1
学位論文の内容の要旨
学位論文題目 ジャワ島産紅茶の糖質吸収抑制効果に関する研究
指 導 教 員 渡 辺 一 弘 学 位 申 請 者 五 十 嵐 将 樹
2
型 糖 尿 病 は イ ン ス リ ン 分 泌 低 下 や イ ン ス リ ン 抵 抗 性 を 来 す 素 因 を 含 む 複 数 の 遺 伝 因 子 に 、過 食 、運 動 不 足 、肥 満 、ス ト レ ス な ど の 環 境 因 子 及 び 加 齢 が 加 わ り 発 症 す る 。平 成23
年 国 民 健 康・栄 養 調 査 報 告 に よ る と「 糖 尿 病 が 強 く 疑 わ れ る 人 」 と 「 糖 尿 病 の 可 能 性 が 否 定 で き な い 人 」 の 総 和 は 国 民 の27.1 %
と 推 計 さ れ て い る 。糖 尿 病 の9
割 が2
型 糖 尿 病 で あ り 、食 事 由 来 の 糖 の 吸 収 を 抑 制 す る こ と が 予 防 あ る い は 進 展 抑 制 に 有 効 と 考 え ら れ て い る 。食 事 か ら 摂 取 さ れ た 炭 水 化 物 は 、 唾 液 や 膵 臓 か ら 分 泌 さ れ る-
ア ミ ラ ー ゼ(AM)
に よ っ て 多 糖 類 あ る い は 二 糖 類 に 分 解 さ れ 、 つ い で 小 腸 上 皮 細 胞 に 存 在 す る-グ ル コ シ
ダ ー ゼ(GL)
に よ っ て グ ル コ ー ス に 分 解 さ れ た 後 、主 に グ ル コ ー ス ト ラ ン ス ポ ー タ ー2 (GLUT2)
に よ っ て 吸 収 さ れ る 。2
型 糖 尿 病 の 境 界 型 は 生 活 習 慣 の 改 善 、 す な わ ち 食 事 量 の 制 限 や 清 涼 飲 料 水 由 来 の 糖 質 制 限 等 の 食 事 療 法 や 運 動 療 法 が 指 導 さ れ る 。身 近 な 食 品 の 中 か ら 糖 質 吸 収 を 抑 制 す る3
次 機 能 を 有 す る 食 品 素 材 の 探 索 は 、境 界 型 の 食 事 療 法 を 行 う 際 に 有 用 で あ る と 考 え 、本 研 究 に 着 手 し た 。紅 茶 は 水 に つ い で 世 界 で 最 も 多 く 摂 取 さ れ て い る 飲 料 で 、そ の 喫 飲 量 と2
型 糖 尿 病 有 病 率 は 負 の 相 関 関 係 に あ る こ と が 知 ら れ て い る 。し か し な が ら 、そ の 詳 細 な 作 用 機 序 は 未 だ 不 明 で あ る 。 そ こ で 、 消 化 管 に お け る 糖 質 吸 収 過 程 に 及 ぼ す 紅 茶 の 影 響 に 着 目 し 、 紅 茶 が2
型 糖 尿 病 に 機 能 性 食 品 素 材 と し て 有 用 で あ る か 検 討 し た 。一 方 、 抗 糖 尿 病 薬 の 一 部 は 主 に 薬 物 代 謝 酵 素
CYP
で 代 謝 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る が 、紅 茶 と 医 薬 品 の 併 用 に よ る 思 わ ぬ 食 － 薬 間 相 互 作 用 が 発 現 す る 可 能 性 が 懸 念 さ れ た 。 そ こ で 安 全 性 の 観 点 か ら 紅 茶 のCYP
に 及 ぼ す 影 響 も 併 せ2
て 検 討 し た 。1.
