雌性生殖細胞系列の全分化過程を体外培養下で再現
可能にする生理活性物質群の同定
著者
佐藤 英明
雌性生殖細胞系列の全分化過程を体外培養下で再現可能
にする生理活性物質群の同定
(研究課題番号084_56147)
平成8-9年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))
研究成果報告書
平成1 0年3月
研究代表者 佐藤英明
(東北大学農学部教授)
はしがき
個体の死を越えて生きながらえるために生物は生殖細胞をもつが､雌雄の性をもつ高等動物では受精
により次世代へ自らの生命を伝承するCすなわち精子と卵子の合体により肱をつくり､さらに始原生殖細
胞(primordiql gernl Cell,PGC)を誕生させる｡ pGCは生殖原基へ移動し､減数分裂に入り､精子､卵子
をつくり､受精へと進む｡このような生殖細胞系列の｢不死｣の流れが永続性のある生物を成すわけであ
るが､このような流れは現在のところ｡個体の力を借りてしか維持することはできない｡しかし､雌では
単為発生が可能になっており､雌性生殖細胞系列のみで全分化過程を体外で再現することが潜在的に可能
である｡体外で一連の流れが再現できるようになれば､個体に依存せずに生存し続ける新しい｢独立生命
体｣を手に入れることができる｡このようなことが可能になれば動物産業(畜産や実験動物分野) ､医療､
環境保全に貢献することになる｡本研究は､このような問題意識を背景に､雌性生殖細胞系列の全分化過
程を体外で再現可能とするために､卯形成､成熟､受精､初期発生､ pG〔の形成･増殖に係わる生理活性
物質の同定を行ったものである.研究栗の補助を受けた過去2年間の主な成果は次の通りである｡
1 )卵形成:卵巣の中の卵は｢受け身｣の存在で卵胞細胞によって制御されていると考えられてきた｡
しかし本研究の成果により卵子を見る目が変わりつつある.卵子は生理活性物質を分泌し､卵巣内現象を
｢能動的｣に調節していることを明らかにした｡卯丘のグリコサミノグリカン産生は卵子の分泌する蛋白
によって促進 され､卵胞周囲の血管形成や卯の生存を促進し､排卵へと導く｡一方､卯丘のヒアルロン酸
は､ CD4 4を介して卯成熟を促進する.また､哨乳類の卯形成の選択性は血管形成の偏りにもとずくこ
とや卵の死滅にかかわるfclsイqSリガンドの役割を明らかにした｡
2)卵成熟:性腺刺激ホルモンがMP Fを活性化するメカニズムには､哨乳類独特のものがあるこ
とを明らかにした｡成熟卵は第二減数分裂中期で休止し､排卵され､精子を待つが､この休止に⊂-mos遠
伝子産物のかかわることをノックアウトマウスを用いた実験で明らかにし､さらにC-mos欠損マウスでは
受精しても減数分裂から脱出できないことを示した｡ EG Fを含む卯成熟誘起培養液を開発した｡卵胞液
から卯成熟に伴う卵丘膨化に係わる因子を同定した.
