新規オピオイド製剤の創製と臨床開発 ( 新規 μ/δオピオイド二量体化受容体特異的アゴニストの開発薬剤耐性を起こさないオピオイド製剤の独自手法による新薬開発シーズ展開 ) 研究代表者 : 先端医療開発センター支持療法開発分野分野長上園保仁共同研究者 : 研究所がん患者病態生理研究分野研究

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新規オピオイド製剤の創製と臨床開発

（新規

μ/δオピオイド二量体化受容体特異的アゴニストの開発、薬剤耐

性を起こさないオピオイド製剤の独自手法による新薬開発、シーズ展

開）

研究代表者：先端医療開発センター支持療法開発分野分野長上園保仁共同研究者：研究所がん患者病態生理研究分野研究員宮野加奈子北里大学薬学部生命薬化学研究室教授藤井秀明

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医療用麻薬とオピオイド受容体

 現在、日本で使用できる医療用麻薬はモルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、メサドン、タペンタドールであり、鎮痛耐性および副作用出現の際に他の医療用麻薬に切り替えるオピオイド・スイッチングが推奨されている。  医療用麻薬はGPCRであるμ、δ、κオピオイド受容体（MOR、DOR、KOR）のサブタイプのうち、主にMORを介して鎮痛作用を発揮する。  現在のオピオイド製剤は長期使用では副作用・耐性が必発であり、耐性や副作用を起こしにくい医療用麻薬が求められている。オピオイド・スイッチング  各種医療用麻薬ごとに副作用の発生が異なる。（がん緩和ケアに関するマニュアル厚生労働省・日本医師会）  医療用麻薬（モルヒネ等）はMOR、DOR、KORにも作用し、鎮痛を引き起こすことがわかってきた。・ひとつのオピオイド製剤がさまざまな細胞内シグナルを引き起こす。モルヒネフェンタニルオキシコドンタペンタドールメサドン

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単量体GPCRを刺激しても細胞内シグナルは多彩である

- 各リガンドごとに細胞内シグナルが異なる—Biased Ligand —

Biased Ligand説に加え、異なるGPCRが二量体となる

二量体化

_{GPCRが創薬ターゲットとして注目される}

G-protein-dependent signalling Desensitization G-protein-independent signalling Endocytosis Ligand 3 Ligand 2 Ligand 1 G-protein-dependent signalling Endocytosis G-protein-dependent signalling G-protein-independent signalling Endocytosis (b) (a)

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二量体化GPCRが新たに引き起こす細胞反応

-細胞は二量体化GPCRを通してさらに細かく調節される-細胞反応受容体が量体化する事により獲得された特性リガンド認識の特異性・リガンド結合親和性の変化・二量体化受容体のみに結合する新たなリガンドの存在受容体活性化・互いの結合部位にリガンドが結合することによる細胞シグナル活性化の違いシグナルトランスダション・二量体化受容体のみが特異的に活性化される新たなシグナル機構トラフィッキング（細胞内受容体リサイクリング）・細胞膜への多様な受容体発現様式・異なる受容体インターナリゼーション/リサイクリング機構

Current Opinion in Pharmacology 2010, 10:53-58.

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新規受容体作動活性測定法：CellKey™ systemの原理

底部に電極を取り付けた専用プレートを使用し、その上に細胞を培養して電極間の電気抵抗（impedance）を測定する。この impedance は以下の影響を受け、共役するG蛋白質により異なるimpedanceの変化が検出される。 ①細胞間相互作用、②細胞接着性、③細胞形態、④細胞容積 vehicleに対する各濃度における imepdance変化の割合を定量 Time (s) Im pe da nc e (Δ Z ) 500 1000 1500 2000 -50 0 50 100 150 vehicle 10 pM 100 pM 1 nM 10 nM 100 nM 1 uM [ SNC80 ] injection -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 100 200 300 400 500 600 Log [ SNC80 ] (M) % o f ve hi cl e EC₅₀：44 nM Electrode Electrode Electrode Electrode Well Plate Electrode