検 体 の 調 製 お よ び カ テ キ ン 、 テ ア フ ラ ビ ン 類 の 確 認市 販 ジ ャ ワ 島 産 紅 茶 飲 料 の 凍 結 乾 燥 品
(JAT)
を 各 試 験 に 供 し た 。 な お 、JAT 1 g
は 約4 g
の 茶 葉 に 相 当 し 、 数 種 の カ テ キ ン お よ び 紅 茶 の 特 有 成 分 で あ る テ ア フ ラ ビ ン 類 の 含 有 を 確 認 し て い る 。2. AM
活 性 に 及 ぼ すJAT
の 影 響AM
活 性 に 及 ぼ すJAT
の 影 響 をFig. 1
に 示 し た 。JAT
は 用 量 依 存 的 にAM
活 性 を 阻 害 し 、そ の50 %
阻 害 濃 度(IC
50 値)
は2.90 mg/mL
で あ っ た 。陽 性 対 照 と し て 用 い た 特 定 保 健 用 食 品 、蕃 爽 麗 茶 の 凍 結 乾 燥 品(BAS)
お よ び 食 後 過 血 糖 改 善 薬 、 ア カ ル ボ ー ス(ACA)
のIC
50 値 は 、 そ れ ぞ れ159 g/mL
お よ び1.79 g/mL
で あ っ た 。IC
50 値 の 比 較 か ら 、JAT
の 阻 害 強 度 はBAS
の 約1/18、
ACA
の 約1/1600
と 弱 く 、JAT
はAM
活 性 に 影 響 を 及 ぼ さ な い と 考 え ら れ た 。3. GL
活 性 に 及 ぼ すJAT
の 影 響GL
活 性 に 及 ぼ すJAT
の 影 響 をFig. 2
に 示 し た 。JAT、 BAS
お よ びACA
は 用 量 依 存 的 に ス ク ラ ー ゼ お よ び マ ル タ ー ゼ 活 性 を 阻 害 し た 。IC
50 値 よ り 、JAT
の 阻 害 強 度 はBAS
の 約5～ 7
倍 、ACA
の 約1/170 ~ 1/80
で あ り 、 弱 い な がConcentration ( mg/ mL)
AM activity (% of control)
Fig. 1 Effect s of JAT, BAS and AC A on porcine pancreatic AM activity
Porcine pancreatic AM was incubated with starch in the presence of various concentrations of JAT , BAS and ACA for 15 min at 37 ºC. Each value represents the mean ± S.D. of 3-4 experiments. Significantly different from the control, *p < 0.05, †p < 0.001.
0 25 50 75 100
0.00010.001 0.01 0.1 1 10 JAT BAS ACA
†
†
†
†
†
†
†
†
†
†
† †
*
10 1 10-1 10-2 10-3 10-4
3
ら も
GL
活 性 に 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。そ こ で
GL
に 対 す るJAT
の 阻 害 様 式 を 検 討 し た(Fig. 3)。 JAT
の 添 加 に よ り ス ク ラ ー ゼ お よ び マ ル タ ー ゼ のVmax
値 は い ず れ も 有 意 に 低 下 し た が 、Km
値 に 変 化 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、非 競 合 型 阻 害 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。4.
グ ル コ ー ス の 取 込 み に 及 ぼ すJAT
の 影 響次 に
Caco-2
細 胞 に お け るGLUT2
の 特 異 的 基 質 で あ る2’-
デ オ キ シ グ ル コ ー ス(DG)
の 取 込 み に 及 ぼ すJAT
の 影 響 を 検 討 し た(Fig. 4)。 GLUT2
の 特 異 的 阻 害 剤 フ ロ レ チ ン は 用 量 依 存 的 にDG
の 取 込 み 量 を 低 下 さ せ た の に 対 し(IC
50値: 75.6 g/mL)、 JAT
は 最 大1 mg/mL
を 添 加 し て も 取 込 み 量 に 変 化 は 認Maltase
Concentration ( mg/ mL) Sucrase
GL activity (% of control)
Fig. 2 Effects of JAT, BAS and ACA on rat small intestinal sucrase and maltase activities
Rat small intestinal sucrase and maltase were incubated with sucrose and maltose in the presence o f various concentrations of JAT, BAS and ACA for 10 min at 37 ºC. Each value represents the mean ± S.D. of 3-4 experiments. Significantly different from the control, *p < 0.05, #p < 0.01, †p < 0.001.
