原 著
シリアンハムスターの体温調節における
脳内硫化水素とその産生経路の役割
The role of brain hydrogen sulfide (H2S) in the thermoregulation of Syrian hamsters 渡邊 わたなべ 正知ま さ と も1) 門田も ん で ん麻ま由子ゆ こ1) 田村た む らゆたか豊1) 1) 福山大学 薬学部 （連絡先） 〒729-0292 広島県福山市学園町一番地三蔵 福山大学薬学部 渡邊正知 Key words: 低体温、硫化水素、シスタチオニンβ-シンターゼ 抄録 背景・目的 硫化水素 (H2S) は脳内で産生され、神経調節物質として機能するこ とが報告されている。さらに、外因性の H2S ガスには体温低下作用が示唆されてい る。そこで本研究では、体温調節における脳内 H2S の役割を明らかにすることを目 的とした。 方法 実験動物には、シリアンハムスター (Mesocricetus auratus) を用いた。環 境温度に 3 時間順化させた後、体温測定実験を行なった。体温は、温度データロ ガーを用い、非拘束下で連続的に測定した。各種薬物は、カニューレを用いて側脳 室内に5 μL の容量で投与した。 結果 シスタチオニンβ-シンターゼ (CBS) の活性化剤である S-(5’-adenosyl)-L -methionine は、一過性の体温低下を誘導した。一方、3-メルカプトピルビン酸硫黄 転移酵素の活性化剤であるジヒドロリポ酸は、体温に影響しなかった。そこで、CBS によって産生される H2S の体温調節への関与を検討した。冬眠様低体温の誘導に は、CBS 由来の H2S の関与は認められなかった。一方、アセトアミノフェン (APAP) による体温低下はCBS の阻害剤により有意に抑制された。 考察 脳内CBS によって産生された H2S が、APAP による体温低下作用を制御し ていることが示唆された。
Ⅰ．背景・目的 生体内の硫化水素 (H2S) は、3-メルカプトピル ビン酸硫黄転移酵素 (3MST）、シスタチオニンβ-シンターゼ (CBS） およびシスタチオニンγ-リアー ゼ(CSE) によって産生されている 1),2) 。3MST は、3-メルカプトピルビン酸を基質として H2S を産 生し、中枢神経系では神経細胞やアストロサイトに 発現する。またCBS は、L-システインを基質として H2S を産生し、アストロサイトやマイクログリアに発 現する。一方 CSE は中枢神経系での発現報告も あるが、主に血管平滑筋などの末梢組織に発現し ている。 脳内に発生した H2S あるいはポリサルファイド は、NMDA 受容体や TRPA1 チャネルの活性化 を介して、海馬の長期増強の誘導を促進すること が報告された 3), 4) 。また、H2S による視床下部細 胞 からの副腎皮 質刺激 ホルモン放 出ホルモン (CRH) 分泌調節作用5) や、H2S による下垂体腫 瘍細胞のカルシウム活性化カリウムチャネルの活 性化6) など、H2S が神経調節物質として機能する ことが提案されている。 興味深いことに、2005 年 Blackstone らにより、 マウスに 80 ppm の H2S ガスを吸入させると、冬 眠様の低体温・低代謝状態を誘発できることが報 告された7) 。また2008 年 Volpato らにより、マウ スに80 ppm の H2S ガスを吸入させると外気温に 合わせて体温が低下することが報告された 8) 。一 方、2018 年 Hemelrijk らにより、正常酸素条件下 ではH2S ガスには体温低下作用はないという相反 する報告がなされた 9) 。そこで我々は、中枢神経 系に対する H2S の直接的な影響を確かめるため に、ハムスターの脳室内に H2S のドナーとして NaHS (3 μmol) を投与し、体温への影響を検討 した。その結果、最大-3.35 ± 0.65°C の一過性の 体温低下が認められ、外因性の H2S は体温低下 作用を有することを示した 10) 。一方、脳内で発生 する低濃度 (～数 μM) の内因性 H2S 1),11) が体 温低下作用を有するかは未だ不明である。そこで 本研究では、脳内 H2S の体温調節における役割 を明らかにすることを目的とした。 Ⅱ．方法 1. 実験動物 動物実験は、福山大学研究安全倫理委員会の 承認の下、「福山大学動物実験指針」に基づき 行った。 実験動物には生後 8 週齢以上かつ体重 110-200 g の シ リ ア ン ハ ム ス タ ー (Mesocricetus auratus, 以下ハムスター) を、性別を問わず用 いた。