楽しくておもしろい研究!
著者
清水 透
楽しくておもしろい研究！
清水 透
多元物質科学研究所 有機・生命科学研究部門、生体高分子化学研究分野 大学院生命科学研究科・分子生命科学専攻 生体機能分子科学講座・生体機能分子設計 大学院理学研究科・化学専攻 生体機能化学講座・生体高分子化学清水研のモットー：!
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明るく、面白く、楽しく、世界で�通用する研究！!
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きれいな研究環境。! ! どんな結果も前向きに！�得られた結果は必ず論文に！! ! 学生のためには何でも親切に。�! ! 学生と教授は対等の立場。横から目線。! ! その結果、学生もいつのまにか増えた！� 我々の研究（生化学、酵素学、蛋白質科学）の進め方と目標 １。きれいな、楽しい環境で世界を目指す。 いつもぴかぴか！いつも明るく！ アメリカの研究機関はきれい。 「あ！きれいだ！」と思わず声が出るきれいさ、清潔さ。 女性が来たくなる雰囲気。男の匂いがしない環境。 片付ける習慣。 我々の研究（生化学、酵素学、蛋白質科学）の進め方と目標 ２。いつも最新の最先端の情報を得る。流行を追う。 毎朝９時(以前は8時 半)の勉強会。アイディアを思いついたら直ぐに開始。 英語論文の読み方を習う。 3。目標：研究している蛋白質について、良い雑誌に最低５報出して、英文の 総説を書き、国際会議に招待される。（その場合、学生も連れていく。） 毎週土曜日の研究報告会。 ドーナツ提供 4。できるだけ自前でする。共同研究（人の褌で相撲を取る）は最小限に。 5。修士の学生も人格を尊重し、先輩の手伝いでなくて、良い国際誌の第一著者 を目指す。Garbage J.も仕方ない場合もあるが・・・・・・・。 6。修士の学生も海外に積極的に連れて行き国際的に活躍できるように指導する。F584 W409 C415 Heme ! ヘム：血液の赤い色� ! ! ヘモグロビン＝酸素の運搬! ! ヘム：マグロの刺身の赤い色� !ミオグロビン＝酸素の貯蔵! ���! �� ヒラメやタイの刺身は赤くない。! � ヘム酵素・ヘムタンパク質の構造と機能の関係を解析 6 ! ! ! ! ! ! ! ! ! .!
本グループで研究してきたヘム酵素・蛋白質
（1）
ヘムが酸素を活性化する酵素�O-Oを解裂� チトクロムP450 薬物代謝、�副腎ホルモン合成� � 1975-1996����1994年から研究室担当� NOガス合成酵素(nNOS)� �� （2）ヘムセンサー酵素・蛋白質�ヘム基盤酸素センサー酵素（Ec DOS, YddV, AfGcHK）� ヘム制御キナーゼ（HRI）�
ヘム制御転写因子（NPAS2, mPer1, mPer2, mPer3）�
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P450はもう最先端分野でないと感じた。 P450の友人は多い。今でも親しい。 流行を追って、P450と同じ活性部位を持つ NOガス合成酵素 Nitric Oxide Synthase (NOS)
脳由来のNOガス合成酵素(nNOS)
NO : ( ) !
! Heme Fe(III)-S--Cys
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電子伝達に重要なテトラヒロドビオプテリン (H4B)とアミノ酸残基� Heme Y706 R414 W678 W676 F691 H692 Heme Y706 R414 W678 W676 F691 H692 H4B H4BDimer Interface of nNOS Heme Domain
The gray residues reside on one subunit and the blue residues reside on another subunit of NOS.
H-O-H
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nNOSのヘムドメインの二量体の接触部位!
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Selected Papers of NO gas and nNOS • 1) Nakano, R. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8570. 修士 • 2) Sagami, I., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 2105.
• 3) Shimanuki, T. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 26956. 修士
• 4) Daff, S., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 30589. • 5) Sagami, I. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 26150.
• 6) Kobayashi, K. et al. (2001) J. Biol.Chem.276, 39864. Pulse Radiolysis 人の褌
• 7) Sagami, I. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 30036. • 8) Rozhkova, E. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 16888.