0 50 100
0.001 0.01 0.1 1 10 100
# †
*
#
† †
†
†
†
*
*
ACA
JAT BAS
0 50 100
0.001 0.01 0.1 1 10 100
#
†
†
†
†
†
†
†
ACA
BAS
JAT
Fig. 3 Lineweaver -Burk plots for rat small intestinal sucrase and maltase
Rat s mall intestinal sucrase and maltase were incubated with sucrose (6.25 ~ 200 mM) and maltose (0.39 ~ 25 mM) in the presence or absence of JAT (3 mg/mL) for 10 min at 37 ºC. Each value represents the mean ± S.D. of 3-4 experiments.
1 /M a lt o s e ( mM ) 1/Maltase activity (1/nmol/min/mg prot.)
1 / S uc r o s e ( mM ) 1/Sucrase activity (1/nmol/min/mg prot.)
S uc r a s e
J AT C o nt r o l
C o nt r o l J AT M a lt a s e
JAT a2.40a± 0.16 a2.80a± 0.03 BAS 17.6aa± 3.09 13.7aa± 1.17 ACA a0.014 ± 0.0020 a0.036 ± 0.0010
IC 50 value (mg/mL)
Sucrase Maltase
Vmax and Km values for sucrase and maltase
Sucrase
Control 31.1 ± 0.81 23.6 ± 2.00
JAT 12.9 ± 1.17* 27.9 ± 7.82
Maltase
Control 57.9 ± 2.54 2.32 ± 0.32
JAT 26.3 ± 1.32* 2.57 ± 0.44
Significantly different from the control, *p <0.05 Vmax
(nmol/min/mg prot.)
Km (mM)
4
め ら れ な か っ た 。従 っ て 、
JAT
は 小 腸 上 皮 細 胞 刷 子 縁 膜 上 のGLUT2
が 介 在 す る グ ル コ ー ス の 吸 収 に は 関 与 し な い こ と が 示 唆 さ れ た 。5.
糖 負 荷 後 血 糖 値 に 及 ぼ すJAT
の 影 響上 述 し た
in vitro
の 実 験 結 果 か ら 、JAT
はGL
阻 害 作 用 を 有 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 肥 満2
型 糖 尿 病 モ デ ル 動 物C57 BLKS/JIar-+Lepr
db/+Lepr
db(db/db )
マ ウ ス を 用 い 、ス ク ロ ー ス 負 荷 後 の 血 糖 値 に 及 ぼ すJAT
経 口 投 与 の 影 響 を 検 討 し た(Fig. 5)
。2
型 糖 尿 病 を 呈 し な いdb/+
マ ウ ス の 血 糖 値 は 、糖 負 荷 に よ り 幾 分 上 昇 し た に 過 ぎ な か っ た(211 mg/dL)
。こ れ に 対 しdb/db
マ ウ ス の コ ン ト ロ ー ル 群 の 血 糖 値 は 、 ス ク ロ ー ス 負 荷 後30
分 で 最 高 値(825 mg/dL)
に 達 し 、 そ の 後 漸 減 し た 。JAT
投 与 群 で は 用 量 依 存 的 な 血 糖 値 の 低 下 を 示 し 、500 mg/kg
で30、 60
お よ び120
分 後 の 血 糖 値 が い ず れ も コ ン ト ロ ー ル 群 に 比 べ 有 意 に 低 下 し 、BAS 500 mg/kg
投 与 群 と ほ ぼ 同 様 の 血 糖 曲 線 を 示 し た 。ま た 、ACA
投 与 群 に お い て も 、 用 量 依 存 的 に 血 糖 値 の 上 昇 が 抑 制 さ れ た 。 な お 、 イ ン ス リ ン 値 は い ず れ の 投 与 群 に お い て も 有 意 な 変 化 は み ら れ な か っ た 。次 に 最 高 血 糖 値 を 示 し た
30
分 後 に お け るJAT、 BAS
お よ びACA
投 与 後 の 小 腸GL
活 性 を 検 討 し た(Fig. 6)。コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 較 し て 、JAT
お よ びACA
投 与 群 は 有 意 な 低 下 が 認 め ら れ 、JAT
投 与 群 でdb/+
群 の 活 性 と ほ ぼ 同 程 度 で あ っ た 。 一 方 、BAS
投 与 群 に 有 意 な 低 下 は 認 め ら れ な か っ た 。Fig. 4 Effects of JAT and phloretin on DG uptake in Caco -2 cell monolayers
Each value represents the mean ± S.D. of 3 monolayers. Significantly different from the control, #p < 0.01,
†p < 0.001.
