好熱性細菌Bacillus Stearothermophilus YG185の増殖及び酵素生産特性に及ぼす温度及び培地組成の影響

好熱性細菌Bacillus Stearothermophilus YG185の

増殖及び酵素生産特性に及ぼす温度及び培地組成の

影響

著者

上村 芳三, 平野 敦史, 甲斐 建一, 幡手 泰雄

雑誌名

鹿児島大学工学部研究報告

巻

34

ページ

57-63

別言語のタイトル

Effects of Temperature and Culture Medium on

Growth of Bacillus Stearothermophilus YG185

and Its Protease Production

好熱性細菌Bacillus Stearothermophilus YG185の

増殖及び酵素生産特性に及ぼす温度及び培地組成の

影響

著者

上村 芳三, 平野 敦史, 甲斐 建一, 幡手 泰雄

雑誌名

鹿児島大学工学部研究報告

巻

34

ページ

57-63

別言語のタイトル

Effects of Temperature and Culture Medium on

Growth of Bacillus Stearothermophilus YG185

and Its Protease Production

好熱性細菌Ｂａｃｊ伽ｓＳ伽r､o伽剛OpMusYG185の増殖及び

酵素生産特性に及ぼす温度及び培地組成の影響

上 村 芳 三 ・ 平 野 敦 史 ・ 甲 斐 建 一 ＊ ・ 幡 手 泰 雄

（受理平成４年５月31日）

EffectsofTemperatureandCultureＭｅｄｉｕｍｏｎＧｒｏｗｔｈｏｆ

ＢａＣｊ肋sStearo仇ermOph伽SYG185

andltsProteaseProduction ＹｏｓｈｉｍｉｔｓｕＵＥＭＵＲＡ，ＡｔｓｕｓｈｉＨＩＲＡＮＯ，Ken-ichiKAI，ａｎｄＹａｓｕｏＨＡＴＡＴＥ Ｂａｃｊ〃usstearotﾉze7wzopﾉzjZusYG185，whichproducesahighlythermostableneutralprotease，was

cultivatedonarotaryshakertoestablishtheproductionprocessoftheprotease・Theeffectsofculture

conditions（temperatureandculturemedium）onthegrowthandproteaseproductionofthestrainYG

185wereinvestigated.Ａt５０℃,WSGmedium（wheatflour，soybeanmeal，glucose，caseinandsome

minerals）gavethebestproteaseactivityamongallculturemediatested・Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｉｎｔｈｅ

ＷＳＧｍｅｄｉｕｍ，whichisasolidnaturalprotein，maycontroll-releaseaminoacids，ａｎｄcausedhigher

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ahigherproteaseactivity，ｃｏｍｐａｒａｂｌｅｔｏｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｒｄｉｎａｒｙＷSGmedium．

緒 巨 好熱性細菌（好熱菌）とは，５５℃以上の高温下で生 息可能な微生物の一群を意味し，自然界では主に温泉， 火山周辺地域などに分布するが，特に胞子を形成する Bacillus属は堆肥，海洋，河川，土壌など幅広い地 域から分離することができる。一般に好熱菌の酵素あ るいは核酸などの生体高分子や細胞器官は常温菌のも のよりも耐熱‘性が高いため，高温の条件下で行われる 発酵工業や廃棄物処理への利用が検討されている。ま た，好熱菌の生産する耐熱‘性酵素は熱に対して安定で あるだけでなく，有機溶媒や化学的変性剤（尿素や表 面活性剤など）に対しても安定であるため，各種食品 加工用，洗剤添加用などの化学工業の分野や，医療用 試薬などの医学の分野等，幅広い分野での利用が期待 されている。 本研究では，好熱菌BacjZ山sstearo伽『mopﾉZ伽ｓ ＹＧ１８５を用いた耐熱‘性プロテアーゼ生産プロセスの ＊：東ソー株式会社 最適化及びその利用プロセスに関する研究の基礎段階 として，フラスコ振鐙培養実験を行い，好熱菌ＹＧ１８ ５株の増殖及び酵素生産特性について検討した。 培地は，窒素源としてミルクカゼインタンパク質を 加水分解したトリプトンを主成分とするＬ培地及び 脱脂大豆，カゼインといった天然タンパク質を主成分 とするＷＳＧ培地を基本とした。これらの培地の組成 を部分的に変えることにより，以下の項目についてそ れぞれ増殖及び酵素生産特'性の検討を行った。 ｌ）培養温度の影響（Ｌ培地，ＷＳＧ培地） ２）窒素源の種類の影響（Ｌ培地基本） ３）脱脂大豆の効果（ＷＳＧ培地基本） ４）窒素源の分割添加の効果及び分割回数の影響（Ｌ 培地，ＷＳＧ培地基本） ５）ロータリーシェーカー回転数の影響（ＷＳＧ培地）

