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Title
「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」９．根尖部歯
周組織の病態生物学
Author(s)
村松, 敬; 木村, 麻記; 東川, 明日香; 大野, 建州; 菊
池, 有一郎; 喜田, 大智; 国分, 栄仁; 柴山, 和子; 櫻
井, 敦朗; 澁川, 義幸; 齋藤, 淳; 石原, 和幸
Journal
歯科学報, 119(5): 365-370
URL
http://doi.org/10.15041/tdcgakuho.119.365
Right
Description
はじめに 「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」シリー ズは，これまでに７回が本誌に発表されている。大 きな４つのプロジェクトについては既に各グループ から報告があった通りであるので，そちらを参照さ れたい。本稿では歯周病プロジェクト（グループ リーダー：石原和幸教授（微生物学講座））の研究の 一端として「根尖部歯周組織の病態生物学」につい て 紹 介 す る。特 に こ れ ま で 著 者 が 行 っ て き た 「Malassez 上皮遺残」と「セメント芽細胞」の研 究について紹介する。 Malassez 上皮遺残細胞 Malassez 上皮遺残は発生学的には，内エナメル 上皮と外エナメル上皮が歯頸部で合わさり Hertwig 上皮鞘となり，これが下方に伸びて歯根の外側を作 るようになる。Hertwig 上皮鞘は細胞間隙が網目状 （fishnet 状）に開くようになることで標本上，断裂 するようにみえるものを Malassez 上皮遺残とい う。この細胞集団は歯根膜のセメント質寄りの位置 に存在し，炎症などの刺激のない場合には歯根膜内 で静止状態を維持している歯原性上皮細胞である。 機能については歯根嚢胞の裏装上皮形成に関与して いるという報告もあるが（図１），不明な点が多く， 依然として「謎の細胞」という印象が強い。これま でに Malassez 上皮遺残に機械的刺激を与えること で細胞増殖が促進されること，アポトーシスを生じ る細胞が増えることを明らかとしてきた１） 。そこで 顎骨疾患プロジェクトでは細菌感染や炎症との関係 をみることとした。 Malassez 上皮遺残の遊走と炎症性サイトカイン 感染根管では根管内の細菌が原因で根尖周囲組織
歯学の進歩・現状
「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」
９．根尖部歯周組織の病態生物学
村松 敬
１）２）３）木村麻記
１）２）４）東川明日香
１）２）４）大野建州
１）２）菊池有一郎
１）２）５）喜田大智
１）２）６）国分栄仁
１）２）５）柴山和子
１）２）５）櫻井敦朗
１）２）７）澁川義幸
１）２）４）齋藤 淳
１）２）６）石原和幸
１）２）５） キーワード：私立大学研究ブランディング事業，顎骨疾患 プロジェクト，根尖部歯周組織，セメント芽 細胞，Malassez 上皮遺残 １）東京歯科大学口腔科学研究センター ２）東京歯科大学研究ブランディング事業 ３）東京歯科大学保存修復学講座 ４）東京歯科大学生理学講座 ５）東京歯科大学微生物学講座 ６）東京歯科大学歯周病学講座 ７）東京歯科大学小児歯科学講座 （２０１９年７月３０日受付，２０１９年９月１０日受理） http : //doi.org/１０.１５０４１/tdcgakuho.１１９.３６５ 連絡先：〒１０１‐００６１ 東京都千代田区神田三崎町２−９−１８ 東京歯科大学保存修復学講座 村松 敬Takashi MURAMATSU１）２）３），Maki KIMURA１）２）４），
Asuka HIGASHIKAWA１）２）４），Tatsukuni OHNO１）２），
Yuichirou KIKUCHI１）２）５），Daichi KITA１）２）６），
Eitoyo KOKUBU１）２）５），Kazuko SHIBAYAMA１）２）５），
Atsurou SAKURAI１）２）７），Yoshiyuki SHIBUKAWA１）２）４），
Atsushi SAITOU１）２）６），Kazuyuki ISHIHARA１）２）５）: Report
from the Jaw Bone Disease Project ９ : Pathobiology of apical periodontal tissue（１）Oral Health Science Center,
Tokyo Dental College,２）Tokyo Dental College Research
