複 製 開始 反 応 の遺伝生化学 的研 究

44

金沢大学十全医学会雑誌 第

4巻 第

号

枯草 菌 にお け る

複 製 開始 反 応 の遺伝生化学 的研 究

金沢 大学 が ん研 究所 生 物 物 理 部 ′ (主任 :吉川 寛 教授 )

犬 塚 紀 子

(昭和

年

月

日受付 )

細 菌 の染色体 は,連続 した

本鎖 の

か ら な り.細胞 の増殖 に と もな って複 製 され娘 細 胞 に分配 さ れて い く.細 菌 が環境 の変化 に適 応 して生 きて い く為 に は

合成 にお いて も,環 境 に応 ず る 横 桟 が な ければ いけない .

即 ち .

合成 と世代 時 間 ,細 胞 分 裂 の 間 に は 密接 な関係 が必要 で あ る. これ らの問 の制 御 機構 につ いて は ,これ まで い くつ か の点 が 明 らか に な っ て い る.

1.DNA

複製 の継 続 反 応 に要 す る時 間 は一 定 で あ る

2

.細 胞 当 りの

合成 速 度 は複 製 開 始 の 頻 度 によ って決定 され る2 ) 〜4 )

3

.既 に始 ま った複 製 の継 続 に は蛋 白合 成 を必 要 と しないが複製 の開始 に蛋 白合成 を必 要 とす る

4

.複製 開始 の頻度 は世代 時 間 に依 存 す る (に 等 し い

5

.細胞 分裂 は複製 の継 続 反 応 の終 了 後 一 定 時 間経 過 して起 る7 )

この様 に

複製 開始 反 応 は

合 成 の 調 節 に重要 な役割 を果 た して い るばか りで な く,細 胞 増 殖 の調 節 に も密接 に関与 して い る .

複製 開始 反応 の素過 程 とそ れ に関係 す る因 子 につ い て は. これ まで に遺伝 的方 法 及 び生 化 学 的方 法 によ っ て .徐 々に解明 されつつ あ る.大 腸 菌 にお いて は複 製 開始 に関与 す る遺伝 因子 と して

種 頬 が存 在 す る事 が 明 らか にな って い る

.また

らは ア ミノ酸 飢 餓 の方 法 で

複 製 を同調 させ そ の 後 の 複 製 開 始 に及 ぼす阻害剤 の効 果 か ら

種 頬 の蛋 白質

と

l l )の関与 を明 らか に して い る.

複製 開始反応 その もの の解 析 と して は

を 用 いて ,よ り実体 解 明 に近 づ きっ つ あ る

で ば

で複 製 開始 を行 わせ る事 が で き

, さ らにその系 を用 いて ,複製 開始 に関 与 す る遺 伝 子産 物 の

が可 能 とな った】

i ) . 小 レ プ リ

コ ンの方 が よ り単 純 で ,開始 反 応 に含 まれ る因子 の機 能 を知 るに は有利 で あ ろ う. しか し

複 製 の 細 胞増殖 や細胞 分裂 とのか か わ りあ い等 の問題 は細 胞 に 固有 の問題 で あ り.細 菌 を用 いて しか解 明 で き な い .

また

複製 の素過 程 で あ る開始 反 応 . 継 続 反 応 .完了反応 はいづ れ も細 胞 表 層 と密 接 に関 係 して い る.複製点 ,複製 開始点 ,複製 終 点 が細 胞 表 層 に結合 して い る事実

が あ るばか り で な く .

らは複製 開始 に細 胞表層 の合成 が必 要 で あ る事 を明 ら か に LJ G ) .また

らも複 製 開始 と局 部 的 な表層 合成 が密接 に関係 して い る事 を報 告 して い る

.細 胞 膜 を場 と して の反応 で あ り制 御 で あ る とい う意 味 で も 細 菌 の系 で の追求 が必要 で あ ろ う.

