痒み刺激により延髄および上部頸髄ニューロンに誘導され る

痒み刺激により延髄および上部頸髄ニューロンに誘導され る extracellular signal-regulated kinase のリン酸化

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

越前谷 澄 典

（指導：岩田 幸一 教授，篠田 雅路 准教授，片桐 綾乃 助教）

1

緒言

痒みは非常に不快な感覚として知られているが，その詳細な発症機構に関し ては不明な点が多く残されている。これまでの多くの研究により，痒みの発症に

は

C-線維の末梢端を形成している自由神経終末の膜上に存在する histamine

体が関与することが報告されている^1-4)。一方で，C-線維の末端部を構成する自

由神経終末には，痒みだけでなく

transient receptor potential

ATP

痒みは同様のメカニズムで引き起こされると考えられていた ⁵⁾。しかし最近，

histamine

C-線維が同定され，痛みと痒みの情

報処理は異なる末梢神経機構による可能性が考えられるようになってきた⁶⁾。脊

髄レベルにおいては，ネコ足裏への

histamine

度侵害刺激には応答しない視床投射ニューロンが存在することが報告され，脊

髄レベルにおいても

histamine

られた⁷⁾。このようなニューロンは受容野が不明瞭で，

histamine

応することから，特異的侵害受容ニューロンや広作動域ニューロンと異なり，

histamine

る三叉神経脊髄路核ニューロンにおいて，histamine, chloroquineおよび

capsaicin

2

を顔面皮下に注入することによって発現する

c-Fos

いて，侵害刺激と痒み刺激とが同一ニューロンによって活性化する可能性も示 されている⁸⁾。以上の結果から，痒みの情報処理において，三叉神経脊髄路核ニ ューロンは痒み特異的な応答を示すものと，侵害情報と痒み情報の両方の情報 処理に関係したものが存在する可能性があると考えられる。これまでの複数の

研究で用いられてきた

c-Fos

ら，Vcにおける様々な介在ニューロンの興奮が引き起こされた後の結果しか見 ることがでず，刺激後の早い時間に起こる現象の解析には適さない。一方，ニュ

ーロンに発現する

MAP kinase

extracellular

signal-regulated kinase

っており，リン酸化

ERK（pERK）は興奮マーカーとして用いられている。

口腔顔面領域を支配する

C-線維刺激によって数分以内に Vc

C1-C2

分布するニューロンにおいて

ERK

た，抗

pERK

的に増加することが明らかにされている。このようなことから，

pERK

は口腔顔面の

C-線維入力を受けて興奮したニューロンである可能性が高いとさ

れている。

そこで，本研究では，痒み刺激によって早期に活動するニューロンを視覚化す

3

る手段の一つとして，pERK を指標とし，痒みを誘発することが知られている

histamine

pERK

おける分布様式を検索し，痒み感覚情報処理機構の一端を明らかにした。

4

材料および方法

本研究は，日本大学歯学部実験動物委員会の許可（AP16D008）を得，同委員 会の指針および国際疼痛学会の基準に従って行われた ¹⁰⁾。実験には

Sprague-

Dawley

10

１．

Histamine

2% isoflurane

sodium pentobarbital（80 mg/kg, i.p.）で深く

麻酔したラットを保温パッド上に仰臥位にした状態で，

0.9％

した

histamine

た，

vehicle

0.9

とした。

histamine

5

500 ml

0.1 M phosphate

buffer

4% paraformaldehyde

固定を行った。灌流固定終了後に延髄を含む全脳部位を摘出し，同様の固定液で

4℃にて 2

２． 抗

pERK

取り出した脳脊髄標本を

0.01 M phosphate buffered saline（PBS）にて希釈した

5

20%

その後、脳標本を

O.T.C. Compound（Sakura Finetek，Torrance，CA，USA）で

包埋してドライアイスで凍結し，三叉神経脊髄路核を含む延髄の連続切片標本

（厚さ

50 μm）を作製して 3

1

nickel-cobalt

3.3’-diaminobenzidine tetra hydrochloride

Sigma， St Louis，

MO，USA）染色を施した。まず，厚さ 50 μm

0.3% H

O

0.01 M PBS

に

30

5

3

(NGS)-PBS

1

rabbit anti-phospho-p44/42 MAP kinase antibody (1: 1000，Cell Signaling Technology,