Concentration (mg/ mL) DG uptake rate (% of control)
0 20 40 60 80 100 120
0.001 0.01 0.1 1
JAT
Phloretin
#
†
5
以 上 の
db/db
マ ウ ス で の 検 討 か ら 、JAT
はGL
活 性 の 阻 害 に 基 づ く 食 後 過 血 糖 改 善 効 果 を 有 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。そ こ で イ ン ス リ ン 分 泌 が 不 全 で あ り 、 日 本 人 の2
型 糖 尿 病 に 近 い 非 肥 満2
型 糖 尿 病 モ デ ル 動 物GK
ラ ッ ト を 用 い 、 糖 負 荷 後 血 糖 値 に 及 ぼ すJAT
の 影 響 を 詳 細 に 検 討 し た 。 ス ク ロ ー ス を 負 荷 し たGK
ラ ッ ト に 、 JAT、BAS お よ び ACA を 投 与 し た と き の 血 糖 値 の 経 時 変 化 をFig. 7
に 示 し た 。 コ ン ト ロ ー ル 群 の 血 糖 値 は 負 荷 後30
分 で 最 高 値(299 mg/dL)
に 達 し 、 そ の 後 漸 減 し た 。JAT
投 与 群 は 用 量 依 存 的 に 血 糖 値 上 昇 抑 制 効 果 を 示 し 、 投 与30
分 後 の 血 糖 値 は62.5 mg/kg
以 上 で コ ン ト ロ ー ル 群control
Fig. 5 Effects of JAT, BAS and ACA oral administration on plasma glucose levels after sucrose loading in db/db mice
Plasma glucose levels were measured in control db/db mice ( ), db/db mice administered JAT (100 mg/kg, ; 250 mg/kg, ; 500 mg/kg, ) and BAS (500 mg/kg, ), and reference db/+ mice ( ) (A); and in control db/db mice ( ) and db/db mice administered AC A (10 mg/kg, ; 25 mg/kg, ; 100 mg/kg, ) (B) after sucrose loading. Each value represents the mean ± S.D. of 5-6 mice. Signi ficantl y different from the control, *p < 0.05, #p < 0.01.
◆
Fig. 6 Effects of JAT, BAS and ACA oral administration on small intestinal sucrase activities in db/db mice Each value represents the mean ± S.D. of 4 mice. Significantly different from the control, *p < 0.05, #p < 0.01.
Sucrase activity (nmol/min/mg prot.) 0 100 200 300 400
db/m control JAT BAS ACA
db/db
*
*
#
500 500 100 mg/kg
Cont rol db/+
0 300 600 900
0 30 60 90 120
(A)
*
* *
#
# *
Plasma glucose (mg/dL)
Time (min) Time (min)
(B)
0 300 600 900
0 30 60 90 120
* *
*
*
Control Control Cont rol
6
に 比 べ 有 意 に 低 値 を 示 し 、
250 mg/kg
投 与 群 の 血 糖 値 は221 mg/dL
ま で 低 下 し た 。BAS
お よ びACA
投 与 群 も 同 様 に 用 量 依 存 的 な 血 糖 値 上 昇 抑 制 効 果 を 示 し 、BAS 250 mg/kg
は 投 与30
分 後 、ACA 3.0 mg/kg
は30
分 お よ び60
分 後 で 有 意 に 低 下 し た 。一 方 、JAT 31.3 mg/kg
お よ びACA 0.3 mg/kg
の 各 投 与 群 は 、 い ず れ も 血 糖 値 に 有 意 な 変 化 を 認 め な か っ た が 、 こ れ ら の 併 用 群 で は 投 与30
お よ び60
分 後 の 血 糖 値 が 有 意 に 低 下 し 、ACA 3.0 mg/kg
投 与 群 と ほ ぼ 同 じ 血 糖 値 上 昇 抑 制 効 果 と な っ た 。な お 、い ず れ の 投 与 群 も イ ン ス リ ン 値 に 変 化 は 見 ら れ な か っ た 。Fig. 7 Effects of JAT, BAS and ACA oral administration on plasma glucose levels after sucrose loading in GK rats
Each value represents the mean ± S.D. of 5-6 rats. Significantl y different from the control, *p < 0.05,
#p < 0.01, †p < 0.001.
