高い。それに伴い hIFN 療法の有害作用が注目されるようになり，中枢神経. 系，呼吸器系，循環器系，泌尿器系に対する有害作用が報告され 1）2），なかでも傾眠，知覚異常，精神運動障害，幻覚，抑うつ状態などの精神症状の発現率は高く hIFN 療法中止の一番の理由となっている。hIFN の中でも特にαは他の hIFN に比べ中枢神経系への有害作用である精神障害を引き起こしやすいことが報告されており 2 ） 3 ） 4 ）， hIFNαによる行動変化の影響はヒトだけではなくラットやマウスにおいても報告されている。動物を使った強制水泳試験やテールサスペンション試験はうつ状態の行動スクリーニング検査として. Effect of milnacipran on hippocampal neurogenesis in interferon α-induced depression model rats １）山梨大学大学院医学工学総合研究部〔〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110〕Keiko Takemoto, Kenji Ohyama ： Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering, University of Yamanashi 1110, Shimokato, Cyuo-city, Yamanashi, 409-3898 Japan ２）横浜相原病院精神科 Kotaro Kudo ： Department of Psychiatry, Yokohama Aihara Hospital ３）九州大学大学院医学研究院精神病態医学 Shigenobu Kanba ： Department of Neuropsychiatry Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University.

(2) 356. Brain Science and Mental Disorders Vol.20, No.4, 2009. 有用であり，これらの試験において自発運動量の変化なしに無動時間が延長した動物はうつ状態のモデル動物と考えられている。この無動時間の延長が，マウスに hIFNαを 1 週間連続投与することによって，またラットに hIFNαを慢性投与することによって認められる。 hIFNαによる精神障害の発症機序は，β-エンドルフィン系を刺激することによって精神障害を発症させるという説の他に，ドパミン系を介する説，サイトカインを介する説が提唱され，低濃度ではあるが，血液脳関門の働きが不十分と思われる第 3 脳室前壁近傍などから中枢神経系に hIFN の移行が確認されている。また末梢において IFN は構造が類似した ACTH として作用し，コルチゾール分泌促進を介して精神症状を発症させるという説も挙げられている。MRI で海馬の容積の減少がうつ病の罹病期間と相関すること，抗うつ薬が海馬における神経細胞新生を促進することから，うつ病は海馬の神経可塑性，特に神経細胞新生の障害と関係し，うつ病の抑うつ感情や仮性痴呆のような認知的障害などは一部，海馬の機能障害によるものと考えられ，この内因性うつ病と同様に，hIFNαの中枢神経系への有害作用の一部も海馬の変化によって生じる可能性がある。しかし，この可能性を，特に海馬の神経細胞新生に焦点を絞り，実験動物を使って調べた研究はまだ報告されていない。 hIFN 療法による精神症状の治療には，hIFN の減量，中止および種類の変更，薬物療法，心理社会的アプローチが挙げられる。一般的には抑うつ状態の出現とともに hIFN 療法を中止または減量することが望ましいとされているが，hIFN の対象疾患は他に有効な治療法がないことが多く，また C 型肝炎の hIFN 療法では減量や中断によってそれまで蓄積された効果すべてが無効になってしまうため，抗うつ薬による薬物療法の併用によりコントロールしながら治療を続けていくことが一般的である。Musselman らは，hIFN 投与開始 2 週間前からパロキセチンを予防投与した群と対照群で，大うつ病性障害（以下うつ病）の診断基準を満たした割合を比較しており，パロキセチンの予防投与によってうつ状態の発生率が低下したこ. とを報告している 5）。このような抗うつ薬の効果はヒトだけではなく，動物においても見られている。Makino らは，マウスに hIFNαとイミプラミン，ミアンセリンをそれぞれ強制水泳実験 15 及び，30 分前に同時投与し，無動時間に関して対照群との間に差を認めず，hIFNαの影響を抑制する結果を得ている 6）。