技術論文
乳癌における Dual Color
in situ
Hybridization 法に
よる HER2 遺伝子増幅の検出―FISH 法との比較―
田中 京子
1)西川 武
1)小関 久恵
1)森田 剛平
2)武田麻衣子
2)中井登紀子
2)笠井 孝彦
3)大林 千穂
2) 1) 奈良県立医科大学附属病院病院病理部（〒 634-8522 奈良県橿原市四条町 840） 2) 奈良県立医科大学病理診断学講座 3) 産業医科大学第 1 病理学教室 要 旨乳癌における HER2 検査での DISH 法の有用性を検討したので報告する．HER2 immunohistochemistry（IHC）法にてス コア 2+であった浸潤性乳癌 27 例を用い，FISH 法および DISH 法での HER2 遺伝子増幅の有無を検討した．HER2 DISH 法の判定は，4 名で行いその判定者間での結果も比較した．DISH 法の測定者間での比較では，測定値では 10 例（37%） で，測定者間でばらつきがみられたが，判定結果の相違はいずれの症例も確認されなかった．FISH 法および DISH 法での 判定結果の比較では，21 例（78%）では一致していたが，6 例（22%）で乖離が見られた．FISH 法と DISH 法の測定値は 有意な相関がみられた． キーワード 乳癌，DISH，FISH，HER2 遺伝子増幅
乳癌における HER2 遺伝子増幅やタンパク質過剰
発現は，予後因子となるばかりでなく，分子標的治
療薬の標的となっている
1),2)．乳癌における Dual
Color in situ hybridization
法は，17 番染色体に存在す
る HER2 遺伝子とセントメアにハイブリダイズした
プローブに標識されているハプテンを，パーオキシ
ダーゼ系と，アルカリフォスファターゼ系の二種類
の酵素を標識した抗ハプテン抗体を用いて，黒色
（HER2 遺伝子）と赤色（第 17 番染色体セントロメ
ア）のシグナルとしてそれぞれ検出させる方法で，
そのシグナルは光学顕微鏡下で観察が可能である
3)．
今回，乳癌において Dual Color ISH HER2 を用い
た，HER2 検査の有用性を検討したので報告する．
I
対象及び方法
1
．対象
2011
年 6 月から 2012 年 6 月までの期間で，当院
に て 浸 潤 性 乳 管 癌 と 診 断 さ れ ， HER2
immuno-histochemistry（以下 IHC 法）にて，スコア 2+と判定
された 27 症例の手術材料を用いた．
2
．検査方法
対 象 例 に つ い て ， HER2 Fluorescence in situ
hybridization
（以下 FISH 法）と Dual Color in situ
hybridization
（以下 DISH 法）との比較検討を行った．
標本は 20%中性ホルマリンにて，原則 12 時間か
ら 24 時間，最長 48 時間固定され，パラフィン包埋
後，薄切切片を作成した．IHC 法は，自動免疫染色
装置 Ventana BenchMark XT（Roche）を用いた．IHC
法の一次抗体は，I-VIEW パスウエー HER（4B5）
キット（Roche）を用い，二次抗体から発色までは
I-VIEW DAD
ユニバーサルキット（Roche）を使用
し，マニュアル（Table 1）に沿って自動染色した．
FISH
法は，パスビジョン HER2 DNA プローブキッ
ト（Abbott）を使用し，染色を行った．DISH 法は，
IHC
法と同様の自動免疫染色装置を用いた．試薬は，
ベンタナ インフォーム Dual ISH HER2 キット
（Roche）を使用し，マニュアル（Table 2）に沿って
自動染色した．
3
．判定方法
HER2
遺伝子増幅やタンパク過剰発現の評価方法
は，American Society of Clinical Oncology（ASCO）/
College of American Pathologists（CAP）HER2 検査ガ
