博士（農学） 刔 学 位 論 文 題 名
瑞 芳
Genomic study on integrations of endogenous rice tungro bacilliform virus‑like sequences and episomal DNAs in the rice genomes
（イ ネゲノムに内在す るウイ´レス様配列 とエピゾームDNAの挿入に関するゲノミックス研究）
学位論文内容の要旨
n the rice genomes, pararetrovirus‑like sequences that are similar to rice tungro bacilliform virus (RTBV), called endogenous rice tungro bacilliform virus‑like sequences (ERTBV), have been found, and none of the ERTBVs are functionally intact. A remarkable feature of the insertion sites of most ERTBVs is that they are flanked by AT di‑nucleotide repeats (ATrs). Although AT‑rich regions in chromosomal DNA have been described as preferential target sites for different externa and internal DNAs, our current understanding is insufficient to fully describe the role of ATrs in terms of DNA integration. In this study, the integration event of ERTBV and episomal DNA segments into ATrs was investigated through comparative analyses between japonica and indica genomes. In addition, the origin and distribution of ERTBV were also analyzed in the rice‑closely‑related species
(1) Integration of ERTBV into AT di‑nucleotides repeats of rice genomes
The rice genomes contain a number of segments of ERTBV, many of which were present between ATrs. The possible processes involved in ERTBV integration into the rice genome were postulated as; 1) ERTBV integrated into the ATrs in the genome, and 2) ERTBV accompained ATrs prior to integration into the genome. This study sought the process for the ERTBV integration into the rice genome. Comparison of genomic sequences between two closely related rice subspecies japonica and indica, allowed me to verify the preferential insertion of ERTBV into ATrs. I conclude that ATrs were present before the ERTBV insertions occurred
(2) AT di‑nucleotide repeats as damping sites of episomal DNAs
confirmed that ERTBVs are preferentially present between ATrs, which allowed me to speculate that AT‑rich regions might be widely employed as a site to integrate external and interna
―64
DNAs into chromosomes. Therefore, this study investigated the sequences present between the same SSRs by the comparative analysis between japonica and indica that was also used in the case of ERTBVs. In addition to ERTBVs, the comparative analyses showed that ATrs occasionally ncorporate repeat sequences including transposable elements, and a wide range of other sequences. Besides the known genomic sequences, the insertion sequences also represented DNAs of unclear origins together with ERTBVs, suggesting that ATrs have integrated episoma DNAs that would have been suspended in the nucleus. Such insertion DNAs might be trapped by ATrs in the genome in a host‑dependent manner. Conversely, other simple mono‑ and di‑nucleotide sequence repeats (SSR) were less frequently involved in insertion events relative to ATrs. Therefore, ATrs could be regarded as hot spots of double‑strand