B. thuringiensis 細胞用発現ベクター pPcyt1A の構築

B. thuringiensis 細胞用発現ベクター pPcyt1A の構築

武 部   聡^１, ２、横 尾 尚 哉^２、水 橋   輝^２、 松 村   剛^２、駒 野   徹^１, ２

要  約

土壌細菌Bacillus thuringiensis subsp. israelensisが保有する遺伝子cyt1Aのプロモーター領域およびcry4A のターミネーター領域を用いてBt細胞内ではたらく発現ベクター pPcyt1A を構築した。このベクターに Cry タンパク質遺伝子をクローン化し、クリスタルを生産しないBt細胞に導入したところ、Cry タンパク 質の発現およびクリスタル形成が確認され、本発現系の有効性が示された。

は じ め に

 B. thuringiensis （Bt） はグラム陽性の典型的な好気性胞子形成菌であり、自然界において土壌や植物葉上

をはじめとしていろいろな環境に広く分布している。また、菌体内に胞子とともに高い特異的殺虫活性を もつタンパク質の結晶性顆粒（クリスタル）を形成する独特の能力をもっている（1, 2, 3）。Bt菌におい て注目される特異性の高い殺虫性は、クリスタルの主成分であるδ- 内毒素に由来する。このδ- 内毒素に は大きく分けて Cry タンパク質と Cyt タンパク質の 2 群がある（3）。Cry タンパク質は今日までに数百種 が見つかっており、アミノ酸配列の類似性により 40 以上のグループに分類されている（4, 5）。このうち、

殺虫特異性が明らかとなったのはわずかで、ほとんどの Cry タンパク質は殺虫特異性も分からないまま、

生化学的研究はなおざりにされている。Cyt タンパク質もクリスタルに含まれる一群のタンパク質である が系統的には Cry タンパク質とはまったく異なり、Cry タンパク質とのアミノ酸配列類似性は認められな い。Cyt タンパク質は、細胞のレベルでは脊椎動物の赤血球を含む多くの種類の細胞に強い溶解作用を持 つ細胞溶解毒素として作用する（6）。Cry タンパク質遺伝子および Cyt タンパク質遺伝子は一般にはプラ スミド上にある。このプラスミドを人為的に欠損させた変異株はクリスタルを形成しなくなるが、増殖・

胞子形成は野生株と同様に行う。つまり、Cry タンパク質と Cyt タンパク質は、これらの遺伝子が乗って いるプラスミドも含めて、Btの生育に必須な因子ではない。

クリスタルの形成は、翻訳後のタンパク質が自発的に集合し、結晶化することで行われる。原核生物の場合、

細胞内のタンパク質量は mRNA の量に依存するので、クリスタルに含まれるタンパク質の構成比は、遺伝子の 転写量と mRNA の安定性が大きな要因になる。Btにおける結晶性殺虫タンパク質群の発現は、胞子形成期特 異的に行われ、母細胞中に結晶性封入体を産生する。その胞子形成期特異的な発現は、Bacillus subtilisにお ける胞子の発現を制御しているσ因子、σ^E，σ^Kと高い相同性をもつσ³⁵，σ²⁸による転写制御によって起こって いる。σ³⁵は対数増殖期終了後 2 〜 6 時間の間、胞子形成期初期に活性化し、プロモーター （Bt I） を認識、

転写を開始させる。σ²⁸は対数増殖期終了後 5 時間後以降、胞子形成期中期から後期にかけて活性化し、プ ロモーター （Bt II） を認識、転写を開始させる （2，7，8，9）。また、この時期の細胞はリボヌクレアーゼ活性が 高くなっているので、転写後の mRNA は安定性を保つため、3 末端がステムループ構造をとると考えられている。

転写活性が低い遺伝子は、クリスタルからタンパク質を調製するのが困難なため、遺伝子を単離し、発 現系を用いてタンパク質を調製する方法がとられる。私たちは、degenerate PCR をもとにして、発現量に 依存しないcry遺伝子の検出、クローニングの系を確立している（10）。今回は、クローン化したcry遺

1. 近畿大学先端技術総合研究所    2. 近畿大学大学院生物理工学研究科

伝子をBt細胞内で高発現するため、大腸菌 ‑ バチルス属シャトルベクターにcyt1Aプロモーター（11）

とcry4Aターミネーター（12）を組み込んだ発現ベクターを構築した。このベクターにcry遺伝子をクロー

ン化し、Bt細胞内での発現を検討した。

材料および方法

１．菌株

 Bt. subsp. israelensis 4Q7

 Bt. subsp. israelensis 4Q2（野生株）のプラスミド完全欠損株。Bacillus genetic stock center から分与された。

 Bt. subsp. israelensis HD522 C37-21

 Bt. subsp. israelensis HD522 の pBTI-6 プラスミド欠失株。クリスタル形成遺伝子群を保有する pBTI-6 を欠失しているためクリスタル非産生になっている （12）。