イドラインに準拠した
4)．IHC 法，FISH 法，DISH
法に使用する切片は，連続切片で同一部位を計測
した．
FISH
法の判定は，IHC 法で染色強度を観察し，測
定部位をマーキングし浸潤部分を特定し，20 個の乳
癌 細 胞 で の HER2 ・ 17 番 染 色 体 セ ン ト ロ メ ア
（CEP17）のシグナル数を，蛍光顕微鏡 BIOREVO
BZ-9000（KEYENCE）を用いた従来の目視計測，お
よび自動解析装置 CytoVision（Leica）を用いた自動
計測（以下 CV 法）を行った．総数の比 HER2/CEP17
を求め，1.8 未満を陰性（negative），2.2 を超える場
合を陽性（positive），HER2/CEP17 が 1.8 以上で 2.2
未満の場合は，境界域（equivocal）とした
4)．
DISH
法の判定は，FISH 法で特定した同箇所にお
いて，HER2 は黒色のシグナルとして，CEP17 は赤
色のシグナルとして染色されるため，各々の核にお
けるシグナル数を計測し，CEP17 のシグナル総数に
対する HER2 のシグナル総数の比率を算出して，
HER2/CEP17
が 1.8 未満を陰性（negative），2.2 を超
える場合を陽性（positive）とし，HER2/CEP17 が 1.8
以上で 2.2 未満の場合は，境界域（equivocal）とした．
FISH
法の計測値は，目視判定法と CV 法で相関係
数 r = 0.79 と良い相関を得ていた（Figure 1）ので，
以下の DISH 法との比較には CV 法での測定結果を
用い検討した．DISH 法の測定値は，4 名（A，B，
C，D：細胞検査士を含む）で目視判定を行い，その
判定者間での結果を比較するとともに，DISH 法で
の 4 名の計測値の平均値で得られた結果を FISH 法
（CV 法）で得られた結果と比較した．
DISH
法での測定者間の再現性については，変動
係数［（標準偏差/平均値）×100（%）］を求め，比較
検討を行った．FISH 法および DISH 法での解析評価
での一致率および相関の検討には，Pearson の検定を
用いた．
II
結
果
それぞれの症例の FISH 法および DISH 法の計測お
よび判定結果を Table 3 に示す．
1
．DISH 法の測定者間での比較
4
名（A，B，C，D）の測定者間での結果の相違
IHC自動染色プロトコール ①熱処理：一次抗体の抗原賦活処理として，熱処理 ②インヒビターを 1 滴（約 100 μL）加え，4 分間反応 ③インヒビターを洗浄後，一次抗体を 1 滴（約 100 μL）加え，32 分間反応 ④一次抗体を洗浄後，ビオチン標識 Ig を 1 滴（約 100 μL）加え，8 分間反応 ⑤ビオチン標識 Ig を洗浄後，アビジン-HRP1 滴（約 100 μL）加え，8 分間反応 ⑥アビジン-HRP を洗浄後，DAB 試薬と H2O2試薬を 1 滴ずつ（約 100 μL）加え，8 分間反応 ⑦DAB 試薬と H2O2試薬を洗浄後，COPPER 試薬を 1 滴（約 100 μL）加え，4 分間反応 ⑧COPPER を洗浄 ⑨対比染色：核染色および色出し Table 1 DISH自動染色プロトコール ①熱処理：一次抗体の抗原賦活処理として，熱処理 ②HER2 DNA カクテルプローブ 2 滴（約 200 μL）滴下し，6 時間反応 ③HER2 DNA カクテルプローブを洗浄後，抗 DNP 抗体 1 滴（約 100 μL）滴下し，20 分間反応 ④抗 DNP 抗体を洗浄後，HRP 標識抗体 1 滴（約 100 μL）滴下し，16 分間反応 ⑤HER 標識抗体を洗浄後，発色試薬 A2 滴（約 200 μL）に発色試薬 B と発色試薬 C1 滴ずつ（約 100 μL）滴下し，4 分間反応 ⑥発色液 ABC 洗浄後，抗 DIG 抗体 1 滴（約 100 μL）滴下し，20 分間反応 ⑦抗 DIG 抗体洗浄後，AP 標識抗体 1 滴（約 100 μL）滴下し，24 分間反応⑧AP 標識抗体洗浄後，PH エンハンサー試薬 2 滴（約 200 μL）に Naphthol 試薬 1 滴（約 100 μL）と Fast Red 試薬 2 滴（約 200 μL）滴 下し，8 分間反応
