膵癌の発生・進展に関与する遺伝子異常の解析
著者
堀井 明
(課題番号1247004夢
ー平成12年度∼平嘩吟年度科学研究費補助者(基盤研究B扮研究成果報告書/
平成14年 5身
研究代表者 堀井 附/
(東北大学大学院医学系研究科教斬
Eilノ`
( 1 )研究課題および課鬼番号
肺癌の発生･進展に関与する遺伝子異常の解析
(課題番号12470043)
(2)表患
平成12年度∼平成13年度科学研究費補助金(基盤研究(B) (2))
(3)研究代表者
堀井 明(東北大学 大学院医学系研究科 教授)
(-4)研究分担者
福重 真一(東北大学 大学院医学系研究科 講師)
星 雅人(東北大学 大学院医学系研究科 助手)
(5)研究経費
平成12年度 10,200千円
平成13年度 6,200千円
計 16,400千円
(6)研究発表(学会誌等への発表)
1) Yatsuoka, T., Sunamura, M., Furukawa, T., Fukushige, S., Yokoyama, T., Inoue,
HりShibuya, K., Takeda, K., Matsuno, S., and Horii, A. Association of poor
prognosis with loss or 12q, 17p, and 18q, and concordant loss of6q/17p and
12q/18q in human pancreatic ductal adenocarcinoma. Am. ∫. Gastroent. 95,
2080-2085, 2000
2) saito, A., Fumkawa, T., Fukushige, SりKoyama, S., Hoshi, M., Hayashi, Y., and
Horii, A. p24/TNG1-AL Tl and p47/TNG1-AL T2, distinctalternative transcripts
ofp33/TNGl. ∫. Hum. Genet. 45, 177-181, 2000
3) shinoura, N., Muramatsu, Y., Asai, A., Ham, S., Horii, A., Kirino, T., Hamada, H.
Degree of apoptosis induced by adenoviruS-mediated transduction of p53 or
p73alpha depends on the p53 status ofglioma cells. Cancer Lett. 160, 67-73,
2000
4) Sakamoto, Y., Taguchi, T., Honke, K., Korekane, H., Watanabe, HりTano, Yリ
Dohmae, N., Takio, K., Horii, A., and Taniguchi, N. Molecular cloning and
expression of CDNA encoding chicken UDP-GIcNAc: GIcNAcβ卜6(GIcNAcβ1-2)
-1-- ManαllR[GIcNAc to Man]β1 ,4〃-1--acetylglucosaminyltransferase VI･ J･ BioL Chem･
275, 36029-36034, 2000
5) Yuki, M., Yoshinaga, K., Yamakawa, H., Sakurada, KりSato, S., Yaj血a, A･, and Horii, A･ Structure, expression and mutationalanalysis of the hB危4Ggene on lOq
in the &equently deleted region in human endometrialcancer. Oncdl. Rep･ 7,
1339-1342, 2000
6) Piao, Z., Fang, W., Malkhosyan, S., Kin, H., Horii, A., Pemcho, M･, Huang, S･
Frequent丘･ameshi氏mutations of JtLZ in sporadic gastrointestinal and endometrial
carcinomaswith microsatelliteinstability. Cancer Res. 60, 4701-4704, 2000
_7) Kondo, E., Furukawa, T., Yoshinaga, K., Kijima, H., Semba, S., Yatsuoka, T･,
Yokoyama, T., Fukushige, S･, and Horii, A･ Not hMSH2but hMLHl is丘･equently
silenced by hypemethylation in endometrial cancer but rarely silenced in
pancreatic cancer withmicrosatellite instability. tnt. J. OncoL 17, 535-541, 2000
8) Hoshi, M., Shiwaku, H. 0., Hayashi, Y., Kaneko, Y., and Horii, A. Deletion
mapping of 14q32 in human neuroblastoma deRnes an 1100-kb region of common
allelic loss. Med. Pediat. Oncol. 35, 522-525, 2000
9) Nakagawara, A., Ohira, M., Kageyama, HりMihara, M., Furuta, S., Machida, Tり Takayasu, H., Islam, A., Nakamura, YりTakahashi, M., Shishikura, T., Kaneko, Y･,
Toyoda, A., Hattori, M., Sakaki, Y., Ohki, M., Horii, A., Soeda, E･, Inazawa, J･,
Seki, N., Kuma, H., Nozawa, I., and Sakiyama, S. Identi丘cation of the