表２ＬＣ寒天培地（蒸溜水１１に対し） 5８ 鹿 児 島 大 学 工 学 部 研 究 報 告 第 ３ ４ 号 （ 1 9 9 2 ） シェーカー中，143rpmで24∼40時間培養を行った。 サンプリング時には，培養液のＯＤ６６０（660ｎｍにお ける吸光度）及び培地上清のｐＨ，酵素活性を測定し た 。 フ ラ ス コ 培 養 実 験 に は Ｌ 培 地 及 び Ｗ Ｓ Ｇ 培 地 を 使用した。またそれらの培地を基本とし，成分及び添 加時期に一部変更を加えた培地も用いた。 １ ． 実 験 １ ． １ 菌 株 本研究で用いた好熱菌ＢａｃＺ伽sstearo伽ｒｍＯｐＭｕｓ ＹＧ１８５は，自然界の土壌より分離した，耐熱‘性プロ テアーゼを生産する好熱菌Ｂａｃｊ肋sstgaro伽rmo‐ ph血ｓＭＫ２３２を変異させることにより，アミノ酸抑 制を弱め，アンモニア耐性を強めたものである2)。 １ ． ４ 分 析 サンプリング時には，培養液の菌体密度及び培養液 上清の酵素活性とｐＨを測定した。 １ ． ２ 培 地 培地はＬ培地，ＷＳＧ培地及びそれらを基本とし， 成分に一部変更を加えた培地を用いた。コロニー計数 にはＬＣ寒天培地を用いた。表１，２及び３にＬ培 地，ＬＣ寒天培地及びＷＳＧ培地の組成を示す。 表ｌＬ培地（蒸溜水11に対し） １ ． ４ ． １ 菌 体 密 度 ＯＤ６６０試料液を生理食塩水で１０倍に希釈し，分光光 度計により660ｎｍにおける濁度（吸光度）を測定し た。 コロニー計数法OD660の測定困難な培地（ＷＳＧ培 地等）については，適当に希釈した試料液を塗抹した ＬＣ寒天培地プレート上に生成したコロニー数を数え ることにより算出した。サンプリングした培養液を， プレート１枚につきコロニー数が100個程度になるよ うにトリトンX-100を１％添加した滅菌生理食塩水で 適当に希釈（本実験では10倍∼107倍）した。１つの サンプルにつき３段階の希釈液をつくり，各希釈につ いて２∼３枚のプレートをつくった。

ｇｇｇｇｇ

ｏ５５００

１ １２ ト リ プ ト ン ｌ ｏ ｇ 酵 母 エ キ ス ５ ｇ Ｎ ａ Ｃ ｌ ５ ９ (ＮａＯＨでｐＨ7.0に調整） １ ． ３ 培 養 実 験 培養実験は，試験管による前々培養及び前培養とそ れに続くフラスコ培養により行った。試験管による前々 培養及び前培養は，Ｌ培地５ｍ'を使用して振鐙恒温槽 中（150rpm）５０℃で各々１０及び９時間行った。前々 培養においては，スラントからｌ白金耳接種し，前培 養においては，前々培養液を0.1m'接種した。 フラスコ培養実験には，容量5001Ｍのバッフル付き 三角フラスコを使用し，lOOm'の培地中に前培養液ｌ ｍ２を接種して開始した。所定温度に保ったロータリー １．４．２酵素活性 培養液上清（15000ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離）の希 釈試料とハマルステン氏法カゼインとのタンパク質分 解反応による遊離チロシン量を，チロシン溶液を基準 としたＯＤ"５（275ｎｍにおける吸光度）の検量線よ り決定した。 酵素活性の単位であるｌＵ（ユニット）は，３７℃で １分間に１幅のチロシンを遊離させる酵素（プロテアー ゼ）量である。 ２．結果及び考察 ２ ． １ 培 養 温 度 の 影 響 図ｌ及び２にＬ培地についての増殖及び酵素生産 特性を，図３及び４にＷＳＧ培地についての増殖及び 酵素生産特性を示す。培養温度40℃，５０℃，６０℃の３ つの場合について検討を行った。図５には培養温度５０ ℃におけるＬ培地及びＷＳＧ培地を使用した場合の 培養液ＰＨの経時変化を示す。対数期の増殖速度は， Ｌ及びＷＳＧ培地ともに温度が高くなるほど大きくな ト リ プ ト ン 酵母エキス ＮａＣｌ カ ゼ イ ン 寒天 薄 力 小 麦 粉 ３ ０ ９ 脱 脂 大 豆 ｌ ５ ｇ グ ル コ ー ス ｌ ｏ ｇ カ ゼ イ ン ４ ｇ Ｋ Ｈ ２ Ｐ Ｏ ４ １ ． ５ ｇ ＭｇＳＯ４．７Ｈ2００．５９ ＣａＣｌ２．２Ｈ2００．２９ (ＮａＯＨでｐＨ7.5に調整） 表３ＷＳＧ培地（蒸溜水11に対し）