Branding Project,３）Department of Operative Dentistry,
Cariology and Pulp Biology, Tokyo Dental College,４）
De-partment of Physiology, Tokyo Dental College,５）
Depart-ment of Microbiology, Tokyo Dental College,６）
Depart-ment of Periodontology, Tokyo Dental College,７）
Depart-ment of Pediatric Dentistry, Tokyo Dental College） ３６５
に炎症を引き起こし，根尖性歯周炎が成立すること は知られている。根尖性歯周炎のひとつの病態であ る歯根嚢胞では，Malassez 上皮遺残が裏装上皮形 成の一助を担うと考えられている。通常時には静止 している Malassez 上皮遺残細胞が炎症時には増殖 や遊走し，裏装上皮を形成するというものである。 根尖性歯周炎では一般の炎症と同様に炎症性サイ トカインが産生されるが，歯根嚢胞の嚢胞壁およ び嚢胞内容液からも炎症性サイトカインである in-terleukin−６（IL−６）が 検 出 さ れ て い る。IL−６ は 急 性 期 炎 症 反 応，骨 吸 収 に 関 与 し て い る が， Malassez 上皮遺残や歯根嚢胞の裏装上皮形成との 関 連 は 不 明 で あ る。そ こ で IL−６刺 激 に よ る Malassez 上皮遺残の増殖能および遊走能の変化を 調べた。 培養したブタ由来 Malassez 上皮遺残細胞に re-combinant IL−６（１００pg/mL）を添加し細胞増殖， 細胞遊走能，細胞接着因子（integrinα３）の変化を 観察した。その結果，IL−６による Malassez 上皮 遺残細胞の増殖能の変化は時間依存性に上昇傾向を 示し，wound healing assay では，IL−６刺激群は 非刺激群と比較して有意に創閉鎖率が上昇した（図 ２）。IL−６刺激時に IL−６に対する中和抗体を作 用させたところ増殖能，遊走能ともに IL−６刺激 群と比較して有意に低下し（p＜０．０５），対照群と同 程度の値を示した。免疫蛍光染色では，創部へ向け 伸展した細胞突起の先端部に integrinα３の蛍光像 を認めた（図３）。これらの結果より，根尖性歯周 炎 が 生 じ る と IL−６が 多 量 に 産 生 さ れ，そ れ に Malassez 上皮遺残細胞が反応して，増殖能と遊走 能を促進すると考えられた２） 。 Malassez 上皮遺残の運動抑制 上記のように Malassez の上皮遺残が，根尖性歯 周炎の際に産生される IL−６に反応して増殖能と 遊走能することで裏装上皮になり得ることが示唆さ れた。裏装上皮の存在は，歯根嚢胞の難治性につな がるため外科的処置が対象となることが多い。そこ で Malassez 上皮遺残細胞の細胞活性を抑制するこ とができないか検討した。細胞が遊走する際には細 胞内のアクチンフィラメントが動くことが必要とな 図２ IL−６刺激での Malassez 上皮遺残細胞の運動能の変化 培養 Malassez 上皮遺残細胞を IL−６で刺激すると運動能は亢進するが（a），IL−６に対する中和抗 体を添加することで運動能を抑制することができる（b）。 図１ 根尖性歯周炎の病理組織像 形質細胞やリンパ球を主体とした炎症性細胞 浸潤に混じて Malassez 上皮遺残細胞が増殖し つつある。 ３６６ 村松，他：根尖部歯周組織の病態生物学 ― ２ ―
るので，アクチンフィラメントを動かないようにす ることができれば細胞活性と細胞増殖を抑制するこ とができると考えて，アクチンフィラメントを安定 化させる jasplakinolide を Malassez 上 皮 遺 残 細 胞 に作用させた際の細胞活性の抑制と，アポトーシス の誘導をブタ由来の Malassez 上皮遺残細胞を用い て検討した。細胞活性については jasplakinolide 添 加群では濃度依 存 性 に 有 意 に 低 下 し て お り（p＜ ０．０１），１μM の濃度では低下が顕著となった。こ の結果をうけて１μM の jasplakinolide のアポトー シスに対する影響を検索し，jasplakinolide 処理群 ではアポトーシスを生じた細胞が対照群と比較して 有意に増加していることを明らかとした（図４）。 