しかし，これは急性投与実験であり，慢性投与実験において hIFNα誘発性うつ状態に対する抗うつ薬の有効性を調べた実験は報告されていない。また，hIFN 療法の必要な肝機能障害を持つ患者において肝臓で代謝する抗うつ薬の使用は困難な場合がある。この点に関して，肝臓のミクロゾーム代謝経路を経由しないことから薬物相互作用も少なく，腎臓から排泄される薬剤である抗うつ薬の，セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（SNRI）のミルナシプランは，hIFN の治療を受けている C 型肝炎の患者にも使用しやすいと考えられる。しかし，ミルナシプランは治療に用いられるようになってから間もないこともあり，IFN 療法に対し効果を示す症例があるものの作用機序の研究報告はない。我々の予備実験では，ミルナシプランの単独投与により強制水泳の無働時間を短縮させる結果を得ている。そこで本研究は，ラットへ hIFNαを慢性投与してうつ状態のモデル動物を作成し，ミルナシプランの行動面に対する効果を調べ，さらに，hIFNαの慢性投与によるうつ状態の発症と，ミルナシプランによる回復に海馬の神経細胞新生が関係しているか否かを調べた。. ２．対象と方法１．実験動物及び飼育条件実験には，8 週齢の Wistar/ST ラットの雄を用いた（SLC Japan，体重 260−290g）。ラットは，室内の温度 22 ± 2 ℃，照明条件は点灯 6 時，消灯 18 時の 12 時間の明暗サイクル，餌と水は自由に摂取できる環境で飼育した。自発運動量，強制水泳試験，テールサスペンション試験の行動実験に用いたラットは，1 群 7 匹づつで，対照群， IFN 単独投与群，IFN ・ミルナシプラン同時投与.

(3) 脳と精神の医学第 20 巻第 4 号 2009 年. 357. 群の 3 群で行った。すべてのラットは個別飼育し，を観察した。行動はビデオに記録し，後日解析を行った。水の外に顔を出すために必要な動き以外飲水量，食餌量，体重を毎日測定した。また，海は見られない，浮いている状態を無動と定義した。馬内の神経新生やセロトニン，ノルアドレナリン代謝率の実験に用いたラットは，1 ケージ 3 匹の（３）テールサスペンション試験ラットの尻尾に粘着力の強いテープを巻き，高集団飼育を行った。すべてのラットは搬入後山梨さ 150cm からつり下げた。テストは 6 分間行い，大学動物実験センターで飼育され，順応期間 1 週その間の無動時間を測定した。行動はビデオに記間の後，実験に用いた。本実験は山梨大学動物実録し，後日解析を行った。ここでの無動は，尻尾験委員会の承認を得て行った。からつり下げられた状態でまったく動かないことを指し，前肢で尻尾につかまり動かない状態は無２．薬物投与動には含めなかった。 hIFNα（住友製薬）は，投与直前に 0.9 ％食塩水に溶解し腹腔内投与した。投与量は，強制水泳試験，テールサスペンション試験での無動時間が有意に延長し，自発運動量には影響が見られない 500,000IU/kg とした。ミルナシプラン（旭化成）は，蒸留水に溶解し経口投与をした。投与量は， Mochizuki ら 7）の報告を参考に，強制水泳試験の無動時間が有意に短縮される 60mg/kg とした。投与方法は，ミルナシプランを 1 週間連続で先行投与した後，hIFNαとミルナシプランを 1 週間同時投与した。それぞれの対照群には，0.9 ％食塩水，蒸留水を上記と同様の方法で投与した。これら薬物の最終投与は，慢性投与における影響をみるため，すべての実験において実験開始 24 時間前に行った。. ４．BrdU 免疫染色ミルナシプランと hIFNαの最終投与日に， bromodeoxyuridine（BrdU，200mg/kg）をラットの腹腔内に 6 時間おきに 4 回投与した。ミルナシプランと hIFNαの最終投与 24 時間後に心臓還流固定を行い，固定後ラットの脳をすばやく取り出し，−80 ℃で凍結させた。凍結した脳から， Paxinos と Watson の脳地図 9）を参考にして 40μm. の厚さの前額断面切片を作成した。染色には 200 μｍ間隔の 10 枚の切片を使用した。脳の切片は， DNA の変性を行うために 2 × saline sodium citrate（SSC）で処理し，50 ％ホルムアミドに 30 分間，65 ℃でインキュベーションした。次に， 2N 塩酸に 37 ℃で 30 分インキュベーションし，内因性ペルオキシダーゼをブロックするために３．