200 上村他:槻性細菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUSYGl85の増剛び臓生蹄性に及ぼす温剛び培地組成の影響５９ 8000 １０

１０９８７６５４３

１１

２．２Ｌ培地中の窒素源の種類の影響 図６及び７に実験結果を示す。Ｌ培地中のTryp‐ toneを同量の他の窒素源（Soytone,CasaminoAc‐ ロ ロ ロ ● ● ● △●△△ △△△ ●囚

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増殖に及ぼす培養温度の影響（Ｌ培地）

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酵素活性に及ぼす培養温度の影響（ＷＳＧ培地） 図１ 図４ 図３ ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

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時間［h］

酵素活性に及ぼす培養温度の影響（Ｌ培地） ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

時間［h］

50℃培養におけるｐＨの経時変化

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［｜Ｅへの一一①。］遡鞠鐘堰 １０Ｚ る。死滅速度は，Ｌ培地では50℃＞60℃＞40℃の順で あった。ＷＳＧ培地では，４０時間の培養実験中に死滅期 に入ったのは60℃の場合のみで，４０及び50℃の場合は定 常期にあった。これ以後の実験はすべて50℃で実施した。 酵素活‘性については，Ｌ及びＷＳＧ培地ともに50℃ で最大となったが，ＷＳＧ培地の方がはるかに高い酵 素活性を示した。この原因としては，Ｌ培地中に豊富 に存在するアミノ酸による抑制が考えられる。一方， ＷＳＧ培地では窒素源が脱脂大豆であり，アミノ酸を 培地中に徐放するため抑制が起こり難く，酵素活'性が 高くなると考えられる。 1０９ １０８

０ ． 6０ ０ ids，Peptone，ProteosePeptone）に置き換え，計 ５種類について比較した。これら５種類の窒素源はす べてタンパク質の加水分解（消化）物であり，それら の原料及び消化法を表４に示す。増殖，酵素活性とも に窒素源としてSoytoneを用いた時に最大値を示し た。Soytoneは大豆タンパクの消化物であり，大豆 の成分が酵素生産に有効である可能性が示唆される。 1０

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検討するため，脱脂大豆を大豆消化物であるSoytone

あるいは脱脂大豆微粉末に置き換える実験を行った。 通常のＷＳＧ培地中の脱脂大豆を大豆タンパク質の 消化物であるSoytoneに置き換えた実験の結果を図 ８及び９に示す。増殖及び酵素活‘性の最大値ともに脱 ､０１ 1 ０ ２ ０

時間［h］

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９８７６５４３２

，︾ｎ︾︽Ｕ︽Ｕ︽Ｕｎ︾ｎ︾ｎ︾ ごＩ１８１０ごＩごＩ“Ｉ剣Ｉ己Ｉ 図 ６ 増 殖 に 及 ぼ す Ｌ 培 地 中 の 窒 素 源 の 種 類 の 影響（50℃培養） ０ １ ０ ２ ０ ３ ０

時間［ｈｌ

図 ７ 酵 素 活 性 に 及 ぼ す Ｌ 培 地 中 の 窒 素 源 の 種 類の影響（50℃培養） ● ● ● ● ［一三の一一①。］腿陶鐘個 ● 400 8000 酵素（パパイン） カゼインペプトンと獣 肉ペプトンの混合物 ●Tryptone oSoytone ▲CasaminoAcids △PeP1One pPro1eosePeplone ◎ ◎ ０ ． ０ ０ ０

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０ ０ ３ ２ ︷一Ｅへ．︸尊胆僻醗 鹿 児 島 大 学 工 学 部 研 究 報 告 第 ３ ４ 号 （ 1 9 9 2 ） ● ● 。 。 ▲ ▲ _▲ ０ ０ ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