筆者 は遺伝 的構 造

と複 製 様 式

g

が比較 的 よ く分 っ て いて､ また形質 転換 法

H

の可 能 な枯 草 菌 を用 い て 複 製 開始 反応 の遺伝 的生 化学 的解 析 を 行 っ た . そ の 結 果 ,複製 開始 に関与 す る

種 板 の因子 の 存 在 と

RNA

合成 の必要性 が明 らか に な った . これ ら譜 因 子 の合成 と作 用 の時 間的経 過 につ い て も検 討 す る.

実験材 料 およ び方 法

Ⅰ.strains

Bacillussubtilt'sl68(LTT) genotype:leu.thy.trL)C2

tsMH27.ts6057.PEAS‑11

は

か ら ニ トロソ グアニ ジン処理

に よ り得 られ た

は

か ら

は ,

MH27,6057

か ら形質転 換法

W

よ り

トラ ン ス ホ ーマ ン トと して単離 した .

BacillussubtiLis168(MU8U5Ul6U2) genotype:leu8.metB5.PUTA16,hisA

Ⅱ.media

1.Low phosphatePenassay(LP) Penassay (DifcoAntibioticMedium

3) の

を

に下 げ . そ の代 りに

ci

f

,

枯 草 菌 に お け る

複 製 開 始反 応 の道 元 生 化 学 的研 究

buffer(pH 7.3)

を最 終 濃 度

加 え て 調 合 し た .

2.BHI

プ レー ト :

2 0)

に

を加 え た .

3.Cg22) (spizizen's MinimalMedium)

に

20

種 類 の ア ミノ酸 を そ れ ぞ れ

加 え た 培 地

4.C+GMII2:i)

Ⅲ.buffers

l.1×SSC:0.15M NaC

l

1

r.ate

2.TMK buffer(20mM Tris‑HCl(pH7.1･), 10mM MgC12.0.1M KC

l )

Ⅳ .試薬

1.5

‑ブ ロモ デ オ キ シ ウ リ ジ ン

製

2.32p

‑正 リ ン酸 第 一 化 学 薬 品 株 式 会 社 製

3.3H

‑チ ミ ジ ン

l )

4

. ク ロ ラ ム フ ェニ コ ー ル

& Co.

5

. リフ ァ ン ピ シ ン

6.β

‑フ ェ ネ チ ル ア ル コー ル

半井

V.

実 験 方 法

1.3H‑TdR

の取 り込 み に よ る

合 成 量 の 測 定 法

:lH‑TdR(0.5FLCi/5〟gTdR/m

l )を 含 む

培 地 中 で バ ク テリアを増 殖 させ .適 時 に採 取 した

に

を最 終 濃 度

に な る よ う に加 え

で一 晩 処 理 し た の ち

lで 中 和 した . こ れ に

(トリク ロル酢 酸 ) を加 え .

不 溶 性 の 分 画 を

Glass fiber filter (Whatman

製

に集 め , トル エ ン

シ ンチ レー ター

1 トル エ ン) を用 い て . そ の 放 射 能 活 性 を 測 定 した .

2

.形 質 転 換 法

3.DNA

の 抽 出法

D vegitativecel

lか らの 場 合

培 養 液

に

を 最 終 濃 度

に 加 え 急 速 に氷 冷 した .低 速 遠 心 で 菌 体 を 集 め た 後 ,

Saito & Miura

の

7 ェフ ー ル法 2 4 ) に よ り

DNA

を抽 出 し.

の

に溶 解 さ せ . 形 質 転 換 の実 験 に用 い た .

2)

胞 子 か らの場 合

Takahashi

の方 法

に よ っ た .

4

.遺 伝 子 頻 度 測 定 法

45

purA/metB

比 を測 定 す る に は

) を受 容 菌 と して サ ンプ ル

お よ び

胞 子

を用 い て 形 質 転 換 を行 った . サ ンプ ル

を 用 い て 得 られ た

と

transformants

の比 を胞 子

を 用 い て 得 ら れ た

十比 で 割 って 補 正 した .

5.purÅ/metB

比 か ら

の 換 算 法 .

