制限酵素によるDNA消化条件の最適化

成 膜 大 学 理 工 学 研 究 報 告 J.Fac.Sci.Tech.,SeikeiUniv. Vo1.52No.1(2015)pp.27-28 (研 究 速 報)

制 限 酵 素 に よ るDNA消

化 条 件 の最 適 化

横 山 智 哉 子*1,依 馬 未 佳*2,小 川 有 貴*2,河 村 憲*2,小 林 汀 弥*2, 矢 島 知 佳*2,林 優 香 了*2,村 上 千 佳*2,森 裕 美*2,久 富 寿*3 OptimizationofDNAdigestionconditionswithrestrictionenzyme ChikakoYOKOYAMA*1,MikaEMA*2,YUkiOGAWA*2,KenKAWAMURA*2,SayaKOBAYASHI*2, ChikaYAJIMA*2,YukakoHAYASHI*2,ChikaMURAKAMI*2,YUmiMORI*2,HisashiHISATOMI*3 (ReceivedMarch182015) 1.背 景 分 子 生 物 学 の 基 本 操 作 と して制 限 酵 素 に よ るDNA消 化 が 挙 げ られ る。本 実 験 で はDNAの 消 化 率 の 向 上 の た め, DNA量,制 限酵 素 量,反 応 溶 液 量 お よび 消 化 時 間 にお け る至 適 消 化 条 件 を調 査 した 。 本 来,制 限 酵 素 活 性 の1U は,各 酵 素 反応 液50pL中,至 適 温 度 で1時 間 に1μgの λDNAを 完 全 に 分解 す る酵 素 量 と定 義 され て い る1)。一 方, 市販 の 制 限 酵 素 は10∼15U/μLの 濃 度 で あ り,そ れ 未 満 の 濃 度 で は 酵 素 の 希 釈 操 作 が 煩 雑 に な る。 本 実 験 で は 酵 素 希釈 を 回避 す るた め に1μLの 酵 素 を基 準 と して 各 反 応 に 用 い た。 また,制 限酵 素 に よ り消 化 され たDNAの 分 解 の 抑 制 は 以 後 の 実 験 に 必 須 で あ る。 しか し実 際 には 経 時 的 なDNAの 分 解 が知 られ てお り,そ の 分 解 の 程 度 は 保 存 条件 に よ り異 な る。本 実 験 で は残 存 率 向上 の た め,温 度, 日数 お よび塩 濃 度 に お け る至 適 保 存 条 件 を調 査 し,こ れ ら至 適 条件 の 調 査 に よ り実 験 に か か る時 間 の 短 縮 や 試 薬 の 無 駄 を省 く実 験 の 効 率 化 を 目標 と した 。 2.材 料 と 方 法 2.1制 限 酵 素 量,pUC19DNA量,反 応 溶 液 量 お よ び 消 化 時 間 に お け る 至 適 消 化 条 件 の 調 査 制 限 酵 素 はEcoRI,Hind皿,KpnI,PstI,焔 α1 (TAKARA.BIO)を 用 い た 。 