⑨対比染色：核染色および色出し
を比較した．判定結果の相違はいずれの症例も確認
されなかった．27 症例のうち 10 例（37%）では，
変動係数は 10%を超え，測定者間でのバラツキがみ
られた．
2
．FISH 法と DISH 法の比較
FISH
法および DISH 法での判定結果の比較では，
21
例（78%）では一致していたが，6 例（22%：Case
No. 7，11，14，18，20，23）で乖離していた（Table 3，4）．
FISH
法で陽性であった 2 症例のうち，1 症例（Case
No. 26）が DISH 法でも陽性であったが，もう 1 症
例（Case No. 14）は陰性と判定された（Table 3，
Figure 2
）．また，FISH 法で陰性であった 22 症例の
うち，DISH 法では陽性と判定された症例が 1 症例
（4%；Case No. 20，Figure 3），境界域と判定された
症例が 1 症例（4%：Case No. 23）あった．FISH 法
で境界領域と判定された 3 症例（Case No. 7，11，
18）はいずれも，DISH 法では陰性と判定された．
FISH
法および DISH 法の測定値の比較では，相関係
数 r = 0.598 を も っ て 有 意 の 相 関 が み ら れ た
（Figure 4）．
III
考
察
HER2
遺伝子増幅やタンパク過剰発現は，乳癌に
おいて予後因子であり，トラスツズマブによる分子
標的治療薬の特異的ターゲットである
1),2)．そのた
め，治療に先立ち乳癌組織での HER2 遺伝子増幅や
タンパク過剰発現の状況を確認することは必要不可
欠であり，その検査，判定方法が治療方針を大きく
左右する．FISH 法は，HER2 遺伝子増幅の検出のひ
とつで，現在最も広く使われている方法である．し
かし，1）染色手順が煩雑で，機械での自動染色が汎
用されていない．2）観察には蛍光顕微鏡が必要で，
蛍光顕微鏡下で病理組織像との対比が困難である．
3）測定者間における再現性が低い．4）すぐに色素
が退色するため，反復して観察することや長期保存
が不可能である．などの問題点が指摘されている
5)．
一方 DISH 法は，異なるハプテンが標識された HER2
遺伝子と第 17 番染色体セントロメアに対する，ミッ
クスプローブを同時に標的遺伝子にハイブリダイ
ゼーションさせ，標識されたハプテンを Silver in situ
hybridization
（ SISH ） 法 と Chromogenic in situ
Hybridization（CISH）法により可視化させる方法で，
そのシグナルは光学顕微鏡下で観察が可能である
ため
3)，病理組織との対比も容易で，反復して観察
することや長期保存ができる．また，自動免疫染色
装置 Ventana BenchMark XT（Roche）を用い，自動
的に染色することが可能である．
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 4 5 FISH-CV method n = 27 r = 0.792 y = -3.97 + 0.7x p<0.001FISH-ocular observation method
Scatter diagram of HER2 gene/CEP17 signal ratios by ocular observation method and CV method
There was a considerably correlation between the two. FISH, fluorescence in situ Hybridization.