形態学的には対照群ではアクチンフィラメントが 伸展する像が認められたが，jasplakinolde 添加群 では細胞質の収縮と核の断片化が認められ，アポ トーシスが生じたことが確認された（図５）。これら の結果からアクチンフィラメントの重合安定化によ り，細胞活性の低下とアポトーシスの誘導が生じた と考えられた３） 。従来の外科的な治療法も重要であ ることは間違いないが，薬剤を用いてアクチンフィ ラメントの重合を安定化させ，Malassez 上皮遺残 をアポトーシスに導くというような生物学的な治療 法の開発への足がかりとなる結果であった。 Malassez 上皮遺残細胞研究の今後の展望 Malassez 上皮遺残細胞は依然として謎の細胞で あることは変わりないが，近年，ヒト歯根膜中から 得られた Malassez 上皮遺残が幹細胞の性格を有し ているという報告があり４，５） ，ここから新たな幹細胞 研究へと発展することが期待されている。 セメント芽細胞 セメント質は，歯周組織のひとつでありセメント 芽細胞によって作られることはよく知られている。 歯周病においては歯槽骨がターゲットとなることが 多いが，結合組織性付着には歯根膜，セメント質の 新生も重要である。また根管治療後の根尖孔閉鎖は セメント質によって行われる骨性瘢痕治癒が理想的 な治癒形態であるが（図６），起こる場合と起こらな い場合では何が違うのかが明らかではない。さらに は低アルカリフォスファターゼ症モデルマウスでの 研究ではセメント質の部分的欠損 が 生 じ て い る が６），なぜこのような現象がみられるのかは不明で あり，セメント芽細胞の生物学的意義は興味深いと
図３ 培養 Malassez 上皮遺残細胞を IL−６で刺激した時には創部へ向け伸展した細胞突起の先端部に in-tegrinα３の局在がみられるが，中和抗体を入れると局在が点状となる（a：control，b：IL−６刺激時， c：IL−６と IL−６中和抗体添加時）。 図４ 培養 Malassez 上皮遺残細胞に jasplaki-nolide を作用させてアクチンフィラメント を安定化させるとアポトーシスを生じる細 胞が増加する。 歯科学報 Vol．１１９，No．５（２０１９） ３６７ ― ３ ―
ころである。 セメント質研究はあまり進んでいないのが現状で ある。これはセメント芽細胞の樹立が困難であった ことや，セメント芽細胞特異的マーカーがなかった こともあげられる。近年，セメント芽細胞由来細胞 がヒトやマウスで樹立され，マーカーとなり得る候 補も見つかってきており，セメント芽細胞研究が進 むようになってきた。本稿ではセメント芽細胞と機 械的ストレス，アルカリ環境について述べる。 セメント芽細胞と機械的ストレス セメント質は咬合力等の機械的な刺激を受けてい ることから，その表面に存在するセメント芽細胞も 刺激を受けていると考えられる。しかしながらこれ まで機械的刺激に対するセメント芽細胞の反応につ いては不明な点が多い。そこで培養ヒトセメント芽 細胞に対して荷重をかけた際の反応を検討した。培 養ヒトセメント芽細胞にカバーガラスを用いて０．２５ gf/cm２ の荷重を１２時間かけ，細胞増殖，形態変化， 硬組織形成マーカーの発現を検討したところ，細胞 増殖については対照群，荷重群ともに経日的に増殖 したが，両群間に有意差はみられなかった。細胞形 態の変化について荷重群は対照群と比べて細胞体が 平坦な形態を示し，糸上仮足の伸展は乏しかったも のの，細胞死を示す像はみられなかった（図７）。 硬組織マ ー カ ー の 発 現 に つ い て は RUNX2, ALP, WNT5A, SPON1のいずれにおいても，荷重群では 対照群と比べて７日目で有意に発現の低下がみられ た。これらのことからヒトセメント芽細胞に軽い荷 重を加えた場合には，細胞増殖や細胞形態に影響を 与えないものの硬組織形成を抑制することが示唆さ れた７） 。 セメント芽細胞とアルカリ環境 根管治療の偶発症である根管壁穿孔に対しては， 水酸化カルシウム製剤や接着性レジンセメントが使 用されてきたが，近年では MTA（mineral trioxide aggregate）が用いられている。MTA は高い封鎖性 や硬組織形成能などの特徴があり，穿孔部に用いる とセメント質形成を誘導する。硬組織形成について は材料自体がアルカリ性を示すことによると考えら れているが，アルカリ刺激がセメント芽細胞に及ぼ す影響については明らかになっていない。そこで培 養ヒトセメント芽細胞をアルカリ環境においた際の 細胞増殖，石灰化さらにはアルカリ受容チャネルで ある transient receptor potential ankyrin