消 化 対 象 はpUCIgDNA (TAKARABIO)と し,pUC19(100∼200ng)に 制 限 酵 素 Buffer(EcoRI15∼75U,1×HBuffer(50mMTris-HCl *1:物 質 生 命 理 工 学 科 助 教 *2:物 質 生 命 理 工 学 科 学 部 生 *3:物 質 生 命 理 工 学 科 教 授(hisatomi@st _{.seikei.ac.jp)} (pH7.5),10mMMgCl2,lmMDithiothreitol,100mMNaCl); HindMl5∼75U,1×MBuffer(10mMTris-HCI(pH7.5), 10mMMgCl2,lmMDithiothreitol,50mMNaCl);KpnI 10U,1×LBuffer(10mMTris-HCI(pH7.5),10mMMgCl2, 1mMDithiothreitol);PstIl5U,1×HBuffer;XbaI15U, 1×MBuffer)を 添 加 し,ブ ロ ッ ク イ ン キ ュ ベ ー タ ー を 用 い 37℃ で10∼60分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー ト後,反 応 溶 液 を80℃ で10分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し,酵 素 を 不 活 化 し た 。 そ の 後1%あ る い は2%ア ガ ロ ー ス ゲ ル に 供 し,電 気 泳 動 し た 。 イ ン キ ュ ベ ー ト 時 間,制 限 酵 素 量,pUCIgDNA量 あ る い は,反 応 溶 液 量 を 変 化 さ せ 電 気 泳 動 に よ っ て 至 適 条 件 を 調 査 し た 。 ま た 、 制 限 酵 素 お よ びpUC19量 を 変 化 さ せ,real-time PCRに よ り 消 化 率 を 測 定 し た 。制 限 酵 素 はKpnI,PstI, .thaIを 用 い た 。 消 化 対 象 はpUC19DNAを 用 い た 。 pUCI9(100∼200ng),制 限 酵 素Buffer(KpnI10U1×L Buffer;PstIl5U1×HBuffer;iYbaI15U1×MBuffer十 BSABuffer)を 反 応 溶 液 と し,上 記 と 同 じ 方 法 で イ ン キ ュ ベ ー ト し,電 気 泳 動 し た(Fig.a)。 電 気 泳 動 に よ りDNA の 消 化 を 確 認 し た 後,消 化 し たpUCl9(5pg),KAPASYBR FASTqPCRMasterMixお よ び10pMForwardprimer,10 pMReverseprimerを 混 和 し,95℃/25秒,60℃/25秒,72℃ /30秒 を1サ イ ク ル と し たreal-timePCR反 応 を40サ イ ク ル お こ な っ た(LightCycler⑭Nano/RocheDiagnostics)。 そ の 際,反 応 溶 液 を2種 類 用 意 し,一 方 に は,制 限 酵 素 切 断 部 位(multi-cloningsite)を 挟 む よ う に 設 計 し たForward primerAとReverseprimerBを,も う 一 方 に は,multi-cloning siteを 挟 ま な い よ う に 設 計 し たForwardprimerCとReverse primerDを 添 加 し た(Fig.b)。 反 応 終 了 後,得 ら れ たCt値 よ り コ ピ ー 数 を 算 出 し,消 化 さ れ た 割 合 を 求 め た 。 一27一