あ る培 養 条 件 下 で は .す べ て の 細 胞 は

複 製 を終 了 した状 態 で 停 って い る . この 条 件 を 変 え た 時 , 新 た に起 る複 製 の 再 開 始 の 頻 度 を 測 定 す る 方 法 と し て .先 ず .上 述 の よ うに して 求 め た サ ンプ ル

の

の値 を胞 子

の 同 じ比 で 割 り補 正 値 を 出 す .っ い で この 値 が

の 場 合 を

と し, ま た

か ら

の 間 は

1)×100

(% ) と した .

以 上 の 場 合 は

(% ) と して 求 め た . 但 し

X は測 定 す る サ ン プ ル

DNA

の

比 を 表 わ す .

6

.複 製 開 始 能 力 の測 定 法

5

と同 様 に あ る培 養 条 件 下 で

複 製 を 終 了 し た状 態 で 停 止 させ た後 , こ の 条 件 を 変 え た 時 複 製 の再 開 始 が起 るが , そ の 時 複 製 の 継 続 反 応 は 阻 害 しな い で 開 始 の み 阻 害 す る処 理 を して ,処 理 を始 め た 時 点 まで に形 成 され て い た複 製 再 開 始 能 力 を 測 る に は

1) 再 開 始 後 の

比 の 経 時 変 化 か ら

maximum

の

比 を求 め て .

の 方 法 で

と して 算 出 す る か , ま た は

2)

再 開 始 後 の

の 取 込 み 量 の 最 大 増 加 分 (% ) を

と して 測 定 した .

7.CsC

l密 度 勾 配 遠 心 法

5‑BudR

で

した

を

の

に溶 か し, そ れ に

に 溶 か し た

lを加 え て 最 終 密 度 を

全 容 量 を

と し た .

で

で

時 間 遠 心 した .遠 心 後 ,遠 心 管 の 底 か ら

滴 づ つ 分 画 し.各 分 画 を

の

で 希 釈 した . こ の うち

を分 取 し.

の 放 射 能 活 性 を 測 定 し, ま た

を用 い て 各 遺 伝 子 マ ー カ ー に 対 す

る形 質 転 換 活 性 を 測 定 した .

実 験 結 果

Ⅰ.DNA

複 製 開 始 変 異 株 の 単 搬

DNA

複 製 の 開 始 反 応 を遺 伝 的 . 生 化 学 的 に 解 析

/す るた め に

複 製 の 開 始 に関 す る 変 異 株 を 単

46

_犬

離 す ることを試 みた .この種 の変異 株 は致 死 的 であ る ので条件変異株 を単離 しなければ な らな い .条件 の設 定 にあた って は.複製 開始 に関与 す る蛋 白質 の変異 を 想定 して高温感受性変異株 を ,また複製 開始 に関与 す る細胞膜 の変異 を想定 してβ ‑ フ ェネチ ル アル コ ー ル

感受性変異株 を単離 した .

は細胞 膜 に 特異 的 に作用 し透過性 を変化 させ ると同時 に適 当 な濃 度 で は細胞 の高分子生合成 の中 で

合 成 の み が 特異 的 に阻害 され ることが大腸 菌 で 報告 さ れ て い る 2 7 ) .これ は細胞膜 の

合成 に対 す る特異 的 機 能 を解析 す る上 に有用 な現象 で あ る.

単離方法 と して は,ニ トロソ グアニ ジン処 理 した細 胞集団か ら,高温感受性変異株 の場合 に は .

で 生 えて

で生 え ない コロニーを選択 し ,

感 受性変異株 の場合 には

を含 む

に 生 えない コロニーを選択 ,単離 した .

(

○‑○

と a tN

塚

Ⅱ.DNA

複製開始 変異株の 同定

この よ うに して得 られた高温感受性 変異 株 の中か ら

複製開始変異株 を ,次 の

つ の方 法 ,

ア イソ トープによる方法

遺伝子頻 度測 定法 によ り 同定 した.

1

.アイ ソ トープによ る方法 .

細胞 を

‑チ ミジンを含 んだ

培地 で

で 培 養 し,

tが

に達 した時

に移 して培養 を続 けた .各時間 にサ ンプ リング して . ･ l i H ‑チ ミ ジ ン の

への取 り込 み量 を測定 して .

合 成 の 変化 を調 べた .その結果 は ,高温 で ,1

合 成 が阻害 されない もの .