行動実験 3 ％過酸化水素水に 10 分間インキュベーションし（１）自発運動量た。その後 10 ％ウサギ血清に 30 分間インキュベ自発運動量の測定は，強制水泳試験の前日に行ーションし，抗 BrdU 抗体（1000 倍希釈，った。ラットをケージごと実験室に運び，ケージ Exalpha AP205P）にて 4 ℃で 24 時間インキュベの上部 30cm に実験動物用自発運動量センサーーションした。翌日，ビオチン化抗羊 IgG の 2 次（NS-AS01，ニューロサイエンス）を設置し，放抗体に 1 時間インキュベーションした後，アビジ射状に照射される赤外線によって自発運動量を測ン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体によって定した。5 分ごとの自発運動量を求め，計 1 時間増幅させ，3, 3’-diaminobenzidine で発色させた。記録した。染色切片は 400 倍あるいは 1000 倍に拡大して，（２）強制水泳試験 8） BrdU 陽性細胞を同定し，核内に BrdU 陽性像を強制水泳試験は，Porsolt らの方法を一部変示し，焦点平面の合う細胞のみを数えた。1 匹当更して行った。直径 18cm，高さ 60cm の透明のプラスチック容器に，深さ 25cm まで水を入れ，たり 10 ∼ 12 枚の切片における海馬傍歯状回と海ラットの尻尾のみが底についている状態にした。馬門に観察される BrdU 陽性細胞を計測対象とし，BrdU 陽性細胞数を歯状回面積で除した値水温は 25 ℃，1 匹ごとに水は交換した。テストは 6 分間水の中にラットを入れ，その間の無動時間（細胞数/mm2）を BrdU 陽性細胞数とした。.

(4) 358. Brain Science and Mental Disorders Vol.20, No.4, 2009. 図１薬物慢性投与後の強制水泳試験での無動時間強制水泳試験は薬物最終投与の 24 時間後に行い，無動時間を測定した。各値は平均値±標準誤差で示す。分析は one way ANOVA を用い，post hoc test には Bonferroni/Dunn の検定を用いた。＊ P ＜ 0.05. ５．カテコールアミン分析３．結果ミルナシプランと hIFNαの最終投与 24 時間後に無麻酔下で断頭を行い，すばやくラットの脳か１．自発運動量ら海馬を取り出し，ドライアイスで凍結させた。 hIFNα単独投与群においても，hIFNα・ミル株式会社 SRL に測定を依頼し high-pressure liqナシプラン同時投与群においても 1 時間の自発運 uid chromatography 法でセロトニン，5-hydrox動量に対照群と差を認めなかった。 yindoleacetic acid（5HIAA），ノルアドレナリン， 3-methoxy-4-hydroxy-phenylethyleneglycol ２．強制水泳試験（MHPG）の定量を行った。セロトニンの代謝回 hIFNα単独投与群は対照群より無動時間が約 2 転率は 5HIAA/セロトニンの比として，ノルアド倍程度有意に延長した（F2,14 ＝ 7.803，P<0.05）レナリンの代謝回転率は MHPG/ノルアドレナリ（図１）。hIFNα・ミルナシプラン同時投与によンの比として求めた。って，hIFNα単独投与後の無動時間の延長が有意に抑制され（P<0.05），hIFNα・ミルナシプラ６．分析方法ン同時投与群と対照群の間では無動時間に有意差統計処理ソフト Stat View を用いて，統計処理は認められなかった。を行った。自発運動量実験の 3 群の比較には Repeated measures ANOVA を用いた。強制水泳３．テールサスペンション試験試験，テールサスペンション試験，BrdU 陽性神 hIFNα単独投与群では対照群より無動時間が経細胞数，セロトニン，5HIAA，ノルアドレナリ約 2 倍程度有意に延長した（F2,18 ＝ 6.089，ン，MHPG 含有量，セロトニン及びノルアドレナ P<0.05）（図２）。hIFNα・ミルナシプラン同時リン代謝回転率に関するラット 3 群の比較には投与群では無動時間が hIFN α単独投与群の約 one way ANOVA を用い，post hoc test には 70 ％のレベルにまで低下したが，強制水泳試験の Bonferroni/Dunn の検定を用いた。危険率 P ＜結果とは異なり，hIFNα・ミルナシプラン同時 0.05 を有意とした。図は平均値±標準誤差で示し投与群と hIFNα単独投与群の間では無動時間にた。有意差は認められなかった（P>0.05）。.

