IonTorrent RNA-Seq 解析概要 サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパンテクニカルサポート The world leader in serving science

•

この資料は、

IonTorrent

シーケンサーで

RNA-Seq

（

WholeTranscriptome

、

mRNA

、

ampliSeqRNA

、

miRNA

）解析

を実施されるユーザー様向けの内容となっています。

•

シーケンサー付属の解析サーバー内で可能な解析や出力ファイ

ルについての説明資料となります。

•

シーケンサー付属の解析サーバーでは、発現変動遺伝子の統計

学的比較解析や、

GeneOntology

（

GO

）・パスウェイ解析などを実

施することはできません。解析を行う際には、別途解析ソフトウェ

アをご用意いただく必要がございます。

資料概要

Unmapped

BAM

IonTorrent

での

RNA-Seq

解析の流れ

RNASeqAnalysis

プラグイン

プラグイン

プラグイン

プラグイン

3

rd

_party

Torrent Server

画面操作＆自動で解析

Fastq

Mapped

BAM

Gene

Expression

FileExporter

プラグイン

プラグイン

プラグイン

プラグイン

タグカウント、

RPKM

Transcript

Expression

RPKM

解析の流れ

マッピング

マッピング

マッピング

マッピング

発現量算出・

発現量算出・

発現量算出・

発現量算出・

正規化

正規化

正規化

正規化

発現比較

発現比較

発現比較

発現比較

統計解析

統計解析

統計解析

統計解析

GO

・パスウェイ

・パスウェイ

・パスウェイ

・パスウェイ

解析など

解析など

解析など

解析など

RNA-Seq

解析のためのソフトウェアの例

：有償

：無償

発現解析：

RNASeqAnalysis

プラグイン

【プラグインの処理概要】

・

“

STAR

”と“

Bowtie2

”によるスプライスジャンクションを考慮したマッピング

・

“

HTSeq

”による遺伝子ごとのタグカウント

・

“

Cufflinks

”による転写産物構造予測および発現量（

RPKM

）算出

・

TS5.2.x

では、

hg19

（ヒト）および

mm10

（マウス）のみに対応

＜解析パイプライン＞

RNASeqAnalysis

プラグインの自動実行設定

(1) Autorun

の設定

(2) Plan

作成時の設定

Autorun

の項目に✔

✔の部分をクリック

リファレンスを選択し、

Save

RNASeqAnalysis

プラグインの実行

(1)

トレントブラウザレポート画面の

Select Plugins To Run

ボタンをクリック

(2) RNA SeqAnalysis

をクリック

(3)

リファレンスを選択し、

Submit

をクリック

RNASeqAnalysis

プラグイン解析結果

・ランレポートの中部に結果が表示される

複数サンプルをまとめた解析結果の閲覧・ダウンロード

複数サンプルをまとめた統計情報

リードの分布情報

バーコード間の相関図とヒートマップ

Correlation Heatmap

Correlation Plot

Gene Heatmap Isoform Heatmap

002 001

001 002

複数サンプルをまとめた発現量データのダウンロード

・

Download absolute reads table

・

Download isoform FPKM values table

それぞれのファイルを

Excel

で開いた例

サンプル毎の統計情報・ダウンロードリンク

マッピングや

カバレッジ

解析結果

発現しているIsoform数（25以下）

3’

解析結果のダウンロードページ①

・

Download Output Files (page)

File Size Date File

347M Aug Chimeric.out.junction 2.6G Aug Chimeric.out.sam 20K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.RNAmetrics.png 2.9K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.RNAmetrics.txt 4.2G Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.bam 4.5M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.bam.bai 676K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.gene.count 107 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.bam 20K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.geneisoexp.png 1.3M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.geneisoexp.xls 28K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.geneisoexp_all.png 676K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.genereads.xls 4.6K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.generep.png 158 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.genes.fpkm_tracking 161 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.isoforms.fpkm_tracking 18K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.rnareads.png 111 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.rnareads.xls 150 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.skipped.gtf 930 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.stats.txt 154 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.transcripts.gtf 1.7K Aug Log.final.out 12K Aug Log.out 8.6M Aug SJ.out.tab 3.1G Aug alignedSTAR.bam