ただ ちに

合 成 が ほ とん ど停止 す るもの (残存 合成量

合成 が選択 的 に阻害 され る もの ( 残 存 合成量

に分類 され た .一方

複製 開始 が 高 温 で 阻害 された場合

培地 で は理論 的 に は

の 増 加

図

と

の増 殖 と

合 成

MH27

50lO

^I

●

25

l

▼

一 1

1

Tl mo (hr)

呈O

芦‑ エ 巾

ー1 0

1 2

Ti m e( h r )

細 菌 を

d

d

lを含 ん

だ

培 地 で

℃ で培 養 し,

t が

に達 した時, 培 養 液 を

℃ に移 して

培養 を続 け た 温 度 を シフ トす る前 と後 , 適 時 に

lの培養 液 を採 取 して放 射 能

活 性 を測 定 し た｡ また 同 時 に

の 培 養 液 を採 取 して

を抽 出 し, 形

質転 換 法 に よ っ て

比

を測 定 した｡

○‑ ○ :濁 度 , ●‑

に取 込 まれ た

d

R の カ ウ ン ト

△‑ △ :pur

枯草菌における

複製開始反応 の遺元生化学 的研究

が見込 まれるので ,目的 とす る複製 開始 変異 株 は上 の 分類 の

)に属 してい ると思 われ る.実 際 に ,高温で

チ ミジンの取込 み量 の 増 加 が 見 られ る変異株が

株単離 された .図

は そ の う ち の

株

と

の菌 の増殖

) と

合成 の変化 を示す .両株 ともに .高温 で

の

の増加 が観察 され ,複製 開始変異 株 の 場 合 の理論値 と一致 した.

しか し

の取込 み量 だけで は .複 製 開 始 の 変異株か または複製 の継続反応 の変異株 かの区別 はで きないので ,次 に,それ らの変異株 につ いて高温 に移 したのちの複製様式 の変化 を追求 した .

2

.遺伝子頻度測定法

枯草菌では複製起点 .複製中点 お よび終点 の各 々に 近 い位置にあ る遺伝子 が同定 されてお り

.細胞 内 の それ ら遺伝子 の頻度 は抽 出 した

によ る形 質 転

47

換活性 を測定 して容易 に求 め ることがで きる.これ ら 連伝子頻度 の梱対比 ( 起点/終点

近 点/中点

,中点 /終点

の値 は

抽 出時 の細胞 の

複 製 様 式 を 直 接反映 している.変異株 の高温 に移 す前 と後 の細胞 か ら

を抽出 し,形質転換法 によ り.

の比 を計測す る.この比 を両遺伝子 を 同 じ頻 度 含 む親株

の胞子

の

の 比 で補正す る事 によ って試料

にお け る

metB

の比が算定 で きる.変異株 を

で

中で 培 養 した時

比 は約

で , こ の こ と は染 色体当 り

個 の複製点 を持 っ事 を表 わ して い る

に移 した後す ぐに

比 は減少 し始 め

時間以 内に

に近づ いた ( 図

).この結果 は .

で は複製開始反応 のみが直 ちに停止 し,複製 は正常 に 終点 まで進行セ きる事 を示 して い る と思 わ れ る. . 即

図

野性 株 と

の増 殖 と

合 成

0

12 3

)

0

1

2 3

48

犬

ち .遺伝子 頻度測 定 に よ る結 果 は先 に述 べ た

ミジン の取込 み の結 果 とよ く一 致 し,突 然 変 異 株

と

は染色体複 製 開始 に必 須 の 機 能 が 特異 的 に高温感受 性 に変異 して い る もの と思 わ れ る .

PEA

感受性 変異株 につ いて も同様 の方 法 に よ って 同定 した .野性 株 で は図

に示 す様 に

に よ って菌 の増殖 も

合 成 も同時 に 阻 害 さ れ る .

DNA

合成 のみ を選択 的 に阻害 す る濃 度 は 見 っ か ら なか った .そ こで

に対 し感受 性 の 変 異 株 を単離 したが ,その

株

) は

添 加後 .