(5) 脳と精神の医学第 20 巻第 4 号 2009 年. 359. 図２薬物慢性投与後のテールサスペンション試験での無動時間テールサスペンション試験は薬物最終投与の 24 時間後に行い，無動時間を測定した。各値は平均値±標準誤差で示す。分析は one way ANOVA を用い，post hoc test には Bonferroni/Dunn の検定を用いた。＊ P ＜ 0.05. 図３薬物慢性投与後のラット海馬歯状回における BrdU 陽性細胞数 BrdU 免疫染色を行った後，海馬傍歯状回および海馬門の増殖層に存在する BrdU 陽性細胞数（細胞数/mm2）を測定した。各値は平均値±標準誤差で示す。分析は one way ANOVA を用い，post hoc test には Bonferroni/Dunn の検定を用いた。＊ P ＜ 0.05. ４．海馬傍歯状回の BrdU 陽性細胞数 BrdU 投与後，海馬傍歯状回および海馬門の増殖層に BrdU 陽性細胞が散在するのが観察された。顕微鏡観察下においても，hIFNα単独投与によって BrdU 陽性細胞数が減少し，この減少が hIFNα・ミルナシプラン同時投与によって増加する傾向がわかった。BrdU 陽性細胞を数えて定量解析した結果，hIFNα単独投与群では対照群より BrdU 陽性細胞数が約 30%程度有意に減少し. ていた（F2,15 ＝ 8.765，P<0.05）（図３）。この hIFNα投与による BrdU 陽性細胞数の減少はミルナシプラン投与によって回復し（P<0.05），hIFN α・ミルナシプラン同時投与群では対照群と BrdU 陽性細胞数に有意差はみられなかった（P>0.05）。５．海馬組織内のセロトニン，ノルアドレナリンの含有量および代謝回転率 hIFNα単独投与群においても，hIFNα・ミル.