U.S.A)

4℃で 3

0.01 M PBS

10

3

いで切片を二次抗体である

biotinylated goat anti-rabbit IgG (H+L) (1: 500，Vector

Labs，Burlingame，

)

2

ABC kit (Vector

Labs，Burlingame，CA, USA)

1

による

10

3

DAB

用いて反応産物を可視化した。次いで，切片を

0.01 M PBS

MAS-GP

(Matsunami， Tokyo， Japan)でコートしたスライドガラスに貼り付け，室温にて乾

燥させた後，アルコールとキシレンにより脱水・透徹を行い，封入した。また，

6

pERK

DAB

(Micro Bright Field Bioscience， Williston， VT， USA)

pERK

細胞の分布状態および細胞数の解析を行った。

３． 統計学的解析

データは平均 ± 標準誤差で表し，有意差検定には

Student’s t-test

また，有意水準は

p < 0.05

7

結果

本研究では麻酔ラットの口ひげ部皮下に

histamine

Vc

髄および

C1-C2

ERK

その結果，

Vc， RF， C1-C2

NTS

pERK

１． 延髄および C1-C2 領域における pERK 陽性細胞発現

第１図には，口ひげ部皮下に

histamine

vehicle

5

過したラットの延髄において，Vcおよび孤束核（NTS）で観察された pERK陽 性細胞の代表例を示した。

pERK

Vc

NTS

いては少数であった。また，本研究で観察された

pERK

び核が共に黒色に濃染された小型の円形を呈するものと，第１図

E

うに線維状の構造物を有し比較的大型の楕円形の細胞体を有するものが観察さ れた。

本研究では，細胞質および核が黒色に濃染された細胞を免疫陽性細胞と判断

して顕微鏡下で検出し，

Neuro-Lucida

て

pERK

Neuro-Lucida

にて切片を描画した分布図を示した。この分布図から明らかなように，

histamine

8

および

vehicle

Vc

おいてより多くの陽性細胞を認めたのに対し，

NTS

Vc

RF

いては刺激測でやや多い傾向を認めたが有意な左右差はなかった。

２． Vc および C1-C2 領域における pERK 陽性細胞の吻尾側方向の広がり

本研究ではさらに，多くの

pERK

Vc

陽性細胞数の吻尾側方向の分布様式について解析を行った。第３図に示したよ

うに，

pERK

histamine

1800

m

obex

600 m

1800 m

vehicle

pERK

対し，histamine 投与の反対側においては，第４図に示したように，吻側から尾 側にかけて，

pERK

histamine

pERK

obex

300 m

600 m

2400

m

3300 m

vehicle

は吻側から尾側にかけて一様な分布を示した（第３図および第４図）。

9

３． Vc および C1-C2 領域における pERK 陽性細胞数の比較

Vc

C1-C2

pERK

に示した。本研究では

Vc

C1-C2

pERK

数を加算して，histamine投与群と

vehicle

果，histamine注入と同側および対側ともに，注入群の方が

vehicle

意に多かった（同側：p < 0.01，対側：p < 0.05）。

10

考察

１． 顔面皮膚の痒みに対する

Vc

C1-C2

従前の研究から

Vc

C1-C2

む様々な感覚情報が投射すると報告されている ¹¹⁾。これらの領域は細胞が層構

造をなして配列しており，表層部には無髄の

C-線維が深層には有髄の A-線維

Vc

C1-C2

呼ばれている^12,13)。また，第一層には強い侵害刺激にのみ反応を示す

NS

ロンおよび侵害刺激と非侵害刺激の両方に反応する

WDR

れ，深層には

WDR

られている ¹⁴⁾。これまでの脊髄後角の侵害受容ニューロン活動を解析した研究

では，多くの

WDR

histamine

spike

応答を増加させ，これらは脊髄表層だけでなく深層からも検出されたと報告さ

れている¹⁵⁾。また，これらの

WDR

histamine

が拡大したと報告されている¹⁶⁾。一方，本研究では

histamine

の投与によって検出された

pERK

Vc

C1-C2

から検出された。従って，histamine 投与によって興奮する

Vc

C1-C2