3 )受精:精子卵子の接着から融合に至る過程の解析は､透明帯を除去した多数の卯が必要であった
り､同調化が難しかったりして､解析が困難であった｡本研究では､これらの困難を克服し､受精の膜融
合時に､卵子のインテグリン分子が直接精子と結合し､さらに精子結合部位へのインテグリン分子の集合
や細胞骨格蛋白の凝集が誘導されることを明らかにしている｡
4)初期発生:受精卵を培養すると動物種や系統に嫡有のステージで発生がブロックされることが多
い｡培養液からリン酸を除くとブロックは解除される｡弘達はAKR/Nマウスにおいて2細胞期で発生
がブロックされる現象を解析し､リン酸がc d c 2の脱リン酸を抑え､ MPFの活性化を抑制することを
示した｡なお､リン酸除去培地で培養した肱は正常に産子へと発育した｡
5) P GCの形成:体外で成熟､受精､発生させた肱盤胞から多分化能をもつ培養細胞を樹立した｡
以上の研究成果は､逐次､学会誌などに発表してきたが､本報告書には発表論文リストを挙げるとと
もに主な発表論文を収録する｡
弓-研究組織
研究代表者:佐藤英明(東北大学農学部教授)
研究経費
平成8年度 4800千円
平成9年度 2200千円
計 7000千円研究発表
(1)学会誌等
1) Amki ･K･ ･K･Noito･E･Soto,Y･Toyodo: Fertilizdtiondl C叩ClCity of mouse oocytes matured tn vitro:
EffeCt of PMSG,FSH and epidermol growth factor(EGF) in serum-free mdturqti.n medium. )･Reprod.Dev. , 42:29-33,1996
2) Orito･3･ ･E･Soto･S･Soburi･T･Nishido,Y･Toyodo: magnetic resonqnce tnlQging of the internal
structure of the mouse fetus･ Exp･Anim･ 1 45:171-174,1996
3)NQkqi･T･ ,Y･Miyomoto･T･NokdyOmd･N･MQndbe,H･MiyQmOtO,E･Sqto:Histologicql profiles of nuclear degenerotion of ooCytes in themouse ovqries and posible roles offollicle stimulating hormone for nuclear degeneration of ooCytes in the qtretiC FolliCles･ J･Momm･Ovo Res･ I13:24-29,1996
4) Miyomoto･Y･ ･T･NdkoyQmQ,S･HQmguChi.H･Miyomoto.EISoto: MorphologiCdl evoluQtion of
miCrovQSCulor networksondong10genic factors in the selectivegrowthoF oocytesond Foui⊂les
in the ovdries of mouse fetuses qnd mewborns･ Develop･Growth Differ･ ,38:291-Z9&,1996
5) HorqguChi･5･ ･K･Noito･S･AzumQ･E･Sqto･Y･NQgQhqmo,M･YomdShito,Y･Toyodq:Effects of phosph｡te on in vitro 2-cell block of AKR/N mouse embryos bcLSed on changes of the cdcZ kinose octivity ond phosphorylotion stclteS･Biol･Reprod･ ,5:598-603,1996
6) Nokoyomo･T･ ,M･Inoue･E･Soto: Effect of oocytectomy on glyCosominoglycon ｡ompostion during cumulus expansion of porcine Cumulus-ooFyte COmPlexes Cultured in vitro.
Biol.Reprod. ,55:129911304,1996
7)Ardki･K･ ･K･NQito･S･HQrOguChi･R･Suzuki,MIYokoyQmO,H･Inoue,S･AisowQ,Y.ToyodQ, E.SQtO: Meiotic
obnormctlities of ⊂-mos knockoout mouse oo⊂ytes:cICtivotion 8fter first metosis or entr□nCe
into third ∩-eiotic metqphose･BioLReprod･ 155:1315-1324,1996
8) HQrOguChi･S･,K･Nqito･E･Soto: Development in vivo of AKR/N mouse bldStOCyStS developed from
the 1-ceu stqge in a Phosphoteイree medium･J･Reprod･Dev･ I42:273127511996
9).KyuwcL,S･ ,Y･XidO,Y･ToyodcI.E･SQtO: ChQrCtCterizOtion of embryonic stem-like cell lines derived from embryotd bodies･ Exp･Anim･, 46:11116,1997
