課程博士論文要旨
DE 9903 氏名 中島 和英
論文題名 食肉からの腸管出血性大腸菌0157・H7の 検査法に関する研究
主査
副査 丸山
福山正文教授
務 教授
本田政幸教授 清水義治教授
腸管出血性大腸菌0157：H：7（以下；0157）は、1982年に米国で発 生したハンバーガーを喫食したことを原因とする集団食中毒の患者 からRilyら（1983）により初めて分離され報告された。それ以降、
0157による感染症は、カナダおよび英国等の先進国で多発している。
そのため世界規模で新興感染症としての監視および予防対策が求め られている。我が国では、小林ら（1985）によって1984年に大阪で 発生した散発下痢症から分離した菌株から初めて確認され、その後
1990年に：埼玉県の幼稚園で、飲料水中の0157による集団発生が起こ り注目された。その後毎年各地で散発的に発生していたが、1996年 に堺市の小学校を中心とした集団食：中毒は、世界的にも類を見ない大 規模なものとなり世界中の専門家から注目された。
0157の感染源および感染経路については、初めて報告されて以来、
各国の研究者により精力的に調査が行われ、ウシが高率に保菌してい ること、および食中毒原因食品として、牛肉が密接に関与しているこ とが明らかにされた。
食品における0157の検査法は、培養法やE：LISA法等数多く報告 されている。我が国においては、厚生労働省から「腸管出血性大腸菌 0157の検査法について」（1997）が標準検査法として示されている。
しかし、本検査法は正確な検査結果は得られるが、検査技術を要し迅 速性も欠けるため行政検査等では有効であるが、食品工場の衛生管理 上の検査法としては不向きである。そのため、食品工場の衛生管理上 の検査法は、一般的にノボビオシン加mEC培地を用いて増減培養を 行い、その培養液をソルビトールマッコンキー培地で分離培養後、平 板上に疑わしいコロニーが認められた場合に0157免疫抗体による凝 集試験を行ういわゆる「簡易培養法」が広く汎用されている。しかし、
簡易培養法でも、平板上のコロニーの判定等に経験を要し、迅速性も 十分ではない。
そこで、著者は、食品工場の衛生管理上の0157検査を正確で迅速 かつ合理的に行うための検査方法を検討した結果、新たに検査方法を 開発するのに要する時間およびコストの面から市販の0157検出キッ
トを使用することが最善であると考えた。市販の0157検出キットは、
大きく分けE：LISA法を用いたキットとPCR法を用いたキットが市販 されている。E：LISA法を用いたキットは、迅速および簡便であるが、
同一抗原を持つ競合菌との交差反応により偽陽性の誤判定になる可 能性がある。一方、PCR法を用いたキットは、検査結果は正確ではあ るが操作が煩雑であり経験が必要とされて来たが、最近では細菌の遺 伝子解析等、PCR法を用いた検査がルーチン検査化されてきている。
今回著者は、プライマー、ポリメラーゼおよびヌクレオチドが一つの 錠剤に加工され、操作が著しく簡便であり、0157の有無をPCR反応 後、電気泳動で判定する米国のQuaulicon社製「BAXTMスクリーニン グシステム」に着目し「BAXTMスクリーニングシステム（以下；PCR キット法）」と「簡易培養法」との検出限界を非加熱および60℃で10 秒間加熱ダメージを与えた0157のVT2産生株およびVT 1＆2産生株 のそれぞれ2菌株について検討し、また食品の中で特に0157汚染が 危惧される食肉における0157検査法として、0157に汚染されてい ない4種類の市販食肉（牛肉、豚肉、鶏肉、牛レバー）を用いて0157 のVT2産生株およびVT 1＆2産生株の2菌株を接種して検出限界を調 査し、その検査所要時間、操作性および検査コストについて比較し食 肉加工工場における衛生管理上の0157検査の実用性を検討した。
また、著者はPCRキット法のみならず0157検査のより一層の迅 速化および食肉製品類等の加熱工程により加熱ダメージを受けた極 少量の0157を確実に増菌させるため、非加熱および60℃で10秒間 加熱ダメージを与えた上記の0157の2菌株を用いて三三培地（ノボ
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ビオシン加mEC培地およびトリプトソイブイヨン培地）、培養方法