成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告 Vol.52No.1(2015.6)

a冠

ノ

禽攣

Fig.Electrophoresis(a)andprimersites(b) 2.2温 度,日 数,保 存 溶 液 に よ るpUC19の 残 存 率 一20℃,4℃,37℃ で 消 化 後 ∼7日 間 保 存 した 制 限 酵 素 消 化 産 物 を 電 気 泳 動 し た 。 ま た,pUCI9(900ng)を1×LBuffer,10×MBuffer,10×H Buffer,TEBuffer,注 射 用 蒸 留 水 に 溶 解 し 混 合 後(各 全 量 30μL),4℃ で 当 日∼7日 間 保 存 し電 気 泳 動 し た 。 3.結 果 3.1pUC19DNA量,制 限 酵 素 量,反 応 溶 液 量 お よ び 消 化 時 間 に お け る 至 適 消 化 条 件 の 調 査 pUC19の 量 を100∼200ngに 変 化 させ た 結 果,制 限 酵 素 1pL,反 応 溶 液 量10μL,反 応 時 間20分 に お い て100∼ 150ngのpUCl9で は 電 気 泳 動 で 消 化 が 確 認 さ れ た が,200 ngのpUC19で は 消 化 が 確 認 さ れ な か っ た 。real-timePCR に お け る 消 化 率 の 算 出 で も,100ngのpUCI9で は92%の 消 化 が 確 認 さ れ た が,150ngで は75%,200ngで は69%し か 消 化 さ れ な か っ た 。200ngのpUC19,反 応 溶 液 量20pL, 反 応 時 間20分 に お い て 制 限 酵 素 量 を1pL,3μL,5μLと 増 や し た 場 合,電 気 泳 動 に お い て す べ て 消 化 が 確 認 さ れ た 。 し か し,制 限 酵 素1μL,200ngのpUCI9に 対 して 反 応 溶 液 量10μLで は 消 化 が 確 認 さ れ な か っ た 。 こ れ に 対 し,反 応 溶 液 量30μLお よ び50μLで は 消 化 が 確 認 され た 。 制 限 酵 素(KpnI,PstI,1¥baI)1μL,反 応 溶 液 量10μL に お い て100ngのpUCI9の 消 化 率 は 消 化 時 間20分 と60 分 と に 差 異 は 確 認 さ れ ず,い ず れ も98%以 上 の 消 化 率 を 示 し た 。 た 。 これ に 対 し,4℃,37℃ で は 翌 日 に は30∼40%し か 残 存 せ ず,4日 目∼6日 目 に は 約10%の 残 存 率 と な っ た 。 ま た,制 限 酵 素Bufferで は,Mお よ びLBufferで は4℃ に お い て 翌 日 ま で は100%残 存 して い た が,HBuffer,TEBuffer, 注 射 用 蒸 留 水 で は 翌 日 に は50∼70%の 残 存 率 だ っ た 。 い ず れ の 保 存 溶 液 で も3日 目以 降 で は20∼40%の 残 存 率 を 示 し た 。 4.考 察 pUCI9は10μLの 反 応 溶 液 で は100ng程 度 が 至 適 量 で あ っ た が,pUC19の 消化 量 を増 や す に は酵 素 量 の増 加 で は な く,反 応 溶 液 の 全 量 の増 加 で 対 応 可 能 と判 断 され た 。 ま た,反 応 溶 液 が 増 加 して も制 限 酵 素 は1μLの ま ま20 分 で 消化 可能 と示 唆 され た。 消化 対象 に よ り,多 少 の 差 異 は想 定 され る もの の,市 販 され て い る制 限 酵 素 を過 剰 量使 用 す る場 合 は,20分 程 度 の 消 化 で 充 分 で あ り,オ ー バ ー ナ イ トに よ るpUCI9の 消 化 は,か えっ て 消化 率 お よ び残 存 率 を 下 げ る こ とに な る と推 測 され た。 ま た,本 実 験 で はTAKARABIO社 の 制 限 酵 素 を用 い た が,他 社 の複 数 の制 限酵 素 に よ り再 現1生を確 認 して い る。 今 回 の 結 果 はpUCI9の も の で は あ る が,他 のDNAで も同様 の傾 向 が 予 測 され た。 今 回 用 い た制 限 酵 素 処 理 産 物 もpUCI9も 温 度,日数 お よび保 存 溶 液 よっ て残 存 率 が 大 き く異 な っ た。DNAの 溶 解 液 と して一 般 に用 い られ るTEBufferで さ え も,4℃ で は pUCI9の 分 解 が 進 ん だ こ とか らも,冷 蔵 庫 に よ るプ ラス ミ ドの保 存 に は 注意 が必 要 と示 唆 され た。さ らに 一20℃で の保 存 で あ っ て もpUCI9で は4日 目以 降 の残 存 率 が 低 く, す ぐに使 わ な い 場 合 は一80℃で の保 存 を 推 奨 す る。 なお, 5回 の凍 結 融 解 の繰 り返 しに よ り凍結 融解 の影 響 を調 査 した(デ ー タ未 発 表)が,pUC19に 関 して は 量 の減 少 や 断片 化 は確 認 され な か っ た。

参考文献

1.タ カ ラ バ イ オ 制 限 酵 素 ハ ン ドブ ッ ク2011-2012 制 限 酵 素 の 使 用 に 関 し てp7 3.2温 度,日 数,保 存 溶 液 に よ るpUC19の 残 存 率 pUC19を 制 限 酵 素 で 消 化 後,-20℃,4℃,37℃ で 消 化 後 ∼7日 間 保 存 し た 結 果_{,-20℃ で 保 存 し た 場 合 が 電 気 泳 動} で は 最 も残 存 が 確 認 さ れ,2日 目 ま で は100%の 残 存 率 を 示 し た 。4日 目以 降 で は7日 目 ま で 約60%の 残 存 率 だ っ 一28一