homozygously deleted region at chromosome lp36.2 in human neuroblastoma･
Med. Pediat. Oncol. 35, 516-521, 2000
10) ohira, M., Kageyama, H., Mihara, M., Furuta, SリMachida, TりShishikura, T･,
Takayasu, H., Islam, A., Nakamura, Y., Takahashi, M., Tomioka, N., Sakiyama, S･,
Kaneko, Y., Toyoda, A., Hattori, M., Sakaki, Y., Ohki, M., Horii, A., Soeda, E･,
Inazawa, ∫., Seki, N., Kuma, H., Nozawa, Ⅰ., and Nakagawara, A. Identi丘cation and
characterization of a 500-kb homozygously deleted region at lp36.2-p36.3 in a
neuroblastoma cell line. Oncogene 19, 4302-4307, 2000
ll) Mayama, T., Fukushige, S., Shineha, R., Nishihira, T., Satomi, Sりand Horii, A･
Frequent loss of copy number on the long am of chromosome 21 in human
esophageal squamous cell carcinoma. Int. J. Oncol. 17, 245-252, 2000
12) semba, S., Ouyang, H., Ham, S.-Y., Kato, Y., and Horii, A. Analysis of the
candidate target genes for mutation in microsatellite instability-positive cancers
ofthe colorectum, stomach, and endometrium. tnt. J. Oncol. 16, 731-737, 2000
13) Ikeda, T., Yoshinaga, K" Suzuki, A., Sakurada, A., Ohmori, H., and Horii, A･
ノ`
cancer. Oncol. Rep. 7, 567-570, 2000
14) Kadota, M., Tamaki, Y., Sakita, I., Komoike, Y., Miyazaki, M., Ooka, M., Masuda,
N., Fujiwara, Y., Ohnishi, T., Tomita, N., Sek血oto, M., Ohue, M., Ikeda, T･, Kobayashi, T･, Horii, A･, an/d Monden, M･ Identi丘cation of a 7-cM region of &equentallelic loss on chromosome band 16p13.3 that is speci丘Cally associated
with anaplastic thyroid carcinoma. Oncol. Rep. 7, 529-533, 2000
15) Ikeda, T,. Yoshinaga, K., Semba, S., Kondo, E., Ohmori, H., and Horii, A.
Mutational analysis of the CTN∼Bl (β-catenin) geneinhuman endometrial
cancer: Frequent mutations at codon 34 that cause nuclear accumulation. OncoL
Rep. 7, 323-326, 2000
16)- Hoshi, M., Otagiri, N., Shiwaku, H. 0.,Asakawa, S., Shimizu, N., Kaneko, Y.,
Ohi, R･, Hayashi, Y･,and Horii, A･ Detailed deletion mapping of chromosome
band 14q32inhuman neuroblastoma de丘nes a 1.1-Mb region of commonallelic
loss. Br. ∫. Cancer 82, 1801-1807, 2000
17) Ishii, S., Ham, S., Shiiba, K., Mizoi, T., Okabe, M., Horii, A., Nagura, H･,
Matsuno, Sりand Sasaki, I. Amelic loss of the NFl gene in anal malignant
melanoma in a patient with neuro丘bromatosis type 1. Int. ∫. Clin. Oncol. 6,
201-204, 2001
18) Chen, Y. Z., Soeda, E., Yang, H. W., Takita, J., Chai,し., Horii, A., Inazawa, J･,
Ohki, M., and Hayashi, Y. Homozygous deletion in a neuroblastoma cell line
de丘ned by a high-density STS map spanning human chromosome band lp36.
Genes Chromosomes Cancer 31, 326-332, 2001
19) Kato, N., Kimura, K., Sugawara, H., Aoyagi, S., Ikeda, T., and Horii, A. Gemline
mutation of the PTENgene in a Japanese patientwith Cowden's disease. tnt. J.