ューロンは主に顔面皮膚の

C-線維入力を受ける可能性があると考えられる。ま

11

た，histamine投与に反応する

WDR

C-線維の入力だけでなく，有

髄の

A-線維入力を受けた介在ニューロンから間接的に入力を受ける可能性が高

い。

また，本研究で検出された

pERK

E

たように，小型の細胞体を有するものと，矢印で示した線維状の構造物を有する 大型の細胞も多数検出された。これまでの，脊髄後角ニューロンの形態を解析し た研究から，上位中枢へと投射軸索を送る投射ニューロンの多くは脊髄後角の 表層に分布し，その細胞体は扁平で大型であるといわれている ¹⁷⁾。一方で，局 所介在ニューロンは小さな細胞体を有する円形の細胞であることが明らかにさ れている。以上のことから，histamine 投与によって発現した

pERK

は投射ニューロンと介在ニューロンの両方が含まれると考えられる。おそらく，

histamine

介在ニューロンは痒み感覚の変調に関与していると推察される。

これまでの口腔顔面の侵害入力を受ける

Vc

C1-C2

る

pERK

capsaicin

注入によって検出される

pERK

obex

域であるといわれている⁹⁾。本研究で検出された

pERK

これまでに報告された口ひげ部への

capsaicin

pERK

12

が認められた領域とほぼ一致していた。このことから，histamine 投与によって この領域に発現した

pERK

C-線維入

力だけでなく，皮膚の侵害情報を伝える

C-線維や A-線維からの入力も受けてい

る可能性があると考えられる。

histamine

Vc

C1-C2

害受容ニューロンの多くは皮膚の侵害情報処理に対しても重要な役割を担って いる可能性がある。

２．

NTS

RF

本研究では

Vc

C1-C2

NTS

RF

下への histamine 投与によって

pERK

NTS

RF

18)。特に

NTS

を有する核として知られており¹⁹⁾，histamine刺激によって活性化し

pERK

現したニューロンは痒みの感覚情報処理だけでなく，痒み感覚に随伴した自律 神経系の調節にも関与する可能性が考えられる。また，RFは自律神経系の調節 だけでなく，全身の侵害入力を受けるニューロンが存在することが知られてい る²⁰⁾。従って，histamine刺激によって駆動され

pERK

痒み感覚情報処理と同時に全身の痛覚情報処理にも関与する可能性がある。

13

結論

麻酔ラットの口ひげ部皮下への

histamine

における

pERK

た。

１．口ひげ部皮下へ

histamine

Vc

腹側部の

RF

NTS

２．

histamine

Vc

C1-C2

pERK

陽性細胞発現を認めたのに対し，

NTS

RF

右差は認められなかった。

３．pERK陽性細胞は

histamine

1800

m

600 m

1800 m

histamine

pERK

４．Vcおよび

C1-C2

pERK

histamine

入と同側および対側ともに，注入群の方が

vehicle

以上から，顔面領域の痒み情報処理は

obex

Vc

C1-

C2

14

は上位中枢へ痒み情報を送るのに対し，小型のニューロンは局所回路を形成し て痒み情報調節に関与している可能性が示された。

文 献

1) Kuraishi Y (2015) Methods for preclinical assessment of antipruritic agents and itch

mechanisms independent of mast-cell histamine. Biol Pharm Bull 38, 635-644.

2) De Benedetto A, Yoshida T, Fridy S, Park JE, Kuo IH, Beck LA (2015) Histamine and

skin barrier: Are histamine antagonists useful for the prevention or treatment of

atopic dermatitis? J Clin Med 4, 741-755.

3) Werfel T, Biedermann T (2015) Current novel approaches in systemic therapy of atopic

dermatitis: specific inhibition of cutaneous Th2 polarized inflammation and itch.