10) Inoue･M･ ,K･Ndito･T･NdkQyOmO･E･Soto: Mitogen-QCtivoted protein kindSe OCtivity and
-2-microtubule orgonizcttion Ore Ctltered by protein synthesis inhibition in mcLturing porcine oocytes.Zygote,4: 191-198,1996
ll)佐藤英明:異種臓器移植ドナーとしてのトランスジェニックブタの開発戦略.畜産の研究,
50:493-496,199612)佐藤英明:近未来の動物バイオテクノロジー.畜産の研究､ 51:3-8,1997,
13)小崎正巳･佐藤英明･山川宏人･雨宮 浩･三輪亮寿:異種移植(2). (座談会) orgQnBio1.,
3:17-34,199614) Izumi,T･ ,E･SdtO,H･Suzuki.,Y･Shimq･S･SdkcLkidd,J.Yoshimurq:An ollometric study on relating the growth of the follicle to that Of the oocyte in dairy cows with ovqriQn Cyst(S). J.Mdmm.Ova Res., 14:951101,1997
15) MotsunlOtO,K･ ,SIHoroguChi ,K･Miyoshi,A･Awoyo,E･SdtO-.EnhQnCement Of ovulotions by
odministrotion of a Pyrimidin compound with potentidting dCtivity oF ong10geneSis in mice superovutoted by PMSG clnd h(G.｣.Repl.Od.Dev.,43:137-141,1997
16) Doen,F･P"K･Miyoshi,EISoto: Foctor(S) in porcine foutculclr fluid arresting the induction
of cumulus expc)nsion of oocyte-cu一一1ulus complexes cultured in vitro.｣.Reprod.Dev. ,
43:165-170,1997
17) Mori,T･ ,jlP･Xu,E･Mori,E･SdtO,S･Sdito,M･W.Guo: Expression ofFcIS-Fcts ligondsystemQSSOCioted
with otresio through opoptosis in murine ovclry. Hormone Res.,48(supp1 3):ll-19,1997
18) Guo,M･W･, J･P･Xu,E･Mori,E･SQtO,∼.Sc]ito,∼.NdgCItO,T.Mori: Expression of fcIS ligqnd in murine
ovory regutoted by PMSG. AmJ.Reprod. Im111unO1. ,37:391-398,1997
19) Sdburi,S. ,S･Azumo,E･Soto,Y･Toyodd,(.Tochi :Developmentctl fate Of single embryonic stem cell
microinjeCted into 8-⊂eu stage mouse embryos. Differentiation, 62:1-ll,1997
20) Umezu,M. ,S･Kogdbu,J･Y･Jiong,E･Sctto:Bloodclinicdl vdluesond epididymol spermoCtivityinclged rdw rqtS:hereditary hypothyroid dwarf. Korecln J.Anim.Reprod. ,21(supp1.3):309-314,1997 21) Soto,EH'Oogenesis and oocyte mdturc]tion in monvnQIs: 8 1997 perspective . Koreqn J.
Anim.Reprod. , ZO:423-426,1997
22)佐藤英明:クローン羊.サイアス, 12:72-73,1997
23)佐藤英明:卵子の成熟･退化と排卵.受精着床誌. 14:ll-14,1997
ZS) Soto,E･ T･NokoydmO, H･Mcttsumoto, K･Miyoshi: Intrclovoridn regulators ofoogenesis clndoocyte
lllQturOtion in 1110mmOIs. Appl.Biol.S°i. , 3:1-16,1997
26)佐藤英明:動物バイオテクノロジーの開発課長臥 自書会関西支部報､ 136:30-32,1997
27) Motsumoto,H･ , N･Shoji, M.Umezu, EIScltO, ∼.SugdWCLrCl:OrgQnizdtion of microtubule clnd microfilofnent in rclt embryos during the two-Cell b一ock in 〉it:r･0. Korecln J.Anim.
Reprod. ,Zl(suppl.):208-212,1997
28) Inoue,M. ,K.Nclito,T.NclkclyOmO,E.Sclto:Mitogen-dCtivdted protein kincISe trOnSlocotes into the
gemlinol vesicle and induces gennindl vesicle breakdown in porcine oocytes.