CellKey™ 96-well microplate

Fig. 5. Principles of the CellKey™ system

T7-DOR細胞濃度曲線

Plate Well Electrode

CellKey™ 96-well microplate

ラベルフリーアッセイ

簡便＆ハイスループット

（薬物処置の自動化・

96 well plate assay）

リアルタイムで測定可能

新規GPCR作動活性測定法

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CellKey™ systemによる受容体活性評価

-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 100 200 300 400 500 600 Log[Agonist] (M) % o f c on tro l ( M a x-M in ) ( oh m s) SNC80 morphine fentanyl oxycodone Bottom Top LogEC50 SNC80 134.5 499.8 -7.354 morphine 95.18 268.2 -5.951 fentanyl 90.31 237.5 -6.748 oxycodone 60.11 ~ 11775 ~ 4.921 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Log[Agonist] (M) % o f c on tro l(M a x-M in ) ( oh m s) morphine fentanyl oxycodone Bottom Top LogEC50 DAMGO 119.8 425.9 -8.482 morphine 126.2 539.4 -7.346 fentanyl 139.9 529.2 -8.822 oxycodone 124.6 524.3 -6.914 DAMGO MOR DOR OR選択的アゴニスト：DAMGO dOR選択的アゴニスト：SNC80 kOR選択的アゴニスト：(-)-U50488H KOR -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 100 200 300 400 500 600 Log[Agonist](M) % o f c on tro l ( M ax -M in ) ( o hm s) U50488H morphine fentanyl oxycodone Bottom Top LogEC50 U50488H 115.5 531.8 -7.962 morphine 68.47 329.1 -6.037 fentanyl 76.02 242.6 -5.706 oxycodone 75.26 142.1 -5.224

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μ/δ二量体化受容体が

新たな創薬ターゲットとして注目されている

μ/δ二量体特異的リガンドの

開発が求められている

μOR、δOR単量体とは別のシグナルを介するμ/δ二量体受容体は、

オピオイド（モルヒネ）による耐性および便秘を引き起こしにくい

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本研究に着目した経緯

1. 構築したμ/δスクリーニング系でMolecular Libraries Probe Production

Centers Networksの有する335,461種をスクリーニングした結果、μ/δ

specific agonist

CYM51010

が見出された。

2. CYM51010

は細胞アッセイ系において

μOR、δOR（単量体）の両者に

親和性を示し、かつ

μ/δORに2〜2.2倍程度の高親和性を示した。

3. CYM51010

はモルヒネと同等の鎮痛特性を有していた（

in vivoモデル

動物）。

4. モルヒネ連投により作製したモルヒネ耐性マウスに

CYM51010

を投与

すると、モルヒネの効かない耐性マウスでも鎮痛効果を示した。

5. μ/δ-biased ligand CYM51010

はモルヒネ等と異なり、副作用を起こし

にくい、新しいタイプの鎮痛薬である。

by Gomes I, et al. Identification of a μ-δ opioid receptor heteromer-biased agonist with antinociceptive activity. Proc Natl Acad Sci USA, 110: 12072-7, 2013.

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μ/δヘテロダイマー安定発現細胞株の作製

下記ベクターをHEK293細胞にco-transfectionし、G418で薬剤セレクションを行い作製した。

HaloTag融合MOR発現ベクター＋ T7-tag融合DOR発現ベクター

作製方法

1) HaloTag Ligand、Tag抗体を用いた蛍光画像による細胞膜上の発現確認 2) CellKey™ _{systemを用いた各受容体の機能性確認}

発現確認方法

Halo _T7 MOR DOR

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染色結果

T7抗体 HaloTag AF488 Ligand marge HEK293 T7-DOR発現 HEK293 T7-DOR＋HaloTag-MOR 発現HEK293 #28 T7-DOR＋HaloTag-MOR 発現HEK293 #32

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CellKey™ systemを用いた各受容体の機能性確認