• 9) Sørlie, M. et al. (2003) J. Biol.Chem.278, 48602. Low Temperature 人の褌
• 10) Sato, Y. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 8827.
• 11) Sagami, I. et al. (2002) Coord. Chem. Rev. 226, 179. Review
本グループで研究してきたヘム酵素・蛋白質
（1）
ヘムが酸素を活性化する酵素�O-Oを解裂� チトクロムP450 � � NOガス合成酵素(nNOS)� � ��大学院生命科学研究科の創設 (2001年)�学生がどっと増えた！� �� （2）ガスセンサー、ヘムセンサー酵素・蛋白質�ヘム制御リン酸分解酵素（Ec DOS, YddV, AfGcHK)� ヘム制御キナーゼ（HRI）�
センサードメイン (ヘム) 機能ドメイン タンパク質 構造変化� センサードメイン (ヘム) 機能ドメイン DNA結合触媒反応、� ガスがSignal信号
(O2, NO, CO etc.) or redox state Gas-sensor proteins�ガスセンサー酵素・蛋白質� FixL, HemAT, sGC! CooA, Ec DOS! ! sGC NO ! ! センサードメイン� 機能ドメイン タンパク質 構造変化� センサードメイン ヘム結合� 機能ドメイン 触媒やDNA結合�の制御� Heme-sensor proteinヘムセンサータンパク質 ヘムが� Signal信号� Fe
!
センサードメイン (ヘム) 機能ドメイン タンパク質 構造変化� センサードメイン (ヘム) 機能ドメイン DNA結合触媒反応、� ガスがSignal信号(O2, NO, CO etc.) or redox state Gas-sensor proteins�ガスセンサー酵素・蛋白質� FixL, HemAT, sGC! CooA, Ec DOS ! O N N N N NH2 OH OH H2C O P -O O O-O N N N N NH2 OH O H2C P -O O O
3’, 5’-cyclic AMP! 5’-AMP! Ec DOS (Fe2+)!
��ヘムセンサー酵素であるEc DOSが触媒する反応
� � �Escherichia coli Direct Oxygen Sensor (Ec DOS)� � �� � Ec DOS (Fe3+)! ヘムの酸化還元状態が反応のスイッチon/offをする ! Fe2+: Fe3+: ! CO NO
!
Ec DOS : Escherichia coli Direct Oxygen Sensor�
cyclic-di-GMP (c-di-GMP)! linear-di-GMP (l-di-GMP)!
Ec DOS Fe! Fe! <Full-length>! Fe! Fe! <PAS-A domain>! 四量体� 二量体� ! ����
酵素Ec DOSの全体の構造
離れたドメインにあるヘム鉄の酸化還元状態が別のドメインの酵素反応を制御する。しかし、 離れているのに、どうして制御されるのか？ 蛋白相互作用の役割は？�
Fe!PAS-A PAS-B Phosphodiesterase
Ec DOSの論文
1). Sasakura, Y. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 2382.�修士
2). Sato, A. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 32650. 人の褌
3). Yoshimura, T. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 53105. 4). Taguchi, S. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 3340.��修士
5). Kurokawa, H. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 20186. 6). Sasakura, Y. et al. (2005) Acc. Chem. Res. 39, 37. Review
7). Tanaka, A. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282, 21301.
8). El-Mashtoly, S. F. et al. (2007) J. Am. Chem. Soc. 129, 3556. 人の褌
9). El-Mashtoly, S. F. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283, 19000. 人の褌
これら以外に17報の論文 � � � � � � J. Biol. Chem.などに5報(人の褌も入れて)以上報告し、英文の 総説も書き、国際的に認知された。悪口も言われるようになっ た。 � ���
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21!
dos (yddU)!
yddV!
yddV
and
dos
are organized as a bicistronic operon.!
2 GTP! DGC! PDE!
pGpG!
DGC: Diguanylate cyclase! PDE: Phosphodiesterase!
signal! signal!
c-di-GMP!
YddV!
DOS!
biofilm!
motility!
c-di-GMP metabolism in
E. coli
Function of YddV!Sensor domain GGDEF sequence ! O2� Signal DGC domain Globin! fold 2GTP! c-di-GMP!