breaks that induce non‑homologous end joining. The insertions within ATrs occasionally generated new gene‑related sequences or involved structural modifications of existing genes. Likewise, in a comparison between Arabidopsis thaliana and Arabidopsis Iyrata, the insertions preferred ATrs to other SSRs ATrs in plant genomes could be considered as genomic dumping sites that have trapped various DNA molecules and may have exerted a powerful evolutionary force
(3) The original distribution of ERTBV in the rice genomes
ERTBV originated from ancient viral infections that have been fixed in the germline of the rice genomes. A number of the ERTBV segments were also detected in the other O. sativa and O rufipogon strains based on Southern blotting experiments. The evolution and origin of ERTBV in Oryza species remain to be clarified. Here, I explored original copies of ERTBV among the characterized copies in japonica genome. Among 162 ERTBV segments identified in the japonica and indica database, 22 are shared between the two genomes. With PCR analysis, nine of the 22 ERTBVs were detected in japonica, indica and O. rufipogon, and these were thought to be ancient copies that existed before japonica‑indica differentiation. To further understand the origin of ERTBV, the phylogenetic tree was constructed for each of the seven functional regions in ERTBV sequence. One of the most clear outcome resulted from RT/RH gene tree that was distinctly divided into four major clusters. The nine old segments detected by PCR analysis were distributed n all the four clusters, implying the different phylogenies of the old segments. Therefore, these results strongly indicated that the multiple origins of ERTBV cognates were inferred. The different origins of ERTBV in the Oryza genomes suggest that the distribution of ERTBVs was geographically different
―65
学位論文審査の要旨 主査 副査
副査 副査
教授 特任教授 准 教 授 講師
貴 島 三 上 小 柳 高 牟 禮
学 位 論 文 題 名
祐 治 哲 夫
香奈子（ 情報科学研究科）
逸 朗
Genomic study on integrations of endogenous rice tungro bacilliform ● ●
vlruS −1ikeSequenCeSandeplSOmalDNASintheriCegenomeS
（イネ ゲノムに内在するウイルス様配列とエピゾームDNA の挿入に関するゲノミックス研究）
本論 文 は図 14 、 表10 、 附図 3 、附 表 6 を含 み、5 章 からなる総頁数110 の論文で あり、
別 に参 考 論文 1 編 が添 えら れて いる 。
イ ネ には 二本 鎖DNA ウ イル ス（ パラレトロウイルス）である Rice tungro bacilliform virus (RTBv ）が感染し、ツングロ病を起こすことが知られている。イネゲノムにはこのRTBV と類 似 の配列End09enous RTBV −like seauence (ERTBW が多数 存在することが以前に報告 されている。ERTBV の挿入部位を調ぺると8 割は AT ￣の連続配列が両端に配置されており、
ERTBV が どのようにゲノムに入った のかを知る手掛かりを与え ている。また、AT 連続配列 には ERTBV に 限 らず 他の DNA 配列 も挿 入し て いる 可能 性がある 。本研究では主にERTBV の イネゲノムヘの挿 入様式をジャポニカとインデ イカのゲノムデ―夕を解析し、明らかにし た川 。 その 過程 でERTBV 以外 の配 列 につ いて もAT 連続 配列に 特異的な挿入が生じている ことを見出し、AT 連続配列の特性と挿入配列の構造を詳細に解析した（2 ）。さらに、ERTBV の挿 入 とイネの種分化は密接に関 連している。この事実を基に 、各ERTBV 断片の挿入時期 の推定とERTBV の分 布について調べた（3 ）。以 上の結果をまとめ、ERTBV や核に浮遊するエ ピゾ ー ム配列のイネゲノムヘの挿 入様式、ERTBV とRTBV の構造 的な相違とイネゲノムヘの 挿 入 の 有 無 、 お よ び イ ネ ゲ ノ ム の 進 化 と ERTBV 挿 入 の 関 係 に つ い て 考 察 し た 。