･3-Biol.Reprod. ,58:130-136,1998
Z9) McISu,Y‥ S.Ikedd, E. Okudo-AshitokcI, E.Soto, S.Ito:Expression ofmurine novel zinc finger
proteins highly homologous to Drosophilo ovo gene product in testis･ FEBS Letters 421,ZZ4-ZZ8,1998
30) ScltO,E. , lく.Miyoshi:Oogenesis in mdn71Clls:ct 1997 perspective, In "Reproductive Biology
updctte-Novel Tool for Assessment of Environ-I-entCll Toxixity" edited by HIMiyomoto and N･MQnqbe, pp.93-103, NcLkonishi Printing (0.,Kyoto,1998
31) McItsumoto.H.. ∼.SugqwcLrCL, E.SdtO:In vitro developmentcIl block of rclt embryo induced by
phosphc)te. In ''Reproductive Biology Updclte-Novel Toot for Assessment of EnvironmentcLI
Toxisity〃 Edited by HIMiyomoto and N･MclbobeI PP･1471153･ NokclniChi Printing Co･ ,Kyoto.1998
(2)口頭発表
(ct)招待講演
1)佐藤英明:マウスの卵形成一研究の現状と動向.動物への遺伝子導入とその応用の開発研究会(第1回
定例会,東京, 1996)Z)佐藤英明:卵子の成熟･退化と排卵.日本受精着床学会(第1 4回大会,郡山1996))
3)佐藤英明:近未来の動物バイオテクノロジー.日本畜産学会関西支部近紗也区書炎話会(第34回書炎話
会,大阪, 1996)4) ScLtO,E. : In vitro production of porcine embryos: its recent development and constroins･ 4th
lnternotionoI Meeting 0n Biotechnotogy in Animal Reproduction (Bogor,1997)
5)佐藤英明:卵の生物学とバイオテクノロジー.高遠･分子細胞生物学シンポジウム(第19回大会､長
野県高遠町､発生･免疫･老化､要旨集､ p.1-∼,1997)
6)佐藤英明:異種臓器移植ドナーとしての遺伝子ノックアウトブタの開発課題と進展状況･移植遺伝子工
学研究会発足記念フォーラム(大阪､プログラム抄録集､ p.3,1997)
7)佐藤英明:高度な新技術の開発実用化の方向.東北地域農林水産ハイテク研究会畜産部会(平成9年
度､山形県最上町､要旨集､ p.lZ-17,1997)
8)佐藤英明:ブタ肱の体外生産:轟近の進歩と問題点山口大学農学部バイオテクノロジー学術講演会(山
口大学､ 1997)9)佐藤英明:マウス体外受精卵子の妊性について.日本不妊学会(第42回大会､東京､日本不妊学会誌､
4Z:Z76,1997)10)佐藤英明:動物バイオテクノロジーのフロンティアー21世紀の食糧生産･医療･環境修復を目指し
て.公開講演会(日本畜産学会主催､東京都教育委員会後援､ ｢暮らしの中の動物たち一動物の歴史
とフロンティア｣ ､ 1997ll)佐藤英明:家畜のクローン化と諸課題.市民フォーラム'97 (日本農芸化学会東北支部主催､宮城県
後援､ ｢遺伝子組み替え食品の現状と安全評価｣ ､ 1997)
-4･
b)一般発表
1)中山泰亮･佐藤英明:ブタ卯丘卵子複合体の成熟過程におけるヒアルロン酸結合蛋白質の動態･日本
畜産学会(第91回大会､名古屋､講演要旨集 pp･224,1996)
∼)松本和也･小島真一･佐藤英明‥垂精後初めてマウス1細胞期肱で発現する肱性由来遺伝子群の同定･
日本畜産学会(第91回大会､名古屋､講演要旨集 pp･288,1996)
3)内藤邦彦･佐藤英明:ブタ成熟卵に存在する成熟促進因子の検討･日本晴乳動物卵子学会(第37回大会､
東京､日本晴乳動物卵子学会托､ S18,1996)