*
: B A S 6 2.5 mg / k g : B A S 1 2 5 mg / k g : C o nt r o l
: B A S 2 5 0 mg / k g : J AT 3 1 . 3 mg / k g
: J AT 6 2 . 5 mg / k g : C o nt r o l
: J AT 2 5 0 mg / k g
*
: A C A 0 . 1 mg / k g : A C A 0 . 3 mg / k g : C o nt r o l
: A C A 3 . 0 mg / k g
: C o nt r o l
: A C A 0 . 3 mg / k g w it h J AT 3 1 . 3 mg / k g
0 50 100 150 200 250 300 350
0 30 60 90 120
♯
† ♯ *
JAT
Plasma glucose (mg/dL)
0 50 100 150 200 250 300 350
0 30 60 90 120
♯ * *
ACA
Time (min)
0 50 100 150 200 250 300 350
0 30 60 90 120
† ♯
ACA with JAT
Time (min) 0
50 100 150 200 250 300 350
0 30 60 90 120
BAS
7
ま た グ ル コ ー ス を 負 荷 し た
GK
ラ ッ ト のJAT
、BAS
お よ びACA
投 与 群 は 、 い ず れ の 時 間 に お い て も 、 コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 べ 、 血 糖 値 に 何 ら 変 化 は 見 ら れ な か っ た(Fig. 8)
。さ ら に
GK
ラ ッ ト に お い て もJAT、 BAS
お よ びACA
を 投 与 し た30
分 後 に お け る 小 腸GL
活 性 を 検 討 し た(Fig. 9)。 コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 較 し て 、 い ず
れ も 用 量 依 存 的 にGL
活 性 は 低 下 し 、高 用 量 群 で 有 意 と な っ た 。一 方 、有 意 な 低 下 を 認 め な か っ たJAT
お よ びACA
の 低 用 量 群 を 併 用 し た と こ ろ 、ACA
の 高 用 量 群 に 相 当 す る 小 腸GL
活 性 の 低 下 が 認 め ら れ た 。0 20 40 60 80
control 31.3 250 0.3 3 62.5 250 JAT +
ACA Sucrase activity (nmol/min/mg prot.)
*
# * #
(mg/kg)
JAT ACA BAS
Control
31.3 + 0.3 JAT + ACA
Fig. 9 Effects of JAT, BAS and ACA oral administration on small intestinal sucrase activities in GK rats Each value represents the mean ± S.D. of 5-6 rats. Significantl y different from the control, *p < 0.05, #p < 0.01.
Time (min)
Plasma glucose (mg/dL)
0 100 200 300 400
0 30 60 90 120
0 100 200 300 400
0 30 60 90 120
Fig. 8 Effects of JAT, BAS and ACA oral administration on plasma glucose levels after glucose loading in GK rats
Each value represents the mean ± S.D. of 5-6 rats.
: C o nt r o l : J AT 6 2 . 5 mg / k g : J AT 2 5 0 mg / k g
: B A S 1 2 5 mg / k g : C o nt r o l : B A S 2 5 0 mg / k g : A C A 3 mg / k g
JAT BAS ACA
Time (min)
8 6.