FISH
法と DISH 法を比較検討した既報告では，乖
離率は 1.6～28%
5)～9)と幅があるが，今回の検討で
も，27 症例中 6 症例で判定結果の乖離（乖離率
22.2%）がみられた．乖離例の内訳は 1 例が FISH 陽
性/DISH 陰性，3 例が FISH 境界域/DISH 陰性，1 例
が FISH 陰性/DISH 境界域，1 例が FISH 陰性/DISH
陽性であった．
FISH
法と DISH 法で乖離のみられた原因について
考察する．DISH 法が FISH 法より過大評価になった
症例については，DISH 法にて小さな銀の沈着が目
立ち，個々の不規則な小さな点を HER2 シグナルと
して有意と評価するか，いわゆる「塵」であるのか
判断が難しい症例がみられた．特に，FISH 法と DISH
法の測定値に大きな差違がみられた Case No.20 で
は，DISH 法にて非特異的な「塵」をシグナルとし
てカウントしてしまった可能性も考えられる．
Result of FISH and DISH test for each case
Case No. FISH法 DISH法 HER2/ Chr17 Result* HER2/Chr17 Mean Result* SD CV (%) A B C D 1 1.38 – 1.33 1.26 1.29 1.24 1.28 – 0.04 3.18 2 1.74 – 1.68 1.19 1.20 1.23 1.32 – 0.24 17.98 3 0.93 – 1.67 1.70 1.53 1.38 1.57 – 0.15 9.48 4 0.92 – 1.49 1.28 1.53 1.31 1.40 – 0.13 9.12 5 1.05 – 1.36 1.30 1.28 1.08 1.25 – 0.12 9.65 6 1.53 – 1.43 1.13 1.39 1.03 1.25 – 0.20 15.74 7 1.87 ± 1.64 1.14 1.76 1.69 1.56 – 0.28 18.15 8 1.71 – 1.28 1.06 1.11 1.15 1.15 – 0.09 8.20 9 1.41 – 1.38 1.24 1.39 1.40 1.35 – 0.08 5.59 10 1.36 – 1.30 0.92 1.31 1.23 1.19 – 0.18 15.39 11 1.86 ± 1.30 1.18 1.26 1.27 1.25 – 0.05 4.08 12 1.7 – 1.44 1.24 1.57 1.46 1.43 – 0.14 9.57 13 1.4 – 1.17 1.07 1.02 0.98 1.06 – 0.08 7.68 14 2.23 + 1.52 1.39 1.36 1.33 1.40 – 0.08 6.00 15 1 – 1.39 1.31 1.59 1.38 1.42 – 0.12 8.38 16 1.51 – 1.58 1.52 1.59 1.62 1.58 – 0.04 2.64 17 1 – 1.11 1.27 1.24 1.23 1.21 – 0.07 5.82 18 1.9 ± 1.20 1.08 1.25 1.19 1.18 – 0.07 6.08 19 1.36 – 1.26 1.24 1.13 1.10 1.18 – 0.08 6.92 20 1.25 – 4.48 4.51 5.05 4.94 4.75 + 0.29 6.16 21 1.31 – 1.11 0.89 1.31 1.23 1.13 – 0.18 16.06 22 1.13 – 1.77 1.71 1.09 1.37 1.48 – 0.32 21.46 23 1.45 – 1.92 1.99 1.76 2.42 2.02 ± 0.28 13.94 24 1.75 – 1.50 1.10 1.27 1.21 1.27 – 0.17 13.25 25 1.2 – 1.59 1.22 1.10 1.52 1.36 – 0.24 17.31 26 3.52 + 6.15 7.00 7.79 6.24 6.80 + 0.77 9.75 27 1.51 – 1.65 1.08 1.33 1.29 1.34 – 0.24 17.60 FISH, fluorescence in situ Hybridization; DISH, dual color in situ hybridization; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation.
* –: negative, +: positive, ±: equivocal
Table 3
Concordance of FISH and DISH HER2 amplification status based on ASCO/CAP criteria4)
FISH DISH
HER2 amplification HER2 equivocal HER2 not amplified Total
HER2 amplification 1 0 1 2
HER2 equivocal 0 0 3 3
HER2 not amplified 1 1 20 22
Total 2 1 24 27
次に，DISH 法が FISH 法より過小評価になった症
例については，Mansfield ら
8)の報告のなかでは，二
つの要因を推察している．一つめの要因として，
FISH
法では蛍光顕微鏡フィルターを変えることに
よってそれぞれのシグナルを個々に評価できるが，
DISH
法ではより多くのシグナルが核内に存在すれ
ば，互いのシグナルが重なり判定しづらくなること
を挙げている．特に，赤色の CEP17 シグナル数増加
が著しい場合は，互いのシグナルが重なり黒色の
HER2
シグナルが正確にカウントしづらく実際より
a bA case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. 14)
a: FISH results were indicative of a signal ratio of 2.23 and HER2 gene amplification (orange: HER2, green: CEN17).
b: DISH results were indicative of a signal ratio of 1.40 and HER2 gene non-amplification (black: HER2, red: CEN17).
Figure 2
a b
A case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. 20)
a: FISH results were indicative of a signal ratio of 1.25 and HER2 gene non-amplification (orange: HER2, green: CEN17).
b: DISH results were indicative of a signal ratio of 4.75 and HER2 gene amplification (black: HER2, red: CEN17).