Oncol. 18, 1017-1022, 2001
20) Kondo, E., Horii, A., and Fukushige, S. The interacting domains orthree MutL
heterodimers in man: hMLHl interacts with 36 homologous amino-acid residues
within hMLH3, hPMSl, and hPMS2. NucL Acids Res. 29, 1695-1702, 2001
21) Kaneko, K., Nagasaki, Y., Furukawa, T., Mizutamari, H., Sato, A., Masamune, A.,
Shimosegawa, T., and Horii, A.Analysis of the human pancreatic secretory
trypsin inhibitor (F57やgene mutations in Japanese patientswith chronic
pancreatitis. J. Hum. Genet. 46, 293-297, 2001
22) Chen, Y. Z., Hayashi, Y., Wu, J. G., Takaoka, E., Maekawa, K., Watanabe, N.,
Inazawa, )., Hosoda, F., Arai, Y., Ohki, M., Mizushima, H., Morohoshi, A., Ohira,
M., Nakagawara, A., Liu, S.-Y., Hoshi, M., Horii, A., and Soeda, E･ A
BAC-based STS-content map spanning a 35-megabase region of human
-3-chromosome lp35-p36･ Genomics 74, 55-70, 2001
23) Inoue･ H･, Furukawa･ T･, Sunamura, M･, Takeda, K･, Matsuno, S･, and辿垣L生
Exclusion of SMAD4 mutation as an early genetic change in human pancreatic
ductal adenocarcinoma. Genes Chromosomes Cancer 31, 295-299, 2001
24) Youssef･ E･ M･, Kaneko, K･, Yatsuoka, T･, Hayashi, Y･, Hoshi, M.,辿垣L生, and
Fun血wa, T･ Human BAC contig covering the deleted region in pancreatic cancer
at 12q21. DNA Seq. ll, 541-546, 2001
25) Makino, N･, Yamato, T., Inoue, H., Furukawa, T., Abe, T., Yokoyama, TH
Yatsuokn･ T･･ Fukushige･ S･･ 0rikasa, S･, Takahashi, T･, and Horii, A･ Isolation
and characterization of the human gene homologous tb the DT10SOPhna Headcase
(hdc) gene in chromosome bands 6q23-q24, a region of common deletion in human
pancreatic cancer. DNA Seq. ll, 547-553, 2001
26) sakurada･ K･･ Furukawa, T･, Kato, Y･, Kayama, T･, Huang, S., and辿L生JtIZ,
the retinoblastoma protein interacting zinc丘nger gene, is mutated in genetically
unstable cancers of the pancreas, stomach, and colorectum. Genes Chromosomes
Cancer 30, 207-211, 2001
27) sun, C･, Yamato･ T･･ Furukawa, T･, Ohnishi, Y･, Kijima, H., and迦L生
Characterization of the mutations of the K-ms, pS3, p16, and SMAD4 genes in 15
human pancreatic cancer cell lines. Oncol. Rep. 8, 89-92, 2001
28) semba, S･, Ham, S･-Y., Ikeda, H., and堕出し生Frequent nuclearaccumulation of
β-catenin (CTNNBl) in human pituitaⅣ adenoma. Cancer 91, 42-48, 2001
29) schutte, B･ C･, Carpten, J･ D･, ForuS, A･, Gregory, S. G.,吐出し生, andWhite P.
S･ Report of the sixth intemationalworkshop on human chromosome l mapping
2000 Cytogenet Cell Genet 92, 23-41, 2001
30) Duda, D･ G･, Sunamura, M., Lozonschi, LH Yokoyama, TH Yatsuoka, T., M｡t｡i,
F･, _florii, A" Tani, KりAsano, S., Nakamura, Y., and Matsuno, S. Overexpression of the p53-inducible brain-speci丘c angiogenesisinhibitor 1 suppresses e尻ciently tumour angiogenesis. Br. ∫. Cancer 86, 490-496, 2002
31) Le氏er, L P･, Funlkawa, T., Sunamura, M., Duda, D. GリTakeda, K., Kot｡buki,
N･･ Oshimura･ M･, Matsuno, S･, and Horii, A_, Suppression of the tumorigenic