Curr Opin Allergy Clin Immunol 15, 446-452.

4) Chuquilin M, Alghalith Y, Fernandez KH (2016) Neurocutaneous disease: Cutaneous

neuroanatomy and mechanisms of itch and pain. J Am Acad Dermatol 74, 197-

212.

5) Andresen MC, Hofmann ME, Fawley JA (2012) The unsilent majority-TRPV1 drives

"spontaneous" transmission of unmyelinated primary afferents within

15

cardiorespiratory NTS. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 303, 1207-1216.

6) Andersen HH, Sorensen AR, Nielsen GA, Molgaard MS, Stilling P, Boudreau SA,

Elberling J, Arendt-Nielsen L (2017) A test-retest reliability study of human

experimental models of histaminergic and non-histaminergic itch. Acta Derm

Venereol, 97, 198-207.

7) Andrew D, Craig AD (2001) Spinothalamic lamina I neurons selectively sensitive to

histamine: a central neural pathway for itch. Nat Neurosci 4, 72-77.

8) Jinks SL, Simons CT, Dessirier JM, Carstens MI, Antognini JF, Carstens E (2002) C-

fos induction in rat superficial dorsal horn following cutaneous application of

noxious chemical or mechanical stimuli. Exp Brain Res 145, 261-269.

9) Noma N, Tsuboi Y, Kondo M, Matsumoto M, Sessle BJ, Kitagawa J, Saito K, Iwata K

(2008) Organization of pERK-immunoreactive cells in trigeminal spinal nucleus

caudalis and upper cervical cord following capsaicin injection into oral and

craniofacial regions in rats. J Comp Neurol 507, 1428-1440.

10) Zimmermann M (1983) Ethical guidelines for investigations of experimental pain in

conscious animals. Pain 16, 109-110.

11) Sessle BJ (1999) Neural mechanisms and pathways in craniofacial pain. Can J Neurol

Sci 26 Suppl 3, S7-11.

16

12) Okamoto K, Tashiro A, Thompson R, Nishida Y, Bereiter DA (2012) Trigeminal

interpolaris/caudalis transition neurons mediate reflex lacrimation evoked by

bright light in the rat. Eur J Neurosci 36, 3492-3499.

13) Iwata K, Imamura Y, Honda K, Shinoda M (2011) Physiological mechanisms of

neuropathic pain: the orofacial region. Int Rev Neurobiol 97, 227-250.

14) Iwata K, Tashiro A, Tsuboi Y, Imai T, Sumino R, Morimoto T, Dubner R, Ren K

(1999) Medullary dorsal horn neuronal activity in rats with persistent

temporomandibular joint and perioral inflammation. J Neurophysiol 82, 1244-

1253.

15) Jinks SL, Carstens E (2000) Superficial dorsal horn neurons identified by

intracutaneous histamine: chemonociceptive responses and modulation by

morphine. J Neurophysiol 84, 616-627.

16) Akiyama T, Nagamine M, Davoodi A, Iodi Carstens M, Cevikbas F, Steinhoff M,

Carstens E (2015) Intradermal endothelin-1 excites bombesin-responsive

superficial dorsal horn neurons in the mouse. J Neurophysiol 114, 2528-2534.

17) Lu GW, Willis WD (1999) Branching and/or collateral projections of spinal dorsal

horn neurons. Brain Res Brain Res Rev 29, 50-82.

18) Sevoz-Couche C, Brouillard C (2016) Key role of 5-HT3 receptors in the nucleus

17

tractus solitarii in cardiovagal stress reactivity. Neurosci Biobehav Rev, in press.

19) Tsujimura T, Kondo M, Kitagawa J, Tsuboi Y, Saito K, Tohara H, Ueda K, Sessle BJ,

Iwata K (2009) Involvement of ERK phosphorylation in brainstem neurons in

modulation of swallowing reflex in rats. J Physiol 587, 805-817.

20) Liu RH, Tang JS, Hou ZL (1989) Electrophysiological identification of spinally

projecting neurons in the lateral reticular nucleus of the rat. Brain Res 481, 350-

355.

18

19

20