は

増加 して止 ま り. さ ら に

purÅ/metB

比 は添加 前 に は

で あ ったが . 添 加 後 徐 々に

に近 づ く事 か ら.

複 製 の開始 反 応 が

PEA

存 在下 で選択 的 に阻害 さ れ て い る と 思 わ れ る (図

Ⅲ.

^{変異株の遺 伝解析}

上述 の方 法 で複 製 開始変 異 株 と同定 され た

株 の高 温感受性 菌 につ いて .

同 じ遺 伝 子 上 の 変 異 か 否 か .

遺伝子 地 図上 の変異 した位 置 を調 べ た .

1.ts6057

と

の組 換 え テ ス ト

tsMH27(LTT)

を受容 菌 と して野性 株

と

ts6057(TT)

の

を用 いて形 質 転 換 を 行 な っ た .生 じた

十トラ ンスホ‑ マ ン トの数 を

トラ ンスホーマ ン トの数 で割 る事 に よ り,用 い た

の形質転換 の効率 を補 正 した . そ の結 果 野 性 株 と

とは同 じ補 正値 で ,この ことは

と

との間 には .

は全 くな く . 両 者 L は異 な った遺伝子 の変異 株 と思 われ る . さ らに

っ の変異 株 の変異 した遺伝 子 が遺伝子 地 図上 の ど こに位 置 す る か を調 べ た .

2.ts6057

と

の マ ッ ピン グ

枯草 菌 にお いて .複 製 は

近 傍 の 起 点 か ら

塚

二方 向

に逐 次的 に起 き,

の近 くで 終 了 す る 事 が知 られて い る

.また枯 草 菌 の胞子 は .複 製 が 終 了 した段 階 で静 止 してお り,発 芽 の時 に は複 製起 点 か ら同調 して複製 が開始 され る

.そ こで . 発 芽 時 の 複製順序 か ら未知 の遺伝 子 と既 知 の遺 伝子 との相対 的 な位 置 を知 る事 が で きる

I

実験 方 法 で述 べ た 様 た 野性株 の胞子 を発 芽 させ ,複 製 開始 後 複 製 さ れ る

を

で重 くラベ ル し,複 製 され た

と複製 されて い ない軽 い

と分 け た .各分画 の

を用 いて

お よ び遺伝子 地図上 の位 置 のわか って い る遺 伝 子 の変異株 を受容 菌 に形質 転換 を行 い ,各 遺 伝 子 の複 製 率 を調 べ た .表

に示 され た結 果 か ら

は

の 少 し前 ( 起点 に近 い方 ) に ,また

は

と

his

の間 に位 置 す ることが明 らか に な った . この複製 順序 によ る方 法 か らは ,お お よその位 置 しか わ か らな いので さ らに詳 しく解析 す るに は ,形 質 転 換 又 は形質 導 入 によ って連関 した遺 伝子 を探 索 しな けれ ば な らな いが ,両者 と もまだ見 っ か って い な い . ‑一 方

ら

は枯 草 菌 の複 製 開始 変 異 株 を

株

と

)同定 し.マ ッ ピン グ して い て . 前 者 は

leu

遺伝子 と,

は

遺伝 子 と連 関 して い ることを報 告 して い る. この報 告 は .

と

Gross

らの

とが同 じ遺 伝 子 の変 異 株 で あ る 可能性 を示 唆 す るが ,まだ わか って い な い .

は両者 と異 な り全 く新 しい変異 株 と患 わ れ る .

tsMH27.ts6057

両 変異 株 の遺 伝 的 解 析 に よ り . 複製 開始反応 に少 な くと も

つ の因子 が関 与 して い る ことが明 らか にな った . これ らの因子 の性 質 を明 らか にす る目的 で .それぞ れの変異 株 につ いて ,高 温 か ら 低 温 に戻 した時 の複製 再 開始 の解 析 を行 な った .

表

と

の組換 えテ ス ト

donorDNA: wild(TTd),6057(TTd) DNA ts+ 1eu' ts/1eu "tSrmwT.lLzed exp1 wild(TTd) 233 851 0.274 l.

00 6057(TTd) 292 717 0.407 1

.49 expZ wild(TTd) l84 752 0.24

5 l.00 6057(TTd) 191 466 0.