解析結果のダウンロードページ②

・

Download Cufflinks Output Files (page)

File Size Date File

5.6M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.genes.fpkm_tracking 25M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.isoforms.fpkm_tracking 0 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.skipped.gtf 305M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.transcripts.gtf

Cufflinks

により算出された

RPKM

（

FPKM

）

・

genes.fpkm_tracking

を

Excel

で開いた例

Ion AmpliSeq™ RNA

アンプリコンデザイン

•

１アンプリコン

/

遺伝子

•

exon-exon boundary

にデザイン

•

アイソフォームを見分けないようにデザイン

ターゲット遺伝子の発現解析に

ampliSeqRNA

プラグインの実行

•

検出された遺伝子の発現量を算出し、正規化（

RPM

：

Reads per million mapped reads

）

(1)

インストールされているプラグインのリストから、

ampliSeqRNA

をクリック

(2)

ライブラリタイプ

(Ion AmpliSeq RNA)

(3)

ターゲット領域

(6)

実行

(4)

不使用のバーコードをフィルターする場合にチェック

(5)

ライブラリ作製時に

ERCC

を添加した場合にチェック

ampliSeqRNA

プラグイン解析結果

統計情報

リファレンスに対してマップされたリード数

リファレンスに対してマップされたリード数

リファレンスに対してマップされたリード数

リファレンスに対してマップされたリード数

Log2 RPM pair correlation plots

smallRNA_Analysis

プラグインのインストール

(3)

プラグインの一覧画面右上にある“

Install or Upgrade Plugin

”をクリック

(4) Select File

ボタンから、

“

プラグイン名

.zip”

を選択し、

Upload file

ボタンをクリック

(2)

トレントブラウザにログインし、右上歯車マーク⇒

Plugins

を選択して

インストールされているプラグインの一覧を表示

(1)

下記

URL

よりダウンロード（

2017

年

3

月時点の最新版）

smallRNA_Analysis

プラグインの実行

プラグインスタート画面

“

Advanced Settings

”

Submit

をクリックすると解析がスタート

smallRNA_Analysis

プラグイン解析結果

smallRNA_Analysis

結果画面

FileExporter

プラグイン

•

Fastq

ファイルの作成、解析データの一括取得

(1) FileExporter

をクリック

(2)

出力ファイルや名前を設定

(3)

完了するとレポート画面から

fastq

ファイルを

ダウンロードできます。

RNASeqAnalysis_TopHat

プラグイン

【プラグインの処理概要】

・

“

TopHat2

”と“

Bowtie2

”によるスプライスジャンクションを考慮したマッピング

・

“

HTSeq

”による遺伝子ごとのタグカウント

・

“

Cufflinks

”による転写産物構造予測および発現量（

RPKM

）算出

・

様々な生物種に対応可能

＜解析パイプライン＞

＜要望に応じてリファレンス情報を追加＞

バイオインフォマティクス

コンサルティングサービス

•

“

PuTTy

”

SSH

で自

WindowsPC

から

Torrent Server

へアクセスし、コマンド操作などを行えるツール

http://www.chiark.greenend.org.uk/~sgtatham/putty/download.html

•

“

WinSCP

”

Torrent Server

にアクセスし、ドラッグ＆ドロップでファイルの移動が可能なツール

https://winscp.net/eng/download.php

•

“

IGV

”

BAM

ファイルを視覚化するためのツール。クオリティチェック、トラブルシュートの際に役立つ。

http://www.broadinstitute.org/igv/Genomes

•

テキストエディタ

あると便利なソフトウェア

Technical Support

Call 0120-477-392

[email protected]

営業時間：午前

9

時から午後

6

時まで

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