Kitanishi, K. et al. Biochemistry 49, 10381 (2010).�
苦労した！! 難しい！! 4年掛かり!! 他から出た！� Histidine kinase (HK)! Response regulator (RR)! His183
�
Asp52� Asp169� 382 aa ! 238 aa ! GcHK! Anae109_2438! Anae109_2439! Fe! Slime bacteria! Anaeromixobacter sp. Fw109-5 ! Anaeromixobacter dehalogenans! Myxococcus xanthus! ATP! - P� - P� - P� O2! ADP! globin! Rec! Histidine kinase ! Rec!AfGcHK�
Kitanishi K. et al. !
J. Bio. Chem. 286, 35522 (2011)!
北西：総長賞、DC2, PD�
これが唯一独創性�
研究費を獲得するのに微生物はだめ！!
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医者が全く興味を示さない！!
病気に関係ある人など哺乳動物の生化学。!
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科学研究費（A）とか（S）はとれたが・・・・、!
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研究は非常に難しかった！!
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センサードメイン� 機能ドメイン タンパク質 構造変化� センサードメイン ヘム結合� 機能ドメイン 触媒やDNA結合�の制御� Heme-sensor proteinヘムセンサータンパク質 ヘムが� Signal信号� Fe
!
SOUL�
Sato, E. et al. Biochemistry 43, 14189 (2004).
修士�
網膜、松果体�
赤血球でのHRIの働き
赤血球で、ヘムの濃度に反応して、 HRIはヘモグロビンの蛋白の合成 を制御する。� Fe! HRI! eIF2α! globin! Hb! 血液の病気の時! HRIはeIF2αをリン酸化する。� Fe! HRI! eIF2α! globin! Hb! 健康の時! �HRIの反応は停止。� Inhibition! inhibition! HRI P! P eIF2α! 28! NTD ! Fe! Fe! Fe!HRI
はヘムセンサー酵素
Kinase! insert! NTD ! Fe!ヘムが十分な濃度。
ヘムが活性部位に結合
して活性がない。�
血液の病気の状態
ヘムの濃度が低い。
ヘムが活性部位から離脱
して活性が出る。
健康時�普通の状態�
Kinase! insert!NTD NTD Igarashi, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 15752.
�
Miksanova, et al. (2006) Biochemistry 45, 9894. Igarashi, et al. (2008) J. Biol. Chem. 283, 18782. ! ! これ以外にたった5報の論文。! ! 10年間でこれだけしか出なかった！! ! 難しかった！! ! 学生が心の病になった！� � サーカディアンリズム体内時計 ‒ １日の周期 Sleep Feed Awake Photo:http://www.ngrl.co.jp/koutarou 研究費を稼げた・・が？学生はこれをやりたがった・・が？� 時計遺伝子の働く仕組み SCN
E-box per, cry
Negative factor
BMAL1 CLOCK
Forebrain
E-box per, cry
BMAL1 NPAS2
BMAL1-NPAS2-DNA(E-box)相互作用の解析�
Uchida et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 21358. 人の褌!
もっと難しかった！学生は（心の病？）苦しんだ！�
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Heme!E'box!
NPAS2 mPer2! Forebrain! BMAL1 Transcrip;on! Transla;on! 体内時計Circadian Rhythmsの機構! Heme!Kitanishi, K. et al. Biochemistry 47, 6157 (2008).���修士��
Editor-selected Papers in Cell Biology from Biochemistry 17/1800
博士でのこの仕事の継続を嫌がった！��正解だった！
�
Only One in the World ➾
腰砕け！
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�
HRI, NPAS2, mPer1, mPer2 Heme-sensor Proteins! Fe(III) heme-S-Cys, Heme dissociation, Heme transfer, !
Redox dependent ligand switching ! !
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我々の時計遺伝子の論文はたった4報。時計遺伝子の生化学は難しい！! 悪口も書かれる。�Review2報, Book Chapter2報を書いてこれは終り。! !
Gordon Research Conference Tetrapyrol Newport, RI! “Heme-binding Proteins Associated with Circadian Rhythms”! !
J. Biol. Chem. （アメリカ生化学・分子生物学会誌） Editorial Board!
Biochem. J. （イギリス生化学会誌） Editorial Pannell
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Original papers 148 (+22+17), Citation number: >2084!