少なくカウントされた可能性がある．二つめの要因
として，HER2 遺伝子増幅症例では CEP17 が共増幅
（coamplify）する症例があり，共増幅する症例では
HER2/CEP17
比は過小に判定されることが挙げられ
る．また，CEP17 は 17 番染色体の適切な内部標準
ではなく
8),10)，FISH 法では，CEP17 に替わる 17 番
染色体上の別の領域でのプローブでの確認を推奨す
る報告がある
10)．DISH 法においても，背景の非特異
的沈着を防ぐ工夫や観察や判定の容易なプローブの
検討などの技術面での改善が望まれる．
また，HER2 FISH 検査は，判定法や判定者間に差
があり，その標準化が課題とされ，結果の判定は複
数の熟練者で行うことが推奨されている
4)．今回の
検討では，DISH 法において 4 名の測定者間で，判
定結果に相違は確認されなかったが，測定値におい
ては約 37%の症例で変動係数は 10%を超え，判定者
間にバラツキがみられた．複数検者での測定や目合
わせ，アトラス作製などによる判定の標準化なども
必要と考える．
IV
結
語
乳癌での DISH 法による HER2 遺伝子増幅検出
は，FISH 法に比較し，光学顕微鏡下で観察可能であ
る点や，長期保存が可能であること，機械で自動染
色できるなどの多くの利点もあるが，測定者間での
バラツキもあり，その結果判定には注意が必要で
ある．
今後，明瞭なシグナルを得るための技術的改善や
判定の標準化などが課題である．
■文献1) Slamon DJ et al. : Human breast cancer : correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene, Science 1987 ; 235 : 177–182.
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 FISH n = 27 r = 0.598 y = -0.48 + 1.42x p<0.001 DISH
Scatter diagram of HER2 gene/CEP17 signal ratios by DISH and FISH method
There was a considerably correlation between the two.
FISH, fluorescence in situ Hybridization; DISH, dual color in situ hybridization.
brightfield dual-probe in situ hybridization (BDISH) for frontline assessment of HER2 status in breast cancer samples in a community setting: influence of poor tissue preservation, Am J Surg Pathol 2012 ; 36(10) : 1489–1496.
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cancers with polysomy by using alternative chromosome 17 reference genes: implications for anti-HER2 targeted therapy, J Clin Oncol 2011 ; 29(31) : 4168–4174.
Technical Article
Detection of HER2 gene amplification in breast cancer using
dual-color
in situ
hybridization method in comparison with fluorescence
in situ
hybridization
Kyoko TANAKA
1)Takeshi NASHIKAWA
1)Hisae KOSEKI
1)Kohei MORITA
2)Maiko TAKEDA
2)Tokiko NAKAI
2)Takahiko KASAI
3)Chiho OHBAYASHI
2)1)Pathology Section, Nara Medical University Hospital(840, Shijo-cho, Kashihara-shi, Nara 634-8522, Japan) 2)Department of Diagnostic Pathology, Nara Medical University School of Medicine
3)Department of Pathology and Oncology, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyushu, Japan
Summary
We examined the usefulness of the dual-color in situ hybridization (DISH) method for HER2 gene amplification in breast cancer. We studied 27 cases of invasive breast cancer that scored 2+ by the HER2 immunohistochemistry (IHC) method. We investigated the occurrence of HER2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization (FISH) and DISH methods, and compared the results obtained. Four investigators carried out the determinations by the HER2 DISH method and the results were compared. Comparison of the results obtained by the four investigators using the DISH method showed that 10 cases (37%) revealed a small dispersion in the HER2 gene/CEP17 signal ratios among the investigators, but the difference in the determined results was not confirmed in any of the cases. The FISH and DISH methods for HER2 gene diagnosis showed uniformity in 21 cases (78%). Inconsistencies were prevalent in 6 cases (22%). The HER2 gene/CEP17 signal ratio obtained by the DISH method significantly correlated with the result of the FISH method.
Key words: Breast cancer, DISH, FISH, HER2 gene amplification