（静置培養および振とう培養）、培養温度（37℃および42。C）および 培養時間（5、10および20時間）を組み合わせ、増菌培養の条件を 検討した。その結果は以下の通りである。
1）PCRキット法の0157の2菌株の検出限界は、非加熱およ び加熱ダメージを与えた菌株は共に105cfu！m1であった。
2）簡易培養法では、 0157の2菌株の非加熱および加熱ダメ ージを与えた菌株は、104cfu／m l以上でなければ検出でき なかった。
3）牛肉、豚肉、鶏肉および牛レバーに0157の2菌株を肉重 量25g当たり100〜103cfuの4段階になるように接種後、
ノボビオシン加mEC培地を用いて37。Cで20時間増菌培 養を行った場合、PCRキット法の検出限界は2菌株ともに、
牛肉、豚肉および牛レバーでは肉重量25g当たりの接種菌 量が100cfuで検出できたが、鶏肉ではやや低く肉重量25g 当たりの接種菌量が101cfuであった。
4）牛肉、豚肉、鶏肉および牛レバーに0157の2菌株を肉重 量25g当たり100〜103cfuの4段階になるように接種後、
ノボビオシン加mEC培地を用いて37℃で20時間増菌培 養を行った場合、簡易培養法の検出限界は、牛肉では肉界 量25g当たりの接種菌量がVT2産生株は102cfu、 VT1＆2 産生株は101cfu、豚肉および鶏肉では2菌株とも肉重量25g 当たりの接種菌量が101cfu、牛レバーでは肉重量25g当た りの接種乳量がVT2産生株は103cfu、 VT 1＆2産生株は 102cfuで検出された。
5）PCRキット法と簡易培養法の実用性を比較検討した結果は、検査 所要時間は簡易培養法では40時間、PCRキット法では25時間 であり、PCR法は簡易培養法の約2！3の時間で検査が終了した。
また操作性は、簡易培養法は釣菌技術および分離培地に発育した コロニーの判定に経験が必要であるが、PCRキット法は、主な試 薬が錠剤化されているためマイクロピペットの操作が正確に出 来れば検査ができた。
6）0157の増菌培養の迅速化は、培地種類、培養温度に係わ らず振とう培養を行うことが効果的であった。
以上のことから、食品工場の衛生管理上の0157検査法とし て、現在食：品工場で広く汎用されている「簡易検査法」より米国 Qualicon社製のrBAxTMスクリーニングシステム」を使用すること により正確で迅速かつ合理的に行えることを明らかにした。また、
0157検査のなお一層の迅速化として、増菌培養iを行うとき振とう培 養を行うことにより増菌培養時間を短縮できることを明らかにした。
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学位申言青論文
食肉からの腸管出血性大腸菌0■57：H7の 検査法に関する研究
DE9 9 0 3
中島禾ロ英［論文審査の結果の要旨コ
主査 ネ畠口」正文
副査 本田政幸
畠り査 丸口」 務
副査 清水義治
2002年3，月■■日
腸管出血性大腸菌0157：H7（以下；0157）は、1982年にRilyらが米国のオレゴン 州でハンバーガーを喫食したことを原因とする集団食中毒の患者から初めて分 離した。それ以降、0157による感染症は、カナダおよび英国などの先進国で多 発している。そのため世界規模で新興感染症としての監視および予防対策が求
められている。我が国では、小林ら（1985）によってさかのぼり調査が行われ、
1984年に大阪で発生した散発下痢症から分離された株から初めて確認された。
その後1990年に埼玉県の幼稚園で、飲料水中の0157による集団発生が起こり注 目された。その後毎年各地で散発的に発生していたが、1996年に堺市の小学校 を中心とした集団食中毒は、世界的にも類を見ない大規模なものとなり世界中 の専門家から注目された。また、0157の感染源および感染経路については、各 国の研究者により精力的に調査が行われ、ウシが高率に保菌していること、お よび食中毒原因食品として、牛肉が密接に関与していることが明らかにされた。
食品における0157の検査法として、我が国においては、厚生労働省から「腸管 出血性大腸菌0157の検査法について」（1997）が標準検査法として示されている。