phenotype by chromosome 18 transfer into pancreatic cancer cell lines. Genes
Chromosomes Cancer 27, 234-242, 2002
(7)研究成果
研究目的
ノ■
がんは遺伝子変異により生じるため､発がんの根底に関わる遺伝子異常を検討し､
発がん機構の解明を進めることはきわめて重要である｡肺癌はきわめて予後の悪い癌
であり､また､患者のQOLも悪い｡ーまた､治療方法も種々試みられているが､成果は上
がっていない｡本研究では､陣の発がんに関わる癌抑制遺伝子を中心に､癌遺伝子､
DNAミスマッチ修復異常の面からも検討を加え､ pathogenicな変異を明らかにし､それ
を応用した診断､治療法を開発することを目標としている｡また､近年言われている｢が
んの個性｣は､がんそのものの遺伝子変異､宿主の遺伝的バリエーションなどが関わ
っているようである｡現在､がんの個性に応じたオーダーメイド医療が目指されている
が､本研究の成果はそれにも貢献するものである｡
方法･結果･考察
これまでにわれわれが取り組んだゲノムワイドの解析から､障癌における高頻度欠
失領域を6箇所､高頻度増幅領域を2箇所同定していた｡具体的には1p､ 6q､ 9p､
12q､ 17p､ 18qの欠矢と8q､ 20qの増幅である｡まず､これらのうち､高頻度に欠失の見
られる領域のうち3か所(12q､ 17p､ 18q)の染色体欠矢が予後不良と相関することを明
らかにした｡これらの3箇所のうち､ 18qの欠失は陣の発癌過程で初期変化と考えられ
る結果を得ていた｡ 18qにおける標的遺伝子はSMAD4である可能性が考えられる｡ホ
モに欠失している陣痛株に正常SMAD4遺伝子を導入しても増殖能は抑制されなか
ったことをふまえると､ 18qの標的遺伝子はSMAD4以外である可能性も考えられた｡
そこで､陣の前がん病変と位置づけられる粘液産成障腫蕩(intraductal
papillary一mucinous tumor､ IPMT)を解析した｡その結果､ 18qの欠矢は高頻度に見ら
れ､欠失のfocusは且は4D4遺伝子近傍であったにもかかわらず､同遺伝子ならびにタ
ンパク発現には全く異常が見られなかった｡さらに､肝癌株に正常18番染色体を導入
すると､ SMAD4の異常の有無に無関係に増殖抑制効果が見られた｡このことから､
sMAD4近傍に未知の癌抑制遺伝子が局在し､この遺伝子機能の喪失が陣痛発生の
初期変化として重要であるという可能性が示唆された｡さらに､正常18番染色体を移
入した障癌細胞株は､移入前の細胞株と比べ転移抑制効果があることも認められた｡
18qの未知の候補がん抑制遺伝子の単離については､ revertantを得ることによるアプ
ローチを試みたが､現在までに得られず､難航している｡これと平行し､導入前後にお
いて発現の変化をきたしている遺伝子のスクリーニングをマイクロアレイを用いて行っ
ており､いくつかの遺伝子が得られた｡これらの発現変化の持つ意味合いについて評
価するため､更なる検討を加えている｡
肝癌における高頻度欠失領域のうち予後不良と相関する欠失領域のうち､ 12qにお
いては､ KRASのルートの下流でERKに特異的に働くphosphataseである
ー5-DUSP6/MKP-3が局在する｡陣痛では､ほとんどの症例においてKRASの異常が見ら
れるが､ DUSP6/MKP-3の発現もRNAレベルで高度に抑制されている｡そこで､免疫
染色により､切除標本を用いて検討したところ､陣のdysplasia/cisでは
DUSP6/MKP-3の発現の増艶が見られるのに対し､浸潤癌では発現が高度に抑制さ
れ､その傾向は､特に低分化型の癌において著名に見られた｡アデノウイルスベクタ
にDUSP6/MKP-3遺伝子を組み込み､障癌細胞に導入し､発現を復活させると､細
胞増殖は非常に抑制され､アポトーシスが誘導された｡このことは､本遺伝子を用いた
遺伝子治療が可能であるとの可能性を示しており､現在､マウスを用いて実験的治療
を試みている｡平行して､マイクロアレイを用い､ DUSP6/MKP-3を導入した後に発現
が変化する遺伝子の同定を試み､複数の遺伝子が候補として挙がっている｡これらの
-適伝子の発現変化の発がん-の関与につき､現在､検討を加えている｡
障癌はきわめて予後不良であり､手術を中心とし､補助療法を加えた様々な試みが
行われたが､成績の改善にはつながっていない｡遺伝子治療は､この状況を打開する
可能性がある｡また､がんの進展には血管新生が重要な役割を果たしており､遺伝子
治療を血管新生抑制の面から試みることは有益であると考えられる｡その場合､本来
陣では発現していない遺伝子であっても構わないはずである｡ BAIl (brain speci丘c
angiogenesis inhibitor 1)は本来脳で特異的に発現する血管新生抑制作用のある物質
であるが､これを導入すると血管新生が抑制され､腫癌細胞の増殖は抑制された｡実
用化-むけて､更なる検討が必要であるが､ tumor domancyの応用はがん細胞の増
殖制御にとって重要であり､陣癌のみならず様々ながんにおいての応用の可能性が
あるものと考えられる｡
多くの腫癌において異常が報告されている1p36-p135領域においてBACによる
contigを作成し､同領域の解析を進めた｡同領域に局在するJtIZ遺伝子はタンパクコ
ード領域にマイクロサテライトがある｡そこで､この遺伝子の変異を各種がんにおいて
検討したところ､胃癌､大腸癌､子宮内膜癌などのMSI陽性の癌で高頻度に異常が見
られるのみならず､これまでMSI陽性であっても標的遺伝子が不明であった陣痛にお
いても､本遺伝子の異常が同定された.このことから､ JiIZ遺伝子は､これらの腫癌に
おいて､発がん過程における1pの標的遺伝子である可能性が示唆された｡
hMLHlはHNPCCの最も頻度の高い原因遺伝子である｡この場合､ミスセンス変異
の解釈が重要であり､簡便かつ確実に､希な多型であるのかpathogenicな変異である
のかを区別できる方法が必要である｡そこで､高感度､高精度､容易､かつ安価に判
断できる方法が待ち望まれている｡われわれはyeastのtwo-hybridのシステムにより
検討を加えた｡この方法は容易かつ安価である｡結果として鮎se positiveは全く見ら
れず(高精度) ､きわめて高感度に異常を検出できた｡本方法は極めて優れていること
を示している｡
ノ`