409 1.67

形 質 転 換 法

枯草菌における

複製開始反応 の道元生化学研 的究

､表

に よるマ ッピ ン グ

ReipnBlicdaUtRion markers toDta一 NA purÅ ts6057 purB his

A metB percent

replication l40mOmiinn 353.5.90

l

.5 10.3 2.9 1.4 9.0 R

eipnBlicdaUtRion p markers

urÅ IhisA tsMH27 1eu8 metB percent

replicatio

n 140min 81.7 28.0 25.8 24.4 12.3 A :32p

で標 識 した

T)

胞子

を

l中 で

時 間 チ ミン飢餓 培養 を

行 ったO その後

を加 え各 時培養 液 を採 取 した｡

168(LTT)

胞子 を

l中

℃ で

分 チ ミン飢 餓 培 養 を行 った｡ そ の後

と

l lとを同時 に加 えて

培 養 し, 各 時培養 液 を採 取 した｡

それ ぞれ 同 じよ うに以 下 の操 作 を行 った｡

低 速遠 心 で細 胞 を集 め た後

溶液 に懸濁 し, プ ロ トプ ラス トを作 らせ た｡ プ ロ トプ ラス トか ら

フ ェ ノー ル法 で

を抽 出 し,

密 度 勾配遠 心 法 に よって重 い分 画

と 軽 い分 画

に分 画 した.各分 画 の 各遺 伝 子 マ ー カ‑ に対 す る形 質 転 換 活性 を測 定 したO得 られ た形質転 換 活性 か ら

を次 式 の よ うに求 め

% replication…≡+HL(Tr㌻HL(aTrnsafonrsmaforntmasnt)+LL(s) Transfo

たo

A

の

Ⅳ .

複製再開

1.30oC

に戻 した際の 始の解析

合成 とその複製起 点

について

と

を

8oC

で

時間培 養後低 温 に 戻す と

の時間の差

はあ るが両者 と も再 び

合成 を回復す る (図

.

図

). この時

metB

比 は図

に示

す様 に

か ら

へ さ ら に

へ と変 化す る.これは高温

で複製 が終了 して いたのが低温で 再 び複製を開始 した ことを示

唆す る. しか しもっと直 接的 に複製 の再開始 を証 明す る為 .

48oC

か ら

に 戻 した後複製 され る

を

BudR

で 重 く ラベ ル し.染色体上 の複製起点

Å)

,中点

,終 点

が

Cl

密度勾配遠心分離 ′ ヾタ ー ンで 軽 い分画 (LL)か ら重 い 分 画 (H L) に 移 る頻 度

(percent replication)

を調 べ た

.図

は

p)+ LL(32p) 49 57

について ,各 マーカー

の複製 されて い く時 間 的 経 過 を示 しているが ,この結

果 は.

に戻 した場 合 ,

近傍 の正常

の複製起点 か ら複製 が 開 始 し , 逮 次的 に複製末端 に向

か って進行 して い ること を 示 す . 即 ち高温か ら低温

に戻す ことによ り変異 した機能 が 回復 し,複製が再 開始 され る.そ こ

で この機能 の回復 に対す る高分子合成阻害剤 の効果 を調 べ ,変異 の性質

を解析 した.

複製再開始 に及 ぼす

と

の 効 果 .

高温か ら低温 に戻す と同時 に

M

(

を,または低温 に戻す

分前

に

杏 加 えて ,蛋 白質 または

NA

の合成 阻害 が

の

複製開始 におよぼす効果 を

50

犬

図3 6057の30℃ に戻 してか らの複製再 開始 に及ぼすCMの阻害効果

図1と同 じ方法 で48℃ で1時間培養後,2等 分 しその一方 にのみCM(200〟g/ml)を加 え同 じspecific activityの3H‑TdR を含んだLp で2倍 に希釈 して直 ちに30℃に戻 して培養 した 30℃に戻 した時 をO timeとしてその時の3H‑

TdR の取込み量 を100として表示 した｡

塚

500050221

▲ ム V

● o s 雲

l l

) a

il

Recovery

o f

t

0 1 2 3

図4 M H27の30℃に戻 してか らの複製再開始 に及ぼす Rif,CMの効果

(SItu⊃

三〇J y I)