しかし、本検査法は正確な検査結果は得られるが、検査技術を要し迅速性も欠 けるため行政検査として有効であるが、食品工場における衛生管理上の検査法 としては不向きである。そのため、食品工場の衛生管理上の検査法は、一般的 にノボビオシン加mEC培地を用いて増菌培養を行い、その培養液をソルビトール マッコンキー培地で分離培養後、平板上に疑わしいコロニーが認められた場合 にO157免疫抗体による凝集試験を行ういわゆる「簡易培養法」が広く汎用されて いる。しかし、簡易培養法でも、平板上のコロニーの判定等に経験を要し、迅 速性も十分野はない。
著者は、上述のことから食品工場の衛生管理上の0157検査を正確でより迅速 に行う検査方法を検討するため、今回、従来のPCR法に比べ、プライマー、ポリ メラーゼおよびヌクレオチドが一つの錠剤に加工されているため、操作が著し く簡便な米国のQuaulicon社町「BAXT蘭スクリーニングシステム」に着目し「BAXT巖スク リーニングシステム（以下；PCRキット法）」と「簡易培養法」との検出限界を比 較検討した。0157のVT2産生株およびVT 1＆2産生株の2株を非加熱処理した条件と 60℃で10秒間加熱ダメージを与えた条件でそれぞれ用い、0157に汚染されていな い4種類の市販食肉（牛肉、豚肉、鶏肉、牛レバー）に0157のVT2産生株および
VT1＆2産生株の2菌株をそれぞれ接種して検出限界を測定した。その検査所要時 間、操作性および検査コストについて比較し食：肉加工工場における衛生管理上 の0157検査の実用化を検討した。また、0157検査をより一層の迅速化を図るた め、増熱培地（ノボビオシン加nEC培地およびトリプトソイブイヨン培地）、培 養方法（静置培養および振とう培養）、培養温度（37℃および42℃）および培養 時間（5、10および20時間）を組み合わせ、増菌培養の迅速化を確立した。その 概要は以下の通りである。
1）PCRキット法で非加熱および加熱ダメージを与えたO157の2菌株（VT2株、 VT 1／VT2株）はいずれの条件においても菌量は105cfu／m1、簡易培養法でもPCRキット 法と同様にいずれの条件でも菌量は10㌔fu／m1でなければ、それぞれ麹菌の検出 は不可能であった。
2）牛肉、豚肉、鶏肉および牛レバーに0157の2菌株を10。一103cfu／25gの4段階 になるように接種し、ノボビオシン加nEC培地を用いて37℃で20時間増菌培養し た。その試料を用い、PCRキット法で検出限界を検討したところ、供試した2菌一 株はともに、牛肉、豚肉および牛レバーでは100cfu／25gから検出されたが、鶏肉 ではやや低く101cfu／25gから検出された。一方、簡易培養法の検出限界は、牛肉 ではVT2産生株が102cfu／25g、 VTI翠産生株が101cfu／25g、豚肉および鶏肉では2菌
株ともに101cfu／259、牛レバーではVT2産生株が103cfu／259、 VT1＆2産生株が10・
cfu／25gから検出された。
3）PCRキット法と簡易培養法の実用性を比較検討したところ、検査所要時間に おいて簡易培養法では40時間、PCRキット法では25時間であり、PCR法が培養法 に比べ、約2／3の時間で検査が終了した。また操作性では、簡易培養法は釣菌技 術および分離培地に発育したコロニーの判定に経験などの煩雑性があるため、
操作法に問題がある。これに対し、PCRキット法は、主な試薬が錠剤化されてい るため、的確に検査試料を加えマイクロピペットの操作が正確に出来れば検査
ができた。
4）0157の増菌培養の迅速化を試みたところ、培地種類や培養i温度に係わらず 振とう培養を行うことが効果的であった。
以上の研究成績から、食品工場の衛生管理上の0157検査法として、現在食品
工場で広く汎用されている「簡易培養法」に比較し、米国Qual i con社製の「BAXTMス
クリーニングシステム」を使用することが正確でより迅速に行えることが明らか にされた。また、0157検査のなお一層の迅速化として、増菌培養方法において、
静置培養に比べ、振とう培養の方が優位に菌量の増加が見られることから振と う培養法を取り入れることにより0157の検査時間を短縮できることが明らかに
された。
以上のように本研究は食：肉からの腸管出血性大腸菌0157：H7の検査法の迅速化 に関する研究として、細菌学上、公衆衛生学上高く評価される業績であり、博 士（学術）の学位授与に値するものと認める。