ハムスターは 20-24°C、12 時間明暗サイク ルの環境下で飼育し、飼料および水は自由摂取さ せた。 2. 体温測定 パラフィンコートした温度データロガー (サーモ クロンG タイプ, ㈱KN ラボラトリーズ) を腹腔内に 埋め込み、非拘束下にて連続的 (10 分ごと) に 測定した。 3. 脳室内 (ICV) への薬物投与方法 ハムスターは、三種混合麻酔薬 (0.6 mg/kg 塩 酸メデトミジン + 4 mg/kg ミタゾラム + 5 mg/kg ブトルファノール, IP) にて麻酔した。右側脳室内 (Bregma より前方 0.8 mm, 側方 1.6 mm, 脳表 より4.0 mm) に 24 G のステンレスカニューレを挿 入し、歯科用セメントで固定した。術後の回復期間 には 1 週間以上を設けた。各種薬物 5 μL は、カ ニューレを介し流速 10 μL/min にて側脳室内へ 投与した。 4. 薬物 すべての試薬はSigma-Aldrich より購入した。
S-(5’-adenosyl)-L-methionine chloride
dihydrochloride (SAM) お よ び O-( c a r b o x y m e t h y l ) h y d r o x y l a m i n e hemihydrochloride (CHH) は、人工脳脊髄液 (aCSF) に溶解後、中和して用いた。dimethyl
sulfoxide (DMSO) に溶解した N6-cyclohexyl adenosine (CHA)、ジヒドロリポ酸 (DHLA)、 8-cyclopentyl theophylline (CPT) は、aCSF で 希 釈 し 用 い た 。 ナ ロ キ ソ ン お よ び [D-Ala2,
N-Me-Phe4, Gly5-ol]-enkephalin (DAMGO) は aCSF に溶解した。アセトアミノフェン (APAP) は 温めた生理食塩水にて溶解した。
5. 統計学的解析
すべての値は平均 ± 標準誤差で示した。ま た、各群間の有意差検定は、一元配置分散分析 後、Dunnett’s test もしくは Tukey’s test を用い て行った。 Ⅲ．結果 1. 内因性 H2S による体温変化 内因性 H2S の体温に対する影響を明らかにす るために、脳内における主要なH2S 合成酵素であ るCBS および 3MST を活性化し、その影響を検 討した。外気温5°C の環境下で CBS の活性化剤
であるSAM を ICV 投与したところ、500 nmol の
濃度では60 分をピークとする体温低下が認められ た。また、ピーク時の体温は薬物投与前に比べ、 -3.00 ± 0.41°C 有意に低下していた (図 1)。 一方、3MST の活性化剤である DHLA は、いず れの濃度 (10-2500 nmol) においても体温に影 響しないことが明らかとなった (一部図 1)。以上の 結果から、脳内 CBS の賦活化によって発生した H2S が体温低下を誘導することが示唆された。 2. 冬眠様低体温の誘導における CBS/H2S 経路 の関与 ハムスターは、外気温を5°C、冬季と同じ短日周 期 (明期 8 時間・暗期 16 時間) の環境条件下で ひ と月 以 上 飼 育 する と 、体 温 を環 境 温 度 近 く (6-7°C) まで低下させて冬眠する。この冬眠時の 低体温の誘導は、アデノシン-A1 受容体を介した 系によって、一方、低体温の維持はβ-エンドルフィ ン-μ1受容体を介した系によって生理的に制御され て い る 12)。 そ こ で 、 冬 眠 様 低 体 温 に お け る CBS/H2S 経路の関与を検討した。 SAM による体温低下は、アデノシン A1受容体 アンタゴニストの CPT で抑制されなかった (図 2A)。一方、アデノシン A1 受容体アゴニストの CHA による体温低下は、 CPT により有意に抑制 されたが、内因性CBS 活性を阻害する CHH によ る影響は認められなかった (図 2A)。 また、SAM による体温低下は、非選択的オピ オイド受容体アンタゴニストのナロキソンで抑制さ れなかった (図 2B)。一方、μ受容体アゴニストの DAMGO による体温低下は、 ナロキソンにより有 意に抑制されたが、CHH による影響は認められな かった (図 2B)。 以上の結果から、アデノシン系やオピオイド系の 活性化を介した冬眠様低体温の誘導には、CBS によって産生された H2S は関与していないことが 示唆された。 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 -30 0 30 60 90 120 150 180