4) NQkQydmQ,T. ,Znoue,M･ ,Soto,E･ :Effect of oocytectomy on gtycosominoglyCon synthesis during Cumulus expansion in porcine cul-lUlus-ooCyte complexes Cultured in vitro ･The 13th lnternotionol
(ongress on Animal Reproduction (Sydney,Austrdlio･AbstrdCt Vo112,p･10111･1996)
5) MdtSumOtO,K･ ,Kojimd,S･ ,SdtO,E･ :Identificdtion of zygotic genes octivdted in the mouse 1-ceu
embryo.The lath lnternotionqHongress on AnimoI Reproduction (Sydney, Austrdlio･Abstroct･
Vo1.∼,p.26-ll,1996)
6) Soburi,S.,AzuM,ら.,Soto,E･,TqChi,C･,Toyodo,Y.: Production dnd onolysis of germ line chimeros
derived FrorM Single ES ceu microin]ected into 8-ceu stage embryo of the mouse･ 29th An-1
Meeting of the society for the studyof Reproduction･ (Cqnddo,Biol･Reprod･ ･ Vol･54･Suppl･ ･1･ p.172,1996)
7)松本和也･佐藤英明･粟屋 昭:血管新生増強作用を持つ合成ピリミジン化合物MS-818によるマウス
誘起排卵の促進効果.日本生化学会･日本分子生物学会(第69回大会･第19回年会合同年会､札
幌､合同年会講演要旨集4-pO640,1996)
8)小島真一･松本和也･種村健太郎･佐藤英明:マウス1細胞期肱で発現する肱性由来遺伝子群の解析･
日本生化学会･日本分子生物学会(第69回大会･第19回年会合同年会､札幌､合同年会講演要旨集
4-p-0667 , 1996)9)笠井 研･相Jll順-･久和 茂.佐藤英明･塩田邦郎･小川智也:組換えラットIeu.kemiQInhibitory
F∝t｡｢の党規と糖鎖機能の解析.日本獣医学会(第1ZZ回大会､帯広､講演要旨集 pp･97,1996)
10)森 庸厚･許 継平･学 期･佐藤英明･斉藤 滋･郭 卯:マウス卵巣におけるFos-FdSligQndsystem
の発現とアポトーシスによる閉鎖卵胞形成.日本癌学会総会(第55回大会､講演要旨集 pp･60,1996)
ll) Monobe,N. ,SdtO,E･ ,Miyomoto,Y･ ,Enishi,0･ ･Sugimoto･M･ ･Miyomoto･H･ :Morphologicot Cnd
histochemi｡ol study of spermotogenesis in the testis oF Joponese wedSIs (Mustelct sibirico
itdtSi)I Steuite symposiu!n to the 8th AAAP･ Conservotion Biology for Human qnd Animal Living･
(wdkQyOmd,Jopdn,AbstrcLCt P･Z5-26, 1996)
112) Inoue,M.,Noito,K･,SdtO,E･: MAP kindSe OCtivotion in porcine oo｡yte mdturOtion･ The 8th AAAP
Animol science (ongress (Tokyo,Jopon,Proceedings,VoLZ,p･64-65,1996)
13) Horoguchi,S･ ,Noito,K･ ,Soto,E･ :Involve…ent ofphosphdte in2-eel btockQnd MPF activity ofAKR/N
mouse embryo.The8thAAAPonimoI ScienceCongress･ (Tokyo･ 3opQn･ Proceedings･Vo1-2, p･74-75･
1996)
-5-14)Xu,J-P. ,Guo,M-W. ,Mori,E. ,ScltO,E.,Sclito,ら. ,Mori,T. : Expr-essonofFosl.igclndmRNAinmurineovorLy.