薬 物 代 謝 酵 素CYP
に 及 ぼ すJAT
の 影 響ヒ ト 肝 ミ ク ロ ソ ー ム に お け る 主 な
CYP
活 性 に 対 す るJAT
添 加 の 影 響 を 検 討 し た(Fig. 10)
。CYP2C9
、CYP2C19
お よ びCYP3A4
活 性 に 用 量 依 存 的 な 低 下 が 認 め ら れ 、こ れ ら のIC
50 値 は 、そ れ ぞ れ 46.5、21.5
お よ び45.4 g/mL
で あ っ た 。ま と め
食 事 よ り 摂 取 し た 炭 水 化 物 は 主 に
AM
お よ びGL
に よ っ て グ ル コ ー ス に 分 解 さ れ た 後 、GLUT2
に よ っ て 吸 収 さ れ る 。JAT
はAM
に 対 し 、何 ら 影 響 す る こ と は な か っ た が 、 ス ク ロ ー ス 負 荷 後 の 血 糖 値 上 昇 を 抑 制 す る こ と が 、 肥 満 お よ び 非 肥 満 の2
型 糖 尿 病 モ デ ル 動 物 の 実 験 か ら 明 ら か と な っ た 。 非 肥 満 型 に お い て 、 よ り 低 用 量 で 有 意 な 効 果 を 示 し た こ と か ら 、 重 度 な 病 態 よ り も 軽 症 に お い て 効 果 的 と 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 こ の 効 果 はin vitro
実 験 お よ びJAT
投 与30
分 後 の 摘 出 小 腸GL
活 性 を 検 討 し たex vivo
実 験 か ら 、GL
活 性 の 阻 害 に 基 づ く と 考 え ら れ た 。 一 方 、GK
ラ ッ ト に グ ル コ ー ス を 負 荷 し た 場 合 、JAT
は 血 糖Fig.10 Effects of JAT addition on various CYPs activ ities in human liver microsomes
Human liver microsomes were incubated with specific substrate in the presence or absence of JAT (0.003
~ 1.0 mg/mL) for 60 min at 37 ºC. Each value represents the mean ± S.D. of 4 experiment s. Significantly different from the control, #p < 0.01, †p < 0.001.
CYP1A2
0 25 50 75 100
0.001 0.01 0.1 1
0 25 50 75 100
0.001 0.01 0.1 1
†
†
†
†
CYP2C9
0 25 50 75 100
0.001 0.01 0.1 1
#
†
†
† †
CYP2C19
0 25 50 75 100
0.001 0.01 0.1 1 CYP2D6
0 25 50 75 100
0.001 0.01 0.1 1 CYP2E1
0 25 50 75 100
0.001 0.01 0.1 1
†
†
†
CYP3A4
JAT (mg/mL)
CYP activity (% of control)
9
値 上 昇 抑 制 効 果 を 示 さ な か っ た 。 こ れ は
Caco-2
細 胞 を 用 い たGLUT2
に よ るDG
取 込 み 実 験 に お い て も 、JAT
は 何 ら 関 与 し な か っ た こ と か ら 裏 付 け ら れ た 。一 方 、 食 事 療 法 や 運 動 療 法 を
2
～3
ヶ 月 継 続 し て も 目 標 の 血 糖 コ ン ト ロ ー ル を 達 成 で き な い 場 合 は 、薬 物 療 法 が 開 始 さ れ る こ と と な る が 、JAT
はACA
と 併 用 す る こ と で 、GL
活 性 を 相 加 的 に 阻 害 す る こ と が 確 認 さ れ た 。 こ の 時 のACA
の 投 与 量 は ヒ ト の1
日 量 の 約1/3、 JAT
は 約5
杯 分 に 相 当 す る 。ま た
JAT
は 、 他 の 抗 糖 尿 病 薬 と 併 用 す る 機 会 も 少 な く な い と 考 え ら れ る 。 従 っ てJAT
のGL
活 性 阻 害 に 加 え 、 他 剤 に よ る 血 糖 低 下 効 果 が 同 時 に 起 き た 場 合 、低 血 糖 等 の 有 害 事 象 の 発 現 が 懸 念 さ れ る 。そ こ でJAT
のCYP
活 性 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た 結 果 、CYP2C
お よ びCYP3A
を 阻 害 し た こ と か ら 、 こ れ ら の 酵 素 で 代 謝 さ れ る 糖 尿 病 治 療 薬 と 紅 茶 の 併 用 に は 注 意 が 必 要 で あ る と 示 唆 さ れ た 。以 上 よ り 、 紅 茶 は