Time after injection (min)
500 0 0 2.5 SAM(nmol) DHLA(mmol) 0 0 50 0 DTb (℃ ) DTb (℃ ) A B ** Ta: 5°C Ta: 5°C 図 1. 体温に対する H2S 合成酵素活性化の影響 (A) 外気温 (Ta) 5°Cの寒冷環境に3 時間順化さ
せ た 後 、S-(5’-adenosyl)-L-methionine (SAM;
○:0, ●:50, ●:500 nmol) または dihydrolipoic
acid (DHLA; ▲:2.5 μmol) を側脳室より投与し、
体温の変化 (DTb) を測定した。 (B) 薬物投与 60 分後における体温変化 (DTb) を、平均 ± 標準誤差で示した (n=6-7)。統計処理 には、一元配置分散分析後、Dunnett’s test を用 いた。 ** P < 0.01 (vs control)
3. APAP の体温低下作用における CBS/H2S 経 路の関与 APAP は、解熱鎮痛薬として広く用いられている がその詳細な作用機序は未だ不明である。そこ で、APAP の体温低下作用における CBS/H2S 経 路の関与を検討した。 外気温 25°C の環境下で 300mg/kg APAP を 皮下投与したところ、220 分をピークとする体温低 下が認められた。また、ピーク時の体温は薬物投 与前に比べ、最大-4.17 ± 0.52°C 有意に低下して いた (図 3)。次に、APAP 投与 10 分前に CHH をICV 投与したところ、APAP の体温低下作用は 有 意 に 抑 制 された (図 3)。以上の結果から、 APAP は CBS/H2S 経路を介して体温低下作用を 示すことが示唆された。 Ⅳ．考察 CBS 活性化剤の SAM によって一過性の体温 低下が誘導された (図 1)。SAM は脱メチル化、加 水分解を経てアデノシンに分解される 13) 。アデノ シンは A1 受 容 体 を刺 激 して体 温 を低 下 させ る12),14) 。それゆえ、SAM の分解によって生じたア デノシンが A1受容体を介して体温低下を誘発す る可能性が考えられた。しかし、SAM による体温 低下は、A1受容体アンタゴニストの CPT によって 抑制されなかった (図 2)。この結果は、SAM によ る体温低下は、分解されたアデノシンの作用では 図 2. 冬眠様低体温誘導における CBS/H2S の 影響 (A) 外気温 (Ta) 5°C の寒冷環境に 3 時間順化
させた後、S-(5’-adenosyl)-L-methionine (SAM)
あるいは、N 6-cyclohexyl adenosine (CHA) を
側脳室より投与し、低体温を誘導した。SAM 投与 60 分後もしくは、CHA 投与 50 分後の体温変化
(DTb) を、平均 ± 標準誤差で示した (n=5-10)。
統計処理には、一元配置分散分析後、Tukey’s
test を用いた。 *P < 0.05, NS: not significant
(B) SAM または[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5
-ol]-enkephalin (DAMGO) を側脳室より投与し、低 体温を誘導した。 SAM 投与 60 分後もしくは、 DAMGO 投与 70 分後の体温変化 (DTb) を、平 均 ± 標準誤差で示した (n=7-13)。統計処理に は、一元配置分散分析後、Tukey’s test を用い た。 ** P < 0.01, NS: not significant -9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 NS NS * D Tb (℃ ) A Ta: 5°C SAM (nmol) CHA (pmol) CPT (nmol) CHH (nmol) 500 0 15 0 0 75 0 0 0 75 0 15 500 0 0 0 0 75 15 0 D Tb (℃ ) B Ta: 5°C SAM (nmol) DAMGO (nmol) Naloxone (nmol) CHH (nmol) 500 0 60 0 0 1 0 0 0 1 0 15 500 0 0 0 0 1 60 0 NS NS ** -6.0 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 -6.0 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 -60 0 60 120 180 240 300 360 420 0 100 Time after injection (min)