JSIR, Zl:63-64,1996
15) SQt:0,E. : A new strldtegy for enhclnCement Of number of ovuldtions in ITIQnYllCLIs.3rd lntrnotionoI
Meeting on Biotechnology in AnimqJI Reproduction.((ctirl0,Egypt,Progrclm CLnd AbstrcLCt Book of Contrivuting Pclpers,p.ll,1996)
16) Tdnemur.0,K. ,Motsumoto,K. ,KurdmOtO,K.,Hoyoshi,Y.,SQtO,E. : Apoptotic germ ceu death in aged
mouse testis. 8th lnter-n8tiondl. (ongress on Cell Biology 良 30th AmericcLn Society for (ell
biology. AnnucLI Meet:ing. (ScLn FrQnSisco,USA,Hot.Biol.Ceu,Suppl.7,p.491ct,1996)
17) TQnemurC),K. ,McltSumOtO,K. ,KurcLmOt:0,K. ,HQyC)Shi,Y..ScLtO,E. : Telomer-oseoctivityin theelongoted
spermotids. XIVth Testis Workshop:Germ 〔en Development,Division,Disruption clnd Death.
(Bclltimore,USA,Finctl Progrclm Cnd Abstract Book,p.64,1997)
18)中山泰亮･佐藤英明:ブタ卯丘卵子複合体の成熟過程におけるCD4 4の役割.日本畜産学会(第
9Z回大会､川崎､講演要旨集､ pp.188,1997)
19)井上麻紀･内藤邦彦･佐藤英明: MAPキナ-ゼは卵核胞崩壊前に細胞質から核内へ移行し卵核胞崩壊
を誘導する.日本畜産学会(第92回大会､川崎､吉再演要旨集､ pp.189,1997)
28)中山泰亮･佐藤英明:卯成熟過程における卯丘膨化の役割.日本晴乳動物卵子学会(第38回大会､
盛岡､ J.Mclmll.Oval Res,.14.･S8,1997)21)三好和睦･佐藤英明:体外成熟/体外受精/体外培養により作出されたブタ肱盤胞のフィーダー細胞へ
の接着.日本受精着床学会(第15回大会､東京､プログラム･講演抄録集､ pp.122,1997)
22) TdkcLhQShi,Y. ,YcLmOkQWCL,N. ,Toyodcl,Y. , Furukowcl,K.,Soto,E. : A search For'the egg molecules
involved in speml-egg binding in mice. Both Annuql Meet:ing of Society for the Study of
Reprodutcion.(PorttcLnd,Oregon,USA,Biol.Reprod. ,56(Suppl.1):162,1997)
23) HdrCtguChi,∼. ,Noito,K. ,SdtO,E. : Relcltionship between phosphclte Cnd cell CyCle related proteins
in AKR/N mouse embryos･ Both Annuql Meeting of Society for the Study of ReproduCtion･ (Portldnd,Oregon,USA,Biol.Reprod.56(Suppl.1):190,1997)
24)許 紺平･李 糊･佐藤英明･斉藤 滋･郭 卯成･森 庸厚:マウス卵巣におけるFos/Fosligond
システムの発現とその閉鎖卵胞形成機序.日本免疫学会総会(学術集会記録､ 26巷pp.zzl,1996)
zS)佐藤ひかり･小林 仁･佐々田比呂志･高坂哲也･佐藤英明:間性ヤギにおける雄特異的DNA配
列の解析.日本繁殖生物学会(第90回大会､東京､講演要旨､ pp.65,1997)
26) Jiclng,J.Y., Miyoshi,K., Umezu,M., ScLtO,E.:in vitro fertilization ond development of
superovuldted oocytes derived from imnlOture rdw rots.日本不妊学会(第42回大会､東京､日
本不妊学会誌､ 42:374,1997)
(3)出版物
1)佐藤英明:卵子.新編畜産大事典,日本畜産学会編, pp.120-125,養賢堂. 1996.
2)佐藤英明:豊田 裕:畜産のバイオテクノロジー,動物生産乳大久保忠旦･豊田 裕･会田勝美編,
pp.Z81-299,文永堂, 1996