(6) 360. Brain Science and Mental Disorders Vol.20, No.4, 2009. ナシプラン同時投与群においても海馬組織内のセロトニン含有量に対照群との有意差を認めず，セロトニンの代謝産物である 5HIAA 含有量においても対照群との有意差を認めなかった（P>0.05）。また，セロトニン代謝回転率を示す 5HIAA/セロトニン比も，統計学的に有意差はなかった（P>0.05）。ノルアドレナリンにおいても同様で， 3 群間に有意差を認めなかった（P>0.05）。. ４．考察 hIFN は，1992 年に C 型慢性活動性肝炎への使用が保険適用となって以来，その使用頻度が急増し，その結果 hIFN の有害作用としての精神症状が特に注目されるようになったが，その発生機序はいまだ解明されていない。そこで今回我々は， hIFNα投与による抑うつモデルラットを使用して，hIFNαによる抑うつ状態の発症機序及び，これに対する抗うつ薬の作用機序を明らかにすることをめざした。行動実験において，強制水泳試験，テールサスペンション試験ともに hIFNαの投与によって無動時間が増加し，この増加はミルナシプランで抑制された。海馬歯状回における神経細胞新生に関しても同様に hIFNαの投与によって BrdU 陽性細胞数が減少し，この減少はミルナシプランで抑制された。セロトニン，ノルアドレナリンの含有量および代謝回転率は hIFNα単独投与及びミルナシプラン同時投与によって変化しなかった。近年，うつ病の治療の第一選択薬として SSRI が使用されることが多い。しかし，腎臓で排泄され，重度の抑うつ症状に対して効果があり，抗コリン性の有害作用が少なく，安全性，有効性の面からも優れた抗うつ薬 SNRI であるミルナシプランは，C 型肝炎患者にみられる hIFNαの有害作用に対処する薬剤として処方しやすい薬と考えられる。そこで，hIFNαによる強制水泳試験，テールサスペンション試験の無動時間の延長に対する効果を調べるために，今回，ミルナシプランを使用した。今日用いられている多くの抗うつ薬は，臨床効果の発現までに投薬してから数週間を要する。このため本研究においても，ミルナシプラン. を 1 週間連続で先行投与した後，hIFNαとミルナシプランを 1 週間同時投与することによって慢性的効果を調べた。 hIFNαによる抑うつ症状は実験動物でモデル化されている。ラット及びマウスでは hIFNαを 1 週間投与することによって，強制水泳試験の無動時間が延長する。Makino らは，このような動物モデルを使ってイミプラミン及びミアンセリンの急性投与の効果を調べ，これらの抗うつ薬が hIFNαによる無動時間の延長を消失させるのに有効であることを報告している 6）。本研究においてもミルナシプランを使うことによって同様の結果が得られ，hIFNαの行動変化の改善にこのミルナシプランが有効であることが示された。 Makino らの研究は，急性投与の実験である上，イミプラミンは抗コリン作用も強くまた肝臓で代謝される薬物であることから，hIFNα療法を受ける患者には使用の難しい薬剤である。ヒトにおける hIFNαの有害作用である抑うつ状態には 2 週間以上の抗うつ薬の慢性投与が有効であり，特に C 型肝炎などで IFN 治療を行っている患者は従来の肝臓代謝型抗うつ薬では治療が困難であることを考慮すると，肝臓で代謝されず腎臓で排泄されるミルナシプランは臨床の場において有用性が高いと考えられる。 BrdU は DNA 合成時に取り込まれるチミジンの誘導体で，抗 BrdU 抗体で染色することによって増殖している細胞を検出することができる。金子らの報告 10）で，海馬傍顆粒層での BrdU 陽性細胞の約 80 ％が神経細胞マーカーである NeuN で染色されること，また BrdU 陽性細胞数の変化が神経細胞新生の変化と一致することを確認しており，今回認められた，hIFNαを 1 週間慢性投与したラットの海馬の BrdU 陽性細胞数の変化は神経細胞新生の変化と相関するものと考えられる。 hIFNα単独投与群では，対照群より BrdU 陽性細胞数の有意な減少が見られたという本研究結果は，海馬の神経細胞新生が hIFNαによって抑制されることを示している。さらに，hIFNαの投与による行動面での変化を抑制するのに有効であったミルナシプラン投与が，hIFNαによる海馬の新生神経細胞の減少も抑制することが明らかと.