日寺問［ｈｌ

図８ＷＳＧ培地において脱脂大豆→Soytone

とした場合の増殖特性

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図９ＷＳＧ培地において脱脂大豆→Soytoneとし た場合の酵素活性 ０

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6000 4000 ［一Ｅう︸埋胆僻鋤 表４各種窒素源の原料及び消化法 ▲ △ △

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窒 素 源 Tryptone Soytone Casamino Acids Proteose Peptnoe Peptone 消 化 法 酵素（パンクレアチン） 酵素（パパイン） 塩酸による加水分解 2000

６ｈおき ６，１２，１８，２４ｈ ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

時間［h］

図ｌＯＷＳＧ培地において脱脂大豆→脱脂大豆粉 末とした場合の増殖特'性 脂大豆を用いた通常のＷＳＧ培地の方が高かった。 lOOﾉαｍ以下にすりつぶした脱脂大豆を用いた培養 実験結果を図１０及び'１に示す。微粉末を用いた場合 の増殖及び酵素活′性は，通常のＷＳＧ培地の結果とほ とんど変わらなかった。 図９は，酵素活性に対する効果が「脱脂大豆＞脱 脂大豆の消化物」であることを示している。両者の 化 学 組 成 に 大 差 は 無 い と 考 え ら れ る こ と か ら ， 脱 脂 大豆のアミノ酸徐放蝋性もしくは脱脂大豆への好熱菌 の固定化効果が活性向上に大きく寄与していること が 推 察 さ れ る 。 後 者 の 固 定 化 効 果 に は ， 菌 体 と 脱 脂 大 豆 と の 物 理 的 接 触 効 果 と 物 質 移 動 抵 抗 に よ る 脱 脂 大豆中物質濃度制御の効果の２つの効果が考えられ る。図１１において，脱脂大豆そのまま（５ｍ程度の ブレーク）でも脱脂大豆を微粉末化したものでも酵 素活性に大差は無いことから，後者の濃度制御効果 は否定される。 2 ． ４ 窒 素 源 の 分 割 添 加 の 効 果 ２．４．１分割添加の効果 培養液中のアミノ酸濃度が高くなるとプロテアーゼ 生 産 を 抑 制 す る 作 用 が 菌 体 に 働 く と 考 え ら れ る こ と か ら ， ア ミ ノ 酸 濃 度 を 抑 え る 目 的 で 培 地 中 の 窒 素 源 (Soytone）の分割添加を試みた。表５に分割添加方 法を示す。培養実験の結果を図１２から１５に示す。どち らの実験においても分割添加による酵素生産‘性の向上 がみられた。 1０， １０８ １０７ １０６ １０５ １０４ １０３ １０２ ●◎ ●◎ ●○ ●。 ◎● ［一Ｅあ一一①。］遡陶埜個 表５Soytone分割添加における添加量及び添加時間 8000 Soyotone添加

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ｏ８ 培 地 Ｌ（Tryptone →Soytone） Ｌ（Tryptone →Soytone） 分割添加 WSＧ(脱脂大 豆→Soytone） WSＧ(脱脂大 豆→Soytone） 分割添加 ▲▲Ａ芯 ● Ｗ Ｓ Ｇ ｏＷＳＧ(脱脂大豆粉末） 上村他:好熱性細菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUSYGl85の増剛び職生離性に及ぼす温度及び培地組成の影響６１ Ａ

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［｜Ｅ一コ］埋照僻融 戸 言 １ ０ △ ▲ Ｗ Ｓ Ｇ △ＷＳＧ(脱脂大豆粉末） ｡０１ ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

時間［h］

図ｌｌＷＳＧ培地において脱脂大豆→脱脂大豆粉末と した場合の酵素活性 ０ １ ０ ２ ０ ３ ０

時間［h］

図ｌ２Ｌ培地（Ttyptone→Soytone）におい てSoytone分割添加が増殖に及ぼす影響

6２ l2hおき 12,24ｈ ２．４．２分割回数の影響 先の実験ではSoytone添加の分割回数を５回とし た。そこで次に分割回数が酵素生産性に及ぼす影響に ついて検討した。分割回数は３回，４回及び５回の３ 通りとした。表６に分割添加の詳細な方法を，図１６ に は 実 験 結 果 を そ れ ぞ れ 示 す 。 分 割 添 加 を 行 っ た 実 験では，分割回数に依らず，初期一括添加の場合よ りも高い酵素活性を示した。また４分割の場合に最 も高い酵素活性が得られ，ＷＳＧ培地とほぼ同等の 酵 素 活 性 で あ っ た 。 こ の 結 果 よ り 適 当 な 濃 度 で Soytoneを分割添加すれば脱脂大豆を用いた通常の ＷＳＧ培地と同等の酵素活性が得られることがわかっ た。 2000