300 0 300 100 APAP(mg/kg) CHH(nmol) 0 0 Ta: 25°C Ta: 25°C DTb (℃ ) DTb (℃ ) A B * ** 図 3. アセトアミノフェン (APAP) 誘導低体温に対 する O-(carboxymethyl) hydroxylamine (CHH） の影響
(A) APAP は皮下から、CHH は APAP 投与 10 分前
に側脳室より投与し、体温の変化 (DTb) を測定した。
○:control, ●:APAP, △:CHH, ▲:CHH+APAP
(B) APAP 投与 220 分後における体温変化 (DTb)
を、平均 ± 標準誤差で示した (n=5-9)。統計処理に
は、一元配置分散分析後、Tukey’s test を用いた。
なく、CBS のアロステリックな活性化に起因するこ とを示唆した。CBS は主にアストロサイトに局在す る 15) ことから、体温低下を誘導する H2S はアスト ロサイトに存在するCBS で産生されることが示唆さ れた。体温低下を惹起する脳内H2S 濃度を明らか にするために脳脊髄液中 (CSF) の H2S 濃度を HSip-1 (Dojindo) を用いて測定した。外因性の
H2S (3 μmol NaHS, ICV) 投与により体温低下を
惹起すると、CSF 中の H2S は 200 μM にも達し た10) 。一方、SAM により内因性の H2S 合成酵素 を賦活化し体温低下を誘導すると、CSF 中の H2S は検出限界以下 (1.6 μM >) であることが示され た (データ未掲載)。このことから体温低下を惹起 する内因性H2S は、脳全体ではなく局所で発生し 作用することが示唆された。 CBS によって産生された H2S の冬眠様低体温 への関与を明らかにするために、内因性の CBS 活性を阻害するCHH を用いた。CHH は、広く用 いられている CBS 阻害剤であるが、CBS を阻害 する (IC50 = 8.52 ± 0.71 μM)16) だけでなく、 GABA トランスアミナーゼ (GABA-T) も阻害する (IC50 = 2.7 μM)17) ことが報告されている。それゆ え、CHH による GABA-T の阻害は、内因性の GABA 増加をもたらし、結果、熱産生系を抑制す ることが考えられた。実際、100 nmol CHH を ICV 投 与 す る と 、25°C の 環 境 下 で も 最 大 -1.31 ± 0.68°C の体温低下が認められた (図 3, △)。そこ で、体温に影響のない15 nmol CHH にて検討す ることにした。冬眠時の体温調節は、体温を外気 温まで低下させる冬眠導入期と、その低体温を維 持する維持期において、別々のメカニズムで制御 されている12) 。導入期は、内因性のアデノシン-A1 受容体を介し、視索前野をはじめとするGABA 作 動性の熱産生抑制系が賦活化されることにより、 体温が低下すると考えられている 12),14) 。一方、低 体温を持続させる冬眠維持期は、内因性のβ-エン ドルフィン-μ1 受容体を介し、背内側核をはじめと する熱産生系が抑制されることにより、体温が低下 すると考えられている18) 。A1受容体アゴニストや μ 受容体アゴニストを用い、冬眠導入期様低体温 および維持期様低体温を誘導したが、CHH はい ずれの体温低下も抑制しなかった。さらに、冬眠中 のハムスターに15 nmol CHH を投与しても覚醒 が誘発されなかった (データ未掲載)。現時点で は、冬眠様低体温の制御機構における脳内 H2S の関与は認められていない。今後、CBS に特異的 かつ強力な新たな阻害剤19) によるさらなる検証が 必要と考えられた。 次に、CBS によって産生された H2S の APAP の体温低下作用への関与について検討 した 。 APAP は生体内でN-アセチル-p-ベンゾキノンイミ ン (NAPQI) に代謝され TRPA1 チャネルを活性 化する20) 。活性化されたTRPA1 チャネルは求心 性迷走神経を介して体温を低下させることが示唆 されている21) 。また、求心性迷走神経の投射先で ある孤束核の GABA 作動性神経が、縫線核の交 感神経プレモーターニューロンを抑制し褐色脂肪 組織の非震え熱産生を抑制する 22) ことからも、 TRPA1 チャネルを介した求心性迷走神経刺激が 熱産生を抑制することが示唆される。本研究では、 CBS 阻害剤 (CHH) の ICV 投与により、APAP 誘導低体温が阻害された。この結果は、延髄の CBS で発生した H2S が APAP の体温低下作用 を制御していることを示唆した。またこの結果は、 APAP の薬効を評価する上で、硫黄泉の飲泉や 含硫化合物摂取などを考慮する必要性を示唆し た。今後、APAP の作用を制御する脳内 H2S 濃度 を含めたメカニズム解明が必要である。 Ⅴ．結論 本研究により、脳内CBS の賦活化により一過性 の体温低下が誘導されることが明らかとなった。さ らに、CBS 阻害剤により APAP の体温低下作用 が阻害されることが明らかとなった。これらの結果
から、APAP の重要な薬効の一つである解熱作用 が、脳内 CBS から発生する H2S によって制御さ れていることが示唆された。 謝辞 本研究に対しまして、一般財団法人日本健康開 発財団より第 45 回 (令和元年度) 研究助成金を 賜りましたこと深く感謝申し上げます。 文献
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The role of brain hydrogen sulfide (H
2S) in the thermoregulation of Syrian hamsters
Masatomo Watanabe1), Mayuko Monden1), Yutaka Tamura1)
1) Laboratory of Pharmacology, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Fukuyama University
Abstract 【Background】
H2S acts as an endogenous neuromodulator in the brain. Some reports indicated that H2S gas induces hypothermia and hypometabolism in rodents. We therefore evaluated the effects of endogenous H2S on the thermoregulation.
【Methods】
Adult Syrian hamsters (Mesocricetus auratus) were acclimated to ambient temperature for 3 h before drug injection. Each drug (5 μL) was injected into the lateral ventricle (ICV) of hamsters. The body temperature (Tb) of all hamsters were measured continuously using an iButton thermochron datalogger without restraints.
【Results】
S-(5’-Adenosyl)-L-methionine, a cystathionine B synthase (CBS) activator, induced hypothermia
in the hamsters. On the other hand, dihydrolipoic acid, a 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase activator, did not produce any significant Tb change. We then examined the effects of H2S generated by CBS on thermoregulation. O-(Carboxymethyl) hydroxylamine (CHH), a CBS inhibitor, did not affect hibernation-like hypothermia. In contrast, ICV injection with CHH attenuated the hypothermic effects of acetaminophen (APAP).
【Conclusion】
These findings suggest that H2S generated by CBS regulates hypothermia induced by APAP. Key words: hypothermia, hydrogen sulfide, cystathionine β-synthase, acetaminophen