subfam-図６ 根尖性歯周炎での治癒 根管治療後の理想的な治癒は根穿孔部が新生 硬組織（セメント質）で被われる骨性瘢痕治癒で ある。そのためにはセメント芽細胞の病態生物 学を明らかにする必要がある。 図５ Jasplakinolide で処理した後に核を染色したところ核の断片化が多くみられた。 ３６８ 村松，他：根尖部歯周組織の病態生物学 ― ４ ―
ily member１（TRPA１）の関与を検討した。 上記の培養ヒトセメント芽細胞を硬組織分化誘導 培地で培養した後，水酸化ナトリウムで培養液の pH を７．６，８．０，８．４に 調 整 し，培 養 し た。細 胞 増 殖は経日的に細胞数を計測するとともに３日目に phosphop４４／４２（pp４４／４２）の発現をウェスタン ブロットで検討した。石灰化の評価には７日目にア ルカリフォスファターゼ活性（ALP 活性），２８日目 にアリザリンレッド染色を行った。また TRPA１ の関与を検討するためにはアンタゴニストである HC０３００３１を培養液中に添加して細胞増殖，石灰化 を検討した。細胞増殖は pH８．０，８．４で培養した群 は３，７日目で pH７．６で培養した群より有意に高 い値を示した（p＜０．０１）。HC０３００３１を添加すると細 胞増殖は緩やかとなり，pH 間で差はみられなかっ た。３日目に pp４４／４２の発現を検討したところ pH８．０，８．４では pp４４／４２のバンドが強くみられ たが，HC０３００３１添加群では pp４４／４２の発現は著 しく 減 弱 し て い た。ALP 活 性 は pH８．０，８．４で は pH７．６より有意に高い値を示したが，HC０３００３１添 加群では非添加群と比べて有意に減少していた（p ＜０．０１）。２８日目にアリザリンレッド染色を行った ところ pH８．０，８．４では pH７．６と比較して濃染がみ られたが，HC０３００３１添加群ではいずれの pH でも 濃染はみられなかった（図８）。以上の結果から培養 ヒ ト セ メ ン ト 芽 細 胞 は ア ル カ リ 環 境 に お い て TRPA１を介して細胞増殖と石灰化を促進すると考 えられた８） 。 図７ 培養ヒトセメント芽細胞に荷重をかけた実験 荷重がかかると微小な仮足が短くなったり不明瞭になってくる。 図８ 培養ヒトセメント芽細胞を培養した際に培養液の pH をアルカリ性にす ると石灰化が著明になってくる。 （−）：TRPA１のアンタゴニスト HC０３００３１が非添加 （＋）：TRPA１のアンタゴニスト HC０３００３１が添加 歯科学報 Vol．１１９，No．５（２０１９） ３６９ ― ５ ―
セメント芽細胞研究の今後の展望 現在，セメント芽細胞と細菌感染の関連性につい て検討している。根尖性歯周炎においてはセメント 質の細菌感染が問題となる。すなわち根尖性歯周炎 では根管壁の象牙細管内に細菌感染が生じるが，歯 根膜では長期間の感染によって硬組織形成能が低下 するという報告がある。根尖性歯周炎の治療後に根 尖孔が新生硬組織（セメント質）によって被覆される のが理想的な治癒とされているが，実際には被覆さ れていない場合もある。理由は明らかではないが近 年，細菌感染が持続することにより遺伝子の不活性 化がおこることが報告されており，そのメカニズム のひとつとして DNA メチル化があげられている。 象牙芽細胞へ感染性刺激を加えた際には硬組織形成 が促進したこともあり９） ，細胞によって特性が異な る可能性が考えられ，今後の検討課題となってい る。 終わりに 根尖性歯周炎では Malassez 上皮遺残細胞とセメ ント芽細胞がかかわっているものの研究が少なく不 明な点が多く，今後の展開が期待される。 本研究は「文部科学省私立大学ブランディング事業」の助 成を受けたものです。 著者の利益相反：開示すべき利益相反はない。 文 献
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４）Tsunematsu T, Fujiwara N, Yoshida M, Takayama Y, Kujiraoka S, Qi G, Kitagawa M, Kondo T, Yamada A, Arakaki R, Miyauchi M, Ogawa I, Abiko Y, Nikawa H, Murakami S, Takata T, Ishimaru N, Kudo Y : Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory In-vestigation, ９６⑽：１０６３−１０７５，２０１６．
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３７０ 村松，他：根尖部歯周組織の病態生物学
