130 埼玉医科大学雑誌 第44巻 第2号 平成30年3月
学内グラント
報告書
緒 言
扁桃体は動物の情動を司る脳部位であり，特に恐怖・ 不安やストレスなどの負の情動との関わりについて多く の研究が行われてきた．古典的な恐怖条件付け実験では， ネズミに音を聴かせながら電気ショックを与えると，翌 日には音を聴かせるだけで硬直状態に陥ることが確認さ れている．そして硬直時間を計測することで恐怖記憶獲 得の程度を測る指標としてきた．またこの操作は扁桃体 外側核の錐体細胞と，聴覚情報を伝える視床由来の入力 線維との間に長期増強現象を引き起こすことが知られて おり，この現象は恐怖記憶獲得の細胞モデルであると考 えられている．
一般に記憶は獲得して以降に自由に想起できるように するために，記憶を脳内に固定する必要がある．その際 に睡眠時における低周波の律動的活動（オシレーション） が重要であることが示唆されている．実際，ノンレム 睡眠中の人間・動物の脳に1 Hz程度の周期的な電気刺 激を与えることによって海馬依存的な陳述記憶が向上 した，視床と皮質間で長期増強様の変化が生じたなどの 報告がなされている．一方，扁桃体では電気刺激による 記憶の増強の例はないが，錐体細胞がノンレム睡眠中で のみ1 Hz程度の頻度で発火している，個々の扁桃体基底 外側核の錐体細胞が周辺の抑制性介在ニューロンから
0.1 - 3 Hzの周期的な入力を受け取っているなどの報告
がある．これらのうち，スライス標本上で観察された抑 制性入力のオシレーションは複数の錐体細胞間で同期し ていて，発生・維持には外部ではなく内部の興奮性入力 を必要としている．最近，我々の研究室ではこのオシレー ションが急性の断眠ストレス負荷によって減弱すること を示してきた．この現象はin vitroのスライス標本で確 認されたものであるが，ストレス負荷直後のラットから 得た脳を使っているため，生体内でも同様の変化が起き ていたと予想される．
本研究ではラットの恐怖条件付け学習が，その前後に おいて断眠ストレス負荷による扁桃体の抑制性オシレー ション減弱を起こしていた場合に，どのような影響を受 けるのかを解析する．それによって扁桃体における遅い オシレーションの生理的意義について考察することを試 みる．
材料と方法
全ての実験は埼玉医科大学動物実験指針に従い，埼玉医 科大学動物実験委員会の承認を得て行われた．実験動物の 使用数は必要最小限となるように努めた．
恐怖条件付け記憶学習の実験は3日間にわたって行わ れる．まず初日，生後3〜4週齢のラットをFear Condition実 験用ケージに入れ，3分間その環境に慣れさせた．その直後 に1 kHz・65 dB・10秒間の音を鳴らし，それを70〜100秒 間隔で5回聴かせているときの様子をビデオカメラで撮影 した．2日目，ラットを再び実験用ケージに入れ，3分間自 由に行動させた後に前日と同じ音を鳴らし，その9秒後に 卓上型ショッカースクランブラーを使って1 mA・1秒間の 電気ショックを与えた．この音と電気ショックの組み合わせ を70〜100秒間隔で5回繰り返した後，ラットを再び3分間 自由に行動させた後で本来の飼育ケージに戻した（図1）．そ れから24時間後，実験用ケージとは異なる形・色・材質の ケージにラットを入れて3分間自由行動させ，その直後に 10秒間の音を聴かせ，それを70〜100秒間隔で5回繰り返
した．この音を聴かせている時の様子，特に10秒間のうち 硬直している時間は何秒かをビデオカメラで解析し，5回分 の合計硬直時間を恐怖記憶の獲得・固着率として定義した． また一部のラットは恐怖条件付け実験を行う前，あるい は行った後のいずれかの時間に急性断眠ストレスを負荷 した．断眠ストレスは水深2〜3 cmの水と，同じ高さの小 型プラットフォーム（直径4 cm程度）を設置した飼育ケー ジにラットを午前中3時間（8:30〜11:30）居住させることに よって行った．なお断眠の後に恐怖条件付け学習を行う際 には，ラットを乾かすために本来の飼育ケージに10分間 居住させ，それからFear Condition実験用ケージに入れた．
平成
28
年度 学内グラント報告書
遅い抑制性オシレーションと断眠ストレスが扁桃体依存的な記憶に与える影響
研究代表者 橋爪 幹 （医学部 生化学）
131 遅い抑制性オシレーションと断眠ストレスが扁桃体依存的な記憶に与える影響
埼玉医科大学雑誌 第 巻 第 号 平成 年 月
© 2018 The Medical Society of Saitama Medical University http://www.saitama-med.ac.jp/jsms/ 結 果
ラットをFear Condition実験用ケージに入れて3分間自 由に行動させると，新規の環境に対して盛んに探索行動 を行っていた．具体的にはケージの壁に沿って歩行・走 行する・ケージの隅に鼻先を突き込みながらヒゲを盛ん に動かして空間を認知する・後肢で立ち上がって垂直方 向を探索する・あるいは移動を停止してグルーミング（毛 づくろい行動）を行っていた．この行動傾向は10秒間の音 を聴かせている時にも変わらず観察された．一部の動物 は音の鳴り始めや鳴り終わった後に1秒程度の硬直を示 した．一方，電気ショック刺激による恐怖条件付け操作を 行った24時間後のラットを実験用ケージとは異なるケー ジに入れると，やはり新規の環境に対する探索行動が観察 された．しかし3分後に条件付けに用いた音を聴かせると， それまでの行動を止めて硬直する傾向を示した．この硬直 傾向は2回目以降の音を聴くことによってその時間が上昇 し，全体を通してみるとそこで頭打ちとなった．そして5 回分の合計硬直時間を算出し，初日に音を5回聴かせた時 の合計硬直時間と比較すると，有意に長くなっていた．
次に恐怖条件付け学習と断眠ストレス負荷を同時に 行ったグループを解析すると，断眠を行ってから学習を経 験したラットでは有意差はないものの硬直時間が減少し ていた．同様に，学習を行ってから断眠したラットも，硬
直時間が断眠を行っていないグループと比較して短くなる 傾向を示した．
考 察