(7) 脳と精神の医学第 20 巻第 4 号 2009 年. なった。このような，hIFNα投与時及びミルナシプラン投与時において，行動面での指標と海馬の神経細胞新生が相関して変化したという結果は，抑うつ状態発症と海馬の機能が密接に関係していることを示唆している。海馬の神経細胞新生が，様々な外的要因によって影響を受けることはよく知られており，海馬の神経細胞新生を促進する因子として抗うつ薬投与などが挙げられる。実際，Malberg ら 11）はラットに 2 週間フルオキセチンを慢性投与し，また Santarelli ら 12）はラットに 4 週間イミプラミンを慢性投与し，海馬での神経細胞が増殖していることを報告している。今日用いられている多くの抗うつ薬は，従来考えられていた，シナプス間隙のセロトニン，ノルアドレナリンを増加させる急性的作用よりむしろ，海馬の神経細胞の増殖などに対する慢性的作用によって効果を現すことが考えられ，海馬の神経細胞新生説が注目されている。本研究結果もこの海馬神経細胞新生説を支持するものと考えられる。海馬の神経細胞新生に影響を及ぼす内的要因としては，セロトニンやノルアドレナリンなどのモノアミンが挙げられる。特に今回用いた抗うつ薬であるミルナシプランはセロトニン，ノルアドレナリン再取り込み阻害薬であるため，これらモノアミンを介して海馬の神経細胞新生の変化が起きた可能性がある。この可能性を調べるために，我々は，海馬のセロトニン，ノルアドレナリンの含有量および代謝回転率を測定した。しかし，3 群間で有意な差は認められなかった。海馬の神経細胞新生に変化を認めたにも関わらず，セロトニン，ノルアドレナリンに有意差が見られなかった理由として，第一に，セロトニン，ノルアドレナリンの測定のためのサンプル採取方法が挙げられる。今回，海馬全体組織を用いてセロトニン，ノルアドレナリン量を測定しているが，海馬の神経細胞新生に影響する抗うつ薬は，シナプス間隙のモノアミンの量が高まることによって作用するため，シナプス間隙におけるセロトニン，ノルアドレナリン量を反映させる採取方法が好ましい。例えば，細胞外液中の物質動態をモニタリングするマイクロダイアリシス法では，より正確にシナプ. 361. ス間隙のモノアミン量の測定が可能である。事実，マイクロダイアリシス法を用いたモノアミン測定の実験では，ミルナシプランと同様の作用を持つ Venlafaxine 13）やイミプラミン，デシプラミン 14）の急性投与によって海馬のモノアミン量が変化するといった報告や，パロキセチンの慢性投与により海馬のモノアミン量が変化するといった報告 15）もある。そのため，マイクロダイアリシス法により測定を行えば，今回の実験においてセロトニン，ノルアドレナリン量にも明確な差が見られたかもしれない。また第二の理由としては，今回調べた海馬以外の脳部位，特に縫線核などでモノアミンの変化が生じている可能性があげられる。hIFN αをラットの脳室内に投与すると用量依存性に前頭葉のセロトニン，ノルアドレナリン量が低下する 16）という報告，マウスへの IFNαの 10 日間連続投与後に中脳，海馬におけるセロトニンの著しい増加とノルアドレナリンの中脳，延髄，小脳における著明な減少，海馬での増加がみられたという報告 17）もあり，海馬以外の場所において hIFN αが作用し神経細胞新生に影響を与えている可能性は否定できない。今後さらに詳しく，IFNαとミルナシプランそれぞれが，海馬の神経新生にどのような経路で変化を起こしているか調べていく必要がある。文献 1） Quesada JR, Talpaz M, Rios A, et al（1986） Clinical toxicity of interferon in cancer patients;a review. J Clin Oncol, 4 ： 234-243. 2） Vial T, Descotes J（1994）Clinical toxicity of the interferons. Drug Safety, 10 ： 115-150. 3） Bocci V（1994）Pharmacology and side-effects of interferons. Antiviral Res, 24 ： 111-119. 4）高木州一郎（1995）インターフェロン療法中の精神症状. 精神医学, 37 ： 344-358. 5） Musselman DL, Lawson DH, Gumnick JF, et al （2001）Paroxetine for the prevention of depression induced by high-dose interferon alpha. N Engl J Med, 344 ： 961-966. 6） Makino M, Kitano Y, Hirohashi M, et al（1998） Enhancement of immobility in mouse forced swimming test by treatment with human inter-.

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