（1 ）ERTBV のAT 連続配列への挿 入
Kunii ら (2004 ） はAT 連 続配 列が ERTBV の 両端 に高 頻 度に出現することを 見出した。こ
の 事 実か ら、 私は 2 つ の仮 説を 立てて、ERTBV の 挿入様式について解析した 。1 つはERTBV
が AT 連続 配列 を標 的に 挿 入し た可 能性 。も う 1 つは ERTBV が AT 連続 配列 を結 合し て、ゲ
ノム に入った可能性。日本晴(RAP build5 ）と93 −11(BG ｜） のデータベースからそれぞれ
88 個 および74 個のERTBV が同定さ れた。この内、ジャボニカ では84lC 、インデイカでは77X
の ERTBV の 両端 に AT 連 続配 列が 検 出さ れた 。2 つの ゲノ ムどちらか―方でERTBV の挿入を
持 つ 32 サ イト では 、ERTBV のな い ゲノ ム側 のい わゆ る empty donor site で AT 連続配列が
存 在 していた。また 、ERTBV を持つサイ卜のパラ ロガス配列においてもAT 連 続配列が見出
さ れ た。これらの結 果から、AT 連続配列はERTBV がゲノムに挿入する前に存 在していたこ
―66 ―
とが確認された。
(2)エ ピ ゾ ー ムDNAの 集 積 場 と し て のAT連 続 配 列
全 て のERTBVは 再 編 成 さ れ 機 能 的 な 役 割 は 持 た ず 、 単 に ウ イ ル ス の 断 片 と し て 存 在 し て い る た め 、 積 極 的 にAT連 続 配 列 を 標 的 に 挿 入 し て い る と は 考 え づ ら い 。 ゲ ノ ム全 体の 反 復 配 列 を 調 べ た と こ ろ 、ERTBVだ け で は な く 、 他 の 配 列 も 取 り 込 ま れ る こ と が 判 明 し た 。 挿 入 配 列 は 既 知 の ゲ ノ ム 配 列 に 加 え て 、 起 源 が 不 明 なDNAも 含 ま れ た 。 ― 方 、AT以 外 の 連 続 配 列 、 例 え ばAA/TT、GG/CC、AC/GT、AG/CTあ る い はGC連 続 配 列 で はAT連 続 配 列 の よ う に ERTBVや 反 復 配 列 な ど の 挿 入 は 認 め ら れ な か っ た 。 従 っ て 、AT連 続 配 列 は 、 広 く 細 胞 に 浮 遊 し て い るERTBVな ど の エ ピ ゾ ― ム 様 配 列 を 取 り 込 む 性 質 を 持 っ て い る 可 能 性 は 高 い 。AT 連 続 配 列 は マ ト リ ッ ク ス ア タ ッ チ メ ン ト サ イ ト(MAR)に あた り、 ゲ ノム の中 で も、 ニ本 鎖 切 断 さ れ や す い 配 列 で あ る こ と が 推 定 で き る 。AT連 続 配 列 は 切 断 後 、 修 復 過 程 で細 胞核 に 浮 遊 す るDNA断 片 を 取 り 込 ん で き た と 考 え ら れ る 。AT連 続 配 列 内 の 挿 入 は ゲ ノ ム に 存 在 し な い 未 知 のDNA配 列 も 含 み 、DNAの 水 平 伝 搬 と の 関 連 も 示 唆 で き る 。 中 に は 転 写 され てい る 遺 伝 子 配 列 を 生 じ た り 、 既 存 の 遺 伝 子 の 構 造 を 変 更 し て イ ネ 独 自 の 遺 伝 子 構 造 を持 つ配 列 も AT連 続 配 列 内 に 見 出 さ れ た 。Arabidopsjs thalianaと4Iyra船 の 間 の 比 較 で も 、 イ ネ と 同 様 な 結 果 を 得 た 。 従 っ て 、 植 物 ゲ ノ ム のAT連 続 配 列 は 様 々 なDNA断 片 を 集 積 し た ダ ン ピ ン グ サ イ ト （ ゴ ミ 集 積 場 ）で あ ると 同時 に 、強 カに 進 化を 推進 す る機 能を 持 つと 考え ら れ た 。
(3) ERTBVの 起 源 と 分 布
ツ ン グ ロ 病 の 抵 抗 性 系 統 を 探 索 す る た め に は 、 そ の 起 源 地 で の 遺 伝 資 源を 調 べる こと が 有 効 と 思 わ れ る 。 本 章 で は 日 本 晴 と93―11の デ ― 夕 ベ ー ス か ら 得 ら れ た164個 のERTBVを 基 に そ の 起 源 を 調 査 し た 。 日 本 晴 と93ー11で 共 通 な サ イ ト に 挿 入 し て い る22個 のERTBVに 着 目 し た 。 こ れ ら22個 のERTBVに つ い てPCRで 起 源 の 異 な る ジ ャ ポ ニ カ 、 イ ン デ イ カ 、 ル フ ィ ボ ー ゴ ン10系 統 の ゲ ノ ム を 調 べ 、9つ のERTBVが 全 て の 系 統 に 存 在 し てい た 。さ らに 、 ウ イ ル ス 配 列 を7つ の 部 位 に 分 け 各 断 片 ご と に 系 統 樹 を 作 成 し た 。 最 も 明 瞭 な 系 統 樹 は RT/RH遺 伝 子 で 得 ら れ 、4つ の ク ラ ス タ ― に 分 け ら れ た 。PCR実 験 に よ り 検 出 さ れ た9つ の 断 片 は4つ の ク ラ ス タ ― に 全 て 分 布 し て い た 。 こ の こ と か ら 、ERTBVは4つ の 異 な る 起 源 を 持 っ ウ イ ル ス が イ ネ に 感 染 し 、 ゲ ノ ム に 取 り 込 ま れ 日 本 晴 ゲ ノ ム を 構 成 する に 至っ たと 推 定 で き る 。 同 時 にERTBVの 起 源 地 の 分 布 も 地 理 的 に 異 な っ て い た こ と を 示 唆 し て い る 。
以 上 の 成 果 は 、 イ ネ に 内 在 す る ウ イ ル ス 様 配 列(ERTBV)を 手 掛 か り に し て 、 植 物 ゲ ノ ム が 外 来DNAを ゲ ノ ム に 取 り 込 ん で き た こ と を は じ め て 明 ら か に し た 点 で 、 学 術 上 高 く 評 価 で き る 。 ま た 、 今 後 の 展 望 と し て イ ネ ツ ン グ ロ 病 抵 抗 性 機 構 を 解 明 し、 イ ネ品 種ヘ 付 与す る こ と に つ い て も 基 盤 と な る 知 見 を 与 え た 。 審 査 員 ― 同 は 、 刔 瑞 芳 氏が 博 士（ 農学 ） の学 位 を 受 け る に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 認 め た 。
―67―