我々の研究（生化学、酵素学、蛋白質科学）の進め方と目標 １。きれいな、楽しい環境で世界を目指す。いつもぴかぴか！いつも明るく！ ２。いつも最新の最先端の情報を得る。流行を追う。 毎朝９時(以前は8時 半)の勉強会。アイディアを思いついたら直ぐに開始。 英語論文の読み方を習う。 3。目標：研究している蛋白質について、良い雑誌に最低５報出して、英文の総 説を書き、国際会議に招待される。（その場合、学生も連れていく。） 毎週土曜日の研究報告会。 ドーナツ提供 4。できるだけ自前でする。共同研究（人の褌で相撲を取る）は最小限に。 研究費の申請には自分達の論文だけ使う。褌の論文を使わない。 5。修士の学生も良い国際誌の第一著者を目指す。Garbage J.も仕方ない場合も あるが・・・・・・・。 論文は教授が書いてあげる！これできないと沈没！ 6。修士の学生も海外に積極的に連れて行き国際的に活躍できるように指導する。
Only One in the Worldを目指す。分野を創造する。➾腰砕け！
佐藤裕子��� 2002年国際NO学会 (プラハ、チェコ） " ����� � 「第1回 Young�Investigator Award」�������" 吉村登紀子 � 2005年生命科学研究科「科長賞」" ! � 2004年生命科学研究科「黒田チカ賞」" 五十嵐城太郎 2004年東北大学「総長賞」" ������ 2002年東北生物物理奨励会「学生優秀発表賞」" 笹倉由貴江 2005年理学研究科「黒田チカ賞」" 千田倫子 2005年東北生物物理奨励会「学生優秀発表賞」 �唯一の修士の賞�" ! ! ! ! ! ! !�修士の賞は難しかった！" " 北西健一�� 2007年チトクロムP450国際会議（ブレッド、スロヴェニア）" ����� �「優秀ポスター賞」"
�� Editor-selected papers in Cell Biology from Biochemistry 17/2400" �� 東北大学国際高等教育機構博士研究教育院生、学振DC2、海外PD" �「東北大学生命科学会長賞」、「青葉理学振興会賞」、" ! � �及び「東北大学総長賞」のトリプル受賞" " !����"
分野/研究室を変更する重要性�!
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有機化学 !TU ! ! 自分にはまったく合わない。! ! 生物物理化学 TU��� 思い上がり（慢心）。共同研究(人の! ���������� 褌)の甘いわな。�Garbage Journals! ����������� の甘いわな。しかし、後で生きた。! ����������� PD探しで苦しむ。! ! 物理化学アメリカ AECOM 思い上がり。共同研究(人の褌)の! ������������ 甘いわな。! ! 生化学 KU ! ! ! 初めて自分のバカさを思い知る。! ! ! ! !�非常に貴重な経験。 今に生きる。! ! ! ! !�できるだけ自分でする方向へ。! !グチ・文句ばかり言わないで、自分で切り開こう！! ! [グチ・文句や人の悪口ばかりの2次会には出ない！]! ! 人のためにする、汗をかく、と後で得をする。! ! 日本語の解説や総説はほどほどに！! ! 日本の学会の仕事はほどほどに！! ! いつも前向きに！ ��世界を目指そう！! ! 学生の質も上がり、学生の人数も増えた！�
Charles 大学（カレル大学）の理学部・生化学教室! ! ヘム基盤酸素センサー酵素の構造と機能の研究! ! ヨーロッパ(フランス、イギリス、キプロス)内! 共同研究体制(人の褌)のお手伝い! ! Reviewを書く サバティカルの雰囲気で! ! プラハ(チェコ)：世界遺産の町 � 2012年5月以降は� Jagiellonian大学（ヤゲロニアン大学）の生化学/生物物理/! バイオテクノロジー学部・医工学教室 ! ! コペルニクス、ヨハネ・パウロ2世の出た大学! ! 専門について秋に90分の講義を15回予定! ! クラクフ(ポーランド)：世界遺産の町��! ! アウシュビッツ(世界遺産)へバスで1時間! 2012年10月以降は�
