著者 脇元 理恵, 田崎 和江
著者別表示 Wakimoto Rie, Tazaki Kazue
雑誌名 地球科学
巻 60
号 4
ページ 275‑286
発行年 2006‑07‑25
URL http://doi.org/10.24517/00061669
doi: 10.15080/agcjchikyukagaku.60.4_275
Creative Commons : 表示 ‑ 非営利 ‑ 改変禁止
The Association for the Geological Collaboration in Japan (AGCJ)
NII-Electronic Library Service
The Assooiation for the Geologioal Collaboration in Japan (AGCJ }
地 球科学60巻
,
275〜
286(2 06年)Earth Science(Chikyu KagakU)vol
,
60,
275−
286.
2006275
原 油 を含 む 温泉水 に お け る 銅 藍 の 生 体 鉱 物化作用
*脇元理恵
* *・ 田 崎和 江
* * *Bacterial
mineral
forrnation
of
covellite
in
oily
hot
springs
*WAKIMOTO
Rie
* * andTAZAKI
Kazue
** *Abs釦ract The ilmer wall of the Tsukioka hot spdng well was cQvered with gr n microbial mats which contained black crude oil
.
The hot sphngis
located
in
Tsukioka ,
Niigata,
Japan.
Thehot
spring water (pH 7, 3,
Eh・ 184
mV and492
°
C)that was produced肯om a 280m in
depth
originated丘omfbssil
seawater ]冂1e aim Qf this study was to invcstigate of covellitebiomineralization
in the green microbi 副 mats with crude oi1 行om 丗 e TsukiQka hot sp 血gwatcr Observations
by
eptical and eleetron m三croscopy 」 phospholipid analysis andbacterial
cultivation showed thatthe
biomineralization
ofcovellite (CuS
)wasfound
onthe
surface of crude oildrqplets .
ED−
XRF analysis showed thatthe crude oil contained SO3 (67
.
6wt%),
CaO (24.
8wt%)andCu20
(2,
6wt%).
Observations by optical and epiHuorescence microscopy as well as scanning electron mlcroscopy (SEM
)showed that two moq )hological types ofbacteria(Le
. ,
filamentous and coccus typedbacteria
)wcrefbund
on crude oild
エoplets.
Transmjssion e】ectron microscopic (TEM )observadons er rovealed 血at the cell wall ofthc創amentousbacteria
had
adouble
membrane歪md was surrou皿
ded
by
Extracellular Polymeric Substance(EPS),
which might provide the favorable nucleation sitesfor CuS
.
X−
ray dithaction and electron diffraction analyses of the microbial mats showed that the materialspreclpitated on the surface of the oil
dropletS
werehighly
crystalliZed covellite (CuS
).
FTilR spectra of the microbial 螂 tconm ed covellite show 瓠 血e appe ce ofC−
N−
H,
P−0 ,
P−0−C
and N−
Hbands ,
indica血g血 e presenceof
phospholipids
(lecithin and phosphoric ester)童n the microbial mats.
Cultivation experiments , furthermore, demonstrated that the cultivatedbacteria
wereidentified
as sul魚te reducingbacteria
(for
coccus typedbacteria
)and oi!decompos
血gb
蹠 漁 (for filamentousbacteria
).
A schernatic formation modelis
here
suggested tObetter
understand the interactionbctween
baeterial cells and oil drQplets under anaerobic conditions ill dle Tsukioka hot spring water.
The biomineralization of cevellitedescribed
in this sturly might have prof()und irnplications f{)r bioremediadon ofoil−
contaminated site
,
Ke7
Urords
:biomineralization ,
covellite,
crlde oil,bacteria
,phospholipids
, extracellularpolymeric
substance ,
TsUkioka
hot
springsは じめ に
温泉や地 下 水 中 には 多種 多 様 な微 生物が生息し
,
特有の バ イオマ ッ トを形 成してい る (Moyer et aLl995
;Asada andTazaki
2001
).一
般にバ イ オマ ッ トは,
原核生物 あるいは単 細 胞 真 核牛物で構成さ れ る構造物で,
微生物の増 殖 と共に厚みを増 し
,
現 地の物 理 化 学 的環 境 を反 映しなが ら成長 する.
その内部で は金属イ オン の沈積と生 体 鉱 物の生 成 (バ イ オミ ネラ リゼ
ー
シ ョ ン)が 行 わ れ てい る (若 尾 1996 ;岸上 ほか
1999
;田崎 ほ か 2002).
例 え ばFe とSの 鉱物で あ るschwertmannite の鉱 物化に 関 し て
,
鉄 酸 化 細 菌が形 成 を促 進 し (Kawano anCl Tomita2001
),
ま た,
微生物お よ び藻 類が細 胞に鉄を沈着する こ と に よっ て短期間で鉄鉱床を形成 する(Akai et al
. 1999
),
さ らに,
銅の生体鉱物化作 用におい ては,
シアノ バク テ リ アの細 胞のサイズ に よっ て woodwardite の縞 模 様 がコン トロ
ー
ルされ る (Watanabe
et al. 2003
).
日本有数の石油生産地である北海道
,
秋田県お よび新潟県で は
,
石油掘削時に原 油 と と もに温 泉 水 が 噴 出 してい る例 が 多い,
微生物と石 油の関係につ い て は,
重 油流 出事 故お よ び土 壌の油 汚染地 域の石油分解菌に よ る汚染環境の修復 (バ イ 2005年9月12日受 付
.
2005年12月20日受理*2004年口本地質学 会 第
111
年 学 術 大 会 (千 葉)に て. 一
部発表.
* *金 沢 大 学 大学院自然科 学 研 究 科
,
〒920−
ll92金 沢 市 角 間 町Graduate School ofNatural Science and Technology
,
Kanazawa University,
Kakuma,
Kanazawa920−ll92,
Japan.
***北 陸 支部
・
金 沢 大 学 大 学 院 自然 科 学研 究 科,
〒920−
ll92金沢市角間 町Hokuriku Branch
、
Graduate Schoot ofNatural Sciencc and Technology,
Kanazawa University,
Ka ma,
Kanazawa 920−
ll92,
Japan.
(
7
)N工 工
一
Eleotronio Library276
脇 元 理 恵・
田崎和 江オ レ メ ディエ
ー
ション)の研究がなさ れ ている (Bragg et al. 1994
;中 川・
福 井2003
;Chaerun et al. 2004
),
こ の ような微生物に よる石 油の分 解は
,
好 気 的環 境下 にお ける好 気 性 細 菌 に よ るものが一
般 的であ る が,Rueter
et al.
(1994
)は嫌 気 的,
硫 酸還元条件下に おいても微生物に よ る原油の分解が活発 化され る例 を報 告 してい る
.
しか し,
石 油 分解に伴わ れて形 成 され る 生体 鉱 物につ い ては,
Yushkin (1998) が 走査 型 電 子 顕 微鏡で形態を観察しているのみである,
本研 究で は
,
原 油 を多量に含む温泉水が噴出し ている新潟 県新 発 田市 月 岡温 泉の源 泉 井戸に形 成 する緑 色バイオマ ッ ト 中で認め ら れ た 銅 藍 (covellite ;CuS )の生体鉱物 化 作 用につ い て報告する
.一
般に,
地球表層部に おいて銅鉱物の多く は硫 化銅 鉱 物 と して存 在 し,
中でも銅 藍 (CuS )はchalcocite(Cu2S >
,
chalcopyrite (CuFeS2 ),
bornite
(Cu5FeS4
) など と共 に普遍 的に産出する (Dunn and Muzenda2001
).
無 機化 学 的 な環境下 に おける銅 藍の形成は, 一
般に
220〜350
℃の熱変 質 作 用 を受 けて起こる (Lusk and Bray2002
).一
方,2 〜50
℃の比較 的 低 温で は
,
還 元 環 境 下におい て Cu の飽 和 度は増 大し,
銅藍の形成が起こ る と考えられている (Ehrlich et al. 2004
).
従 来の硫 化 銅 鉱 物に関する研 究は#一
に無機化学的 な 相平衡の中で論じ ら れて きたが,
微生物の細 胞 浸 出 液 および 細 胞 膜などの有機物が岩石 中の硫化銅 鉱物を積 極 的に溶解 す る例 も知られており (Daubree1862
;Duff et al, 1963
;Mor and Beccarial975
;Mcneil and Littlel992
),
生体鉱物学的知 見か らも検 討を行 う必 要がある.
また,
微生物 が 関 与 した鉱 物化作用の研究は,
溶解や溶出に関 する化 学 的 デー
タに基づく報 告 が 主であ り
,
微 生 物の培養実験 を通し て得られ た生体 鉱物を ミ クロ〜
サ ブ ミ クロ ンオー
ダー
で観 察・
分 析 した 例 は少ない
.
そこ で本 研 究で は
,
比較的低温 (49. 2
℃),
常圧の,
温泉一
原油
一
微生物の三者 が混 合 した環 境 系 において,
緑 色バ イオマ ッ ト中に銅 藍の存在を電 子顕微鏡観 察で明らかにし た
,
ま た,
微 生 物の培 養 実験に より,
銅 藍の形 成に直接関与する二 種 類の バ クテリアの存 在 が 明 らかになっ たので報告する,
試料
お よび実験方 法
試料採取
本 研究の調査対 象地 域である新 潟 県 月 岡温 泉 は新 潟 平 野の 油田
・
ガ ス 田地帯に属する.
貯留岩は新 第三紀の寺泊〜
七谷層 相 当層
,
特に火 山岩 類 中に挟 在 する泥 岩に優れ た有 効 孔 隙 が確認さ れて いる (Tsuchiya l995;Hirai et al.
1995) (Fig.
IA).
月岡温泉は1912
年,
石油掘削の為に掘ら れ た井 戸か ら原油と共 に多 量の化 石 海水である温水が 噴 出 したこ とに起源を有 する
.
採取で きる原油の量 が 少 なかっ た ために油田 として は 開発されず,
温泉として利 用 され 現 在 に至っ ている (島 津2001
),
月 岡温泉5
号 井戸の源 泉水は無 色透明で,440L
〆分の湧 出量であ り
,
温 泉 分 析 表によれば,
硫 化 水 素 発 生 量 は125, 8mg
〆1と非 常に多い (Fig. IB
>.
第 1図 月 岡 温泉の位 置 (A)と源 泉井戸の全体 図 (B)
,
源 泉井 戸 内壁に は緑 色バ イ オマ ッ ト (矢 印)が形 成し.
原 油 が 付 着 している (矢印) (C)
Fig
. 1
Tsukioka
hot
springs in Niigata Prefecture,
Japan.
A;Sampling
location.
B;Overview ofthehot
spring wetl.
C; ?hotograph showsthe
green microbial mats and black crude oil along the wall ofthe well2003 年 5月に月岡温泉の源泉井戸か ら
,
井戸の内 壁に付 着し た黒色の原油と緑色バイ オマ ッ ト (Fig. lc
矢 印)を採 取 し た.
バイオマ ッ ト試 料 は,
滅 菌 済 みの バ イアル瓶とゴ ム製の蓋 を用い て採 取 した
.
観 察用試料は2. 5
% の グ ル ター
ル アルデヒ ドで固定し た
.
分析 用試料は温 泉水と共に採 取 し,4
℃に冷蔵し て研究室に持ち帰っ た
.
同 じ く原 油 試 料は滅 菌済 みのバイアル瓶 とテフロン加工の蓋を用い,
冷蔵して持ち帰っ た
.
温泉水 試料はO. 2mm
の メンブランフィ ル ター
で ろ過した後
,
硝酸 を用い てpH1
以 下にして冷 蔵 運 搬を行っ た,
実験方法源泉の水質測定
温 泉水の水 質は
,
現 地におい て,pH
はHOR 肥 A カスタニーLAB
pH メー
ター
F−24
を,
酸 化還 元電 位 (Eh ) はHORIBA カス タニ
ー
ACT Eh メー
ター
D−13
を,
電気伝導度(EC )はHORIBA カス タニ
ー
ACT 導 電 率メー
ター
ES・ 12
を,
溶 存 酸 素 (DO )はHORIBA ハ ンデ ィ溶 存 酸 素メ
ー
ター
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原 油 を 含 む温 泉 水に お け る銅 藍の生体鉱物化作用
277 OM ・
12を用い て そ れ ぞ れ 測定を行っ た.
持ち帰っ た温 泉水の うちNa
,
K につ い て は炎 光光 度法で,
Ca,
Mg,
T・tal Fe,
Mn につ い て はフレー
ム原 子 吸 光 光 度 法で,
また,
Cu につ いてはフレー
ム レス原 子吸光光度法で定量分 析 を行っ た
.
ま た,SO42 .
は分 光 光 度 法 を用い て 分析を行っ た
.
炎 光 光 度法 およ びフ レー
ム原 子 吸 光 光 度法にはセイコー
電子工業製SAS −727
を,
フレー
ム レス原 子 吸 光 光 度 法には 同製社SAS− 705V
を使 用 し,
電気金 属加 熱炉を併用して測 定 を行っ た.
分 光 光 度法にはAPEL Model PD
−3
に て,
硫 酸バ リウムによ る自濁 法 (日本 分 析 化 学 学 会 北 海 道 支部編1994
)を用いて 測 定 を行っ た.
緑 色バ イ オマ ッ トと 原油の鉱物組成お よび含 有 元 素 バ イ オマ ッ トの鉱 物 組 成につ い て は
,
風乾し たバ イオマ ット試料を粉末に し
,
X 線 粉 末 回折 (XRD
)装置を用い て同 定 した.
分 析に は理学電機 製 RINT1200 型X 線 回 折 装 置 を 使用 し, CuK
a線 を用いて電圧40kV,
電流30mA
で測 定し た.
また
,
バ イ オマ ッ トお よ び 原 油 中の化学組 成 (原 子番号が Na 以 上 の 元素 )につ いて は,
H
本 電 子製エ ネルギー
分散型 蛍 光X 線 分 析 (ED
−
XRF )装置 JSM−
3201で,
Rh・
K a線 源 を用い,
加 速 電 圧30kV
でFP (フ ァ ン ダメ ン タル パ ラメー
タ
ー
)・
バ ル ク法に より半 定 量 分 析 を行っ た,
バ イ オマ ッ ト 試料は風 乾し,
乳鉢で粉末に し たものをペ レッ ト状に加 工 し 分析 を行っ た、
採 取し た 原油 試料 (Fig. IB
)は2枚のマイラー
フ ィ ル ムに挟んで分析 を行っ た
.
緑色バ イ オマ ッ トの顕微 鏡 観 察
持 ち 帰っ たバイ オマ ッ ト試料につ い ては直ちに落射 蛍 光
・
微分 干 渉 光 学 顕 微 鏡 (落 射 蛍 光 装 置EFD−3
お よ び透 過型微分 干 渉 装慨NTF
−2A
) を用いて観察を行っ た.
落射蛍 光顕微 鏡観察の際に は,
微生物の存 在 を確 認 す るた めに,
DAPI (4,
6 −diamidino −2−
phenylindole)染色 を施し観察を行っ た.
微 生 物は DAPI 染 色 後,
蛍光 顕微鏡下 で観察する とDNA が青色 を呈し,
鉱物は黄色の蛍 光 を呈 す る (Kawai
et al. 1999
).
また,
原 油 は産 地によっ て異なる色調の蛍光を示 す
.
バ イオマ ッ ト試 料の微 細 な表 面 形 態 観察は走査 型電子 顕微 鏡
(SEM JERO
−
JSM−
5200LV)を用い て,
加 速 電圧15
kV
で行っ た
.
また,
SEM に取り付けられたフィリップス製エ ネル ギー
分 散 型x 線 分析 装 置 (EDx Philips−
EDAx−
Pv9800STD ) を用い て バイ オマ ッ ト試 料の元 素 分 析 を行っ た.
観察の際に は微生物,
鉱 物 およ び油 滴の形 態 を保つ ため,
Suzuki et al.
(1995
)の手法に基づ き,
凍結乾燥法 を用いた.
さ らに 微 細 な 微 生 物の 観察は透 過 型 電 子 顕微 鏡 (TEM JEOL
・
JEM−2000EX
)を用い て行っ た.
ま た,
微生物お よ び鉱物の内部組織の観察を行 うた め
,
超薄切 片法 を用いて厚さ80nm
の切片 を作 成 し,
TEM 観察お よび電子線回折 分析を行っ た
.
な お,
超薄切 片法ではエ タ ノー
ルでの脱水お よ び有 機 溶剤に よ る 固定 を行うた め
,
バ イ オマ ッ ト中の油 滴は溶解・
除去 さ れる
.
フ
ー
リエ変換赤 外 分 光 分析 と リン脂 質 分析(9 )
緑 色バ イ オマ ッ トと原 油の化 学結 合を調べ る た めに フ
ー
リエ変 換 赤 外 分 光 光 度計 (JASCO FTtIR
−610V
)を用い て4000
〜400cm.