枯草菌におけるDNA複製開始反応の道元生化学的研究

図5 derBitytransfermethd に よる複製 再 開始の解析

ts6057を32p(1･5〟C/ml) を含んだLP培地 で

4世代以上培養 してKlet

tが

に移 して培養 し,1時間後 membrane filter (0･45p)で櫨過 して集菌 し,LPで洗い,後5‑ BudR (50pg/ml)と3HITdR (0.5pCi/ml)

を含んだ2倍容量のLPに懸濁 して30℃で培養 し た｡その後適時 15mlを採取 してDNAを抽 出 し,実験方法 に述べ た ように してCsCl密度勾配 遠心法 を行 なった｡

TotalDNAお よび各マー カーの% replica‑ tionを表2の説明文 中の式に よって求め,表示

した｡

60

40

u o

51

図6 PEAS‑11のPEAを除 いた後 の複製の再開始に及ぼすCMの効果｡

‑PEASt!u

コ

(

J ' u

! 篭 亡H 等 II

H

52

_犬

取込 みが阻害 され .

の高温 の阻害 は低 温 に戻 し て も回復 しないで新 たな蛋白合成 を必要 とす る事 が示 された ( 図

.一方

は

存在 下 で

に戻 した場合

に戻 した時点 の

量 の

%の増加が見 られた.ところが

を加 えて戻 した 場合 は,はなはだ しく

の取込 みが阻害 され わずか

の増加 が認 め られただ けで あ った ( 図

).この

による阻害効果 が複製 開 始 反 応 の 阻 害 によるのか ,複製 の継続反応 の阻害 によ るのかを調 べ る為 ,戻 してか ら適時の細 胞 か ら

を抽 出 し

比 を調 べて見 た (図

).複製再 開 始後

存在下 で培養 した細胞 の

比 は,薬剤 を含 まない場合 と同様 に

に増加 した .一 方

存在下で は.ほとん ど

に留 ま っ て い た .こ

凝

られの結果 は

において は

に戻 した 後 の複製 の再開始 に蛋白合成 は必要 と しないが

合成 を必要 とす ることを示す .即 ち ,複製 再 開 始 に 対す る

の関与 は,メ ッセ ンジャー

合 成 阻害 によ り蛋白合成がで きな くな る事 によ り間接的 に 働 いているので はな く.

自身 また は

合 成が直接的 に関与 してい ることを示 す .なお

^培

地で対数増殖 している野性株 に

又 は

を加え た場合

は両者 とも約

増 加 して 停 止 す る.この時 の

比 も約

か ら

に まで低 下す る.この事実 は

又 は

が複製 の開始 は 阻害す るが .継続反応 は阻害 しない ことを示 す .

において高温で阻害 され る ものが .複 製 開 始 に 必要 な

なのか ,蛋白なのか , この実 験 だ け で

図

の複 製再 開始 に及ぼす チ ミン飢餓 の影 響

0

Th●trTlln)

3 8 V N

● ● J

●

∝ 808 2Tlm●(hour 40

●)

MH27

を図

と同 じ方 法 で

℃ で

時 間培養 後 ,

で滅過 し, 細 胞 を

で洗 い, つ い で

種 の ア ミノ酸 (各 々

を含 む

倍 量 の

g

に 懸濁 し

A :

上 述 の懸濁 液 を た｡

等分 し, その一 万 に は直 ちに

‑

,他 方 に は

℃ で

分 チ ミン飢餓 後 (●‑ ●)

を加 えて (

とす

℃ で培養 し, 適 時

を抽 出後

比

で補 正 )を求 め る)

た｡

懸濁 液 を

℃ で

分 チ ミン飢 餓培養 後,

等分 した｡

dR を加

℃ で培養

‑

d

と

を加 え

℃ で培養 (● えて

‑ ‑

●)

を加 え

℃ で培養 ( △‑ △ ) し,各 時

に取 りこまれ

た放

射能活性 を

dR を加 えた時 (

の値 を 0と して増加 分 を%表示 した