1頁、忘司

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時間[h］

図ｌ３Ｌ培地（Ttyptone→Soytone）において Soytone分割添加が酵素活性に及ぼす影響

９８７６５４３２

，叩ｎＵｎＵ、ⅧｎＵｎＵｎＵ血Ｕ 利且利且■且■且利且日且■且日且 ８ｈおき ８，１６，２４ｈ 表６Soytone分割添加における分割回数，添加量 及び添加時間 ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

時間［h］

図ｌ４ＷＳＧ培地（脱脂大豆→Soytone）におい てSoytone分割添加が増殖に及ぼす影響 ●ＷＳG(SOyt.） ◎ＷＳG(Soyt,分割） Soyotone添加

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［一三の一一の。］遡髄鐘掴 培 地 ０ ◎ _０ WSＧ(脱脂大 豆→Soytone） WSＧ(脱脂大 豆→Soytone） 3分割 WSＧ(脱脂大 豆→Soytone） 4分割 WSＧ(脱脂大 豆→Soytone） 5分割

Ｏ●

。● 。● 。● 、己 鹿 児 島 大 学 工 学 部 研 究 報 告 第 ３ ４ 号 （ 1 9 9 2 ） ● Ｗ Ｓ Ｇ ▲ＷＳＧ(Soyt.） □ＷＳＧ(Soyt､３分割） △ＷＳＧ(Soyt、４分割） ○ＷＳＧ(Soyt，５分割） 1000 ● ● ０ ０ ６ｈおき ６，１２，１８，２４ｈ 8000 △ＱＵＯ 6000 ０ １ ０ ２ ０ ３ ０

時間［h］

図ｌ６ＷＳＧ培地（脱脂大豆→Soytone）におい てSoytone分割添加の分割回数が酵素活性に 及ぼす影響 ０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

時間［h］

図ｌ５ＷＳＧ培地（脱脂大豆→Soytone）において Soytone分割添加が酵素活性に及ぼす影響 ５０００ ー Ｅ

ヨ４０００

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6000 ● ２ ． ５ ロ ー タ リ ー シ ェ ー カ ー 回 転 数 の 影 響 フラスコ振鎧培養に用いたロータリーシェーカーの 回転数が酵素活性に及ぼす影響を図１７に示す。ロータ リーシェーカーの回転数の大小は菌体への酸素供給及 び培地中の脱脂大豆の粉砕と固体タンパクの溶解に影 響を及ぼすと考えられる。回転数が高いほど酵素活性 の最大値は大きくなった。 結 自 以上の実験結果から次のような結論が得られた。 l）Ｌ，ＷＳＧいずれの培地においても初期増殖速度 は温度とともに大きくなった。一方，酵素活性は ５０℃において最大値を示した。一般的に酵素活性 はＷＳＧ＞Ｌという傾向を示した。アミノ酸が抑 制的に働いたからと考えられる。 2）窒素源としては大豆が優れていることがわかった。 3）ＷＳＧ培地で脱脂大豆をSoytoneに置き換える と酵素活性は一般に低下したが，分割添加で回数 と間隔を選べばＷＳＧ培地と同等の酵素活性を示 すことがわかった。 4）ＷＳＧ培地の主たる窒素源である脱脂大豆が優れ ている点は，その成分のみならず，アミノ酸徐放 性を持つ点でもあることがわかった。 5）ロータリーシェーカーの回転数が高いほど酵素活 性 の 最 大 値 は 大 き く な っ た 。 こ の こ と か ら ， こ の 領域では，酸素供給速度が酵素活性に大きな影響 を及ぼすことが推察される。 6）ごく一部の実験結果を除き菌体数が酵素活性に正 の相関を持つことがわかった。 引 用 文 献 1）大島泰郎：“好熱性細菌"，東京大学出版会（1978)． 2）久保幹，肥後裕仁：東ソー研究報告，３３(2)， ｌＯｌ（1989)． 8000 △ ロ ●ロ 上村他:榊性細菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUSYG185の増剛び職生産鮒に及ぼす温剛び培地組成の影響６３ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ４ ２ Ｅ一コ］栽胆僻盤 ０ △ Ｒ △

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１ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

時間［h］

図ｌ７ＷＳＧにおいてロータリーシェーカー回転数 が酵素活性に及ぼす影響