1の範囲で測 定を行っ た.
風乾さ せたバイオマ ッ ト 試 料に赤 外 透 過 材料である粉 末の臭 化カ リウ ム (KBr )10mg 観 合し,
直 径3 のペ レッ トに鯉 した纐1
定を行っ た.
また原 油試料は液体用セ ルを用いて測定を行っ た
.
一
方
,
バイオマ ッ トに含まれる リン脂質,
特に レシチン量につ い て はBligh
−
Dyer 法で クロ ロホル ム,
メ タ ノー
ル,
KC1溶液による抽 出 を行っ た後
,
湿 式 分 解 法 を用いて測 定 を行っ た,
モ リ ブ デン酸ア ン モニ ウ ム お よ び酢酸ブ チ ル に より発色 を させ,
分 光 光 度計 (APEL Model PD−303
)を用いて検 量 線 法によ り}則定 を行っ た.
なお,
こ の分 析 法は 凵本生化学 会 編(1991)およ び冂本 油化 学会編 (
1996
)の手法に従っ た.
緑色バ イ オマ ッ ト中の微生物の培養実験バ イ オマ ッ ト中に生 息 する微 生 物の代 謝 様 式 を明 らか にす
るた めに硫 酸 還 元菌 選 択 培 地お よ び石 油 分 解 菌 選択 培 地を用
い て微生物の培養実験を行っ た
,
硫酸還 元菌の培 地は溶液1
1 中,
KH2PO4 :0, 5g ,
NH4C1 :lg ,
Na !SO4 :lg ,
CaClゴ2H20
:0. lg,
MgSO4・7H20
:2g,
Na−
]actate :lg, Yeast
extract ;lg,
Resazurin−Na
(0,
1% 溶 液):lml,
FeSOrl・7HzO
:0. 2g,
cyctejn−
HCI :100mg,
Na−
ascerbate :100mg
でpH7. 2−7, 4
に調 節 した ものを使 用 した (上 木・
永 井 1993).
培 養には滅 菌 水10ml 中にバ イオマ ッ ト25g
を懸 濁させ たものを 原液として
,
培 養原液を含む10
倍 希釈 溶液を5
段 階作製し,
調製した液体培地7. 5m
[を入 れ た 滅菌済み試 験 管 (シ リコ ン栓 付 き)にそれぞれ lm1ずつ加 えた.
試 験 管上部を窒 素 置換し,
嫌気パ ック中 (アネロパ ック三菱ガス化学社製)に おいて
30
℃,
暗条件ドで3
日間培養を行っ た,
石油分解菌の培地に はBushnell Hag.
s Mineral Salts medium(BHMS )に月 岡温 泉 源 泉 井 戸よ り採 取 した原 油1% を炭 素 源 として加 えた もの を 使 用 した
.
培 地は溶液ll
中,
MgSO4・7H
,O :0. 2g,
CaC12:0. 02g,
KH2PO4 :1g,
K2HPO4 :1g,
NH4NO3 :lg,60
% の FeClsを2
滴 加 え,
pH
を7. 2−7. 4
に調 節 した (Chaenm et al
,
2004),
培 養は硫 酸 還 元 菌 培 養と 同様の培養原液を使用し,
同様の手順で10
日間の培 養を行っ た
.
どち らの培 地 もオー
トクレー
プ (121
℃, 20
分 )で滅 菌し,
培 地に加 え た 原 油は0,
2mm の フ ィ ル ター
で除 菌 したもの を用いた
.
培 養し た微生物は落 射 蛍 光・
微 分 干 渉 光 学 顕 微鏡およ び透過型tz ・ r
顕微鏡に より,
形態観察を行っ た.
結 果
源泉の水質測定結果
月岡 温 泉水の水質 測 定 結 果 を
Tablel
に示 す.
pH は7. 3
で ほ ぼ中 性であ り,
Ehは一 184
mV と非 常に還 元 的 な 環 境 を示 した.
EC は7. 3mS
/cm と比較 的高く,
DO は0. 8mg
!1と貧酸 素環境 を示し,
水温は49, 2
℃であっ た,
また,
原 子 吸 光および分 光 光度 分 析の結 果 は
,Na 「
が
1375. 1mg
!l
と非 常に高 く,
また
,
Ca21,
K
“,
Mg2一
濃 度 も
30mg
!l以 上の値を示し,
化石N工 工