＜用いた細胞＞

HEK293細胞・・・negative control

HaloTag融合MOR安定発現HEK293細胞・・・MOR単独発現細胞 T7-tag融合DOR安定発現HEK293細胞・・・DOR単独発現細胞

HaloTag融合MOR＋T7-tag融合DOR安定発現HEK293細胞 #32

①Halo-MOR/T7-DOR

（#32）・・・MOR, DOR共発現細胞 MORとDORが共発現している安定発現細胞を作製 0 200 400 600 800 % o f c on tro l(M ax -M in )( oh m s) SNC80 1nM SNC80 100nM Halo-MOR T7--DOR HEK293 #32 vehicle DAMGO 10nM 0 200 400 600 800 % o f c on tro l(M ax -M in )( oh m s) SNC80 1nM SNC80 100nM Halo-MOR T7--DOR HEK293 vehicle DAMGO 10nM

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CellKey™ systemを用いた

CYM51010

のMOR及びDORに対する活性

SNC80．．．．． DORに選択的な作動薬

DAMGO．．．． SNC80程の受容体選択性はないが、MORに選択的な作動薬

CYM51010．．．MOR、DOR両者間でのEC50は同等、Emaxは各受容体選択的作動薬と同等

MOR DAMGO SNC80 ML335 EC50（nM） 13.2 92.6 392.5 DOR DAMGO SNC80 ML335 EC50（nM） 1178 7.3 707.8 （nM）に換算すると（nM）に換算すると FLAG-MOR -12 -10 -8 -6 -4 0 200 400 600 800 1000 1200 % o f c o nt ro l(M ax -M in )( oh m s) Log[Agonist](M) DAMGO SNC80 ML335 LogEC50 DAMGO -7.880 SNC80 -7.033 ML335 -6.406 Halo-DOR -12 -10 -8 -6 -4 0 100 200 300 400 500 600 700 Log[Agonist](M) % o f c on tr o l(M a x-M in )( oh m s) DAMGO SNC80 ML335 LogEC50 DAMGO -5.929 SNC80 -8.135 ML335 -6.150 実験日：2014-10-17-001（MOR）、003（DOR） CYM51010 CYM51010 DAMGO SNC80 CYM51010 LogEC50 -7.880 -7.033 -6.406

MOR DAMGO SNC80 CYM51010

EC50（nM） 13.2 92.6 392.5 DAMGO SNC80 CYM51010 LogEC50 -5.929 -8.135 -6.150 DAMGO SNC80 CYM51010 EC50（nM） 1178 7.3 707.8

MOR、DORに反応する

FLAG-MOR Halo-DOR

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Halo-MOR/T7-DOR発現細胞を用いたCellKey

TM

_assay

Halo-MOR/T7-DOR #32 Log[Agonist](M) -14 -12 -10 -8 -6 -4 0 200 400 600 800 DAMGO SNC80 ML335 Bottom Top LogEC50 DAMGO 92.98 516.6 -7.610 SNC80 86.45 630.4 -7.642 ML335 49.23 580.2 -5.885 Halo-MOR/T7-DOR #32 DAMGO SNC80 CYM51010 DAMGO SNC80 CYM51010 Bottom 92.98 86.45 49.23 Top 516.6 630.4 580.2 LogEC50 -7.610 -7.642 -5.885 T7-DOR＋HaloTag-MOR 発現HEK293 #32 CYM51010は μ/δに高い親和性を有するわけではない CYM51010は μ/δ、μ、δ受容体アゴニストである

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私たちが同定したSYK775の開発において

魅力となる点、およびAdvantageとなるポイント

1. μ/δ 二量体specificであり、μ、δ単量体およびκ単量体にはno-effectである。

2. Sci. Finderで構造検索するもヒット０。—

全く新しい化合物

3. Sci. FinderでPatent検索するもヒット０。—

物質特許取得の可能性あり

4. 創薬ネットワーク（AMED）への提案として魅力的な案件。

5. 疼痛関連製薬企業と別案件で、同アッセイ系を用いた

新型オピオイド鎮痛剤

の共同開発

を平成

29年度より行っている。

したがって創薬ネットワークを介さずとも同社への直接導出も可能か？

SYK775は

μ-δOR δOR μOR κOR

化合物μ-δOR活性順位 % of ML335 % of SNC80 % of DAMGO % of U-50488