 Bt. subsp. kurstaki 4D11

 クリスタル非生産株。Bacillus genetic stock center から分与された。

２．プラスミド

pHY300 PLK：大腸菌とBacillus subtilisのシャトルベクター。大腸菌のプラスミド pACYC177 とStrep-

tococcus faecallsのプラスミド pAMα1 由来の DNA より構成される。薬剤耐性マーカーとしてアンピシリ

ン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子をもつが、Btではテトラサイクリン耐性遺伝子のみが発現す る。Bal I, Bam HI, Ban I, Bgl I, Bgl II, Bst PI, Eco RI, Eco RV, Hin dIII, Hpa I, Sal I, Sma I, Pvu I, Xba I の制限酵 素サイトを 1 箇所ずつもっている［TaKaRa］。

pIS431：pHY300 PLK にcry4Aのプロモーターおよびターミネーター部位を含むHind III-Xba I 断片 （5.03  kb） をクローニングした組換えプラスミド （12）。

３．酵素・試薬等

Taq ポリメラーゼは KOD ‑Plus‑ は TOYOBO 社製、制限酵素は TaKaRa 社製を用いた。プロテアーゼ阻 害剤（Pefabloc SC）はロシュ・ダイアグノスティックス社製、抗生物質（アンピシリン、テトラサイクリ ン）、培地用試薬、その他の試薬はナカライテスク社から調達した。

４．培地

LB 培地 （1 L）：Bacto^® Tryptone Peptone 10 g；Bacto^® Yeast extract 5 g；NaCl 10 g を加え、NaOH 溶 液で pH 7.0 に調整した。寒天培地使用時は 1.5% になるよう Agar Powder を加えた。また、アンピシリン 添加時は終濃度 50μg/ml になるように、テトラサイクリン添加時は終濃度 30μg/ml になるように加えた。

Schaeffer s sporulation medium （SSM） （1 L）：Nutrient Broth  8.0 g；MgSO4・7H2O  0.25 g；KCl  1.0  g にイオン交換水を加えて 1 L に fill up し、オートクレーブした。その後、1 mM FeSO4  1 ml；10 mM  MnCl2 1 ml；1 M CaCl2 1 ml を加えた。

５．PCR プライマーの設計

cyt1Aのプロモーター部位増幅用のプライマーは GenBank のデータベース（Accession No. CAA26943）を、

 cry4Aのターミネーター部位増幅用のプライマーは pIS431 のデータをもとに、プロモーター断片の 3 末

端とターミネーター断片の 5 末端が制限酵素Sph I サイト （GCATGC） になり、本来の開始コドンとSph I

サイトの ATG が重なるように設計した。

 cry32Ba （Accession No. BAB78601）増幅用のプライマーは、開始コドンから終止コドンの 1 つ手前まで増

幅するように設計した。また、プライマー両末端には制限酵素Sph I サイトが付加され、かつ増幅遺伝子の開 始コドンと発現ベクターの開始コドン （Sph I サイトの ATG） が同じ読み枠になるように開始コドン側プライマー 5 末端には5 -GCATGCAG-3 を、終止コドン側プライマー5 末端には5 -GCATGC-3 をそれぞれ連結させた。

６．Btの形質転換

６ １．コンピテントセルの調製

LB 培地 5 ml にクリスタル非産生のBtを植菌し 30℃で一晩培養した （前培養）。さらに前培養液 1 ml を LB 培地 10 ml （50 ml チューブ） に植菌し、30℃で、OD600が 0.6 〜 0.7 になるまで （1 〜 3 時間） 培 養した。培養液 10 ml を集菌 （3,000 rpm, 4℃ , 10 min） した。菌体を 1 ml の氷冷した SPB で洗浄した後、 

400μl の SPB に再懸濁した。

菌体液を 200μl ずつに分注し、液体窒素で 10 分間冷凍ショックを与えた後、-80℃で保存した。

６ ２．エレクトロポレーション

Btの形質転換は GENE PULSER^®II（BIO-RAD）を用いたエレクトロポレーションにより行った。氷上で 融解させたコンピテントセル 200μl に、プラスミド DNA 1μg （〜 10μl） を加えて混合した後、氷冷し たキュベット（電極間距離：0.2 cm）に移し、1 kV、200Ω、10μF の設定でパルスをかけた。

反応後、すぐに SOC 培地 1 ml を加え 30℃で 3 時間振盪培養した後、テトラサイクリン添加 LB 寒天培 地に植菌し、30℃で 30 時間培養した。

生じたコロニーは direct PCR によりインサートチェックを行った。

７．Bti .4Q7 でのcry遺伝子の発現 ７ １．菌体の培養方法

テトラサイクリン（20μg/ml）添加 LB 液体培地 5 ml に発現プラスミドを導入したBti. 4Q7 を植菌し、

30℃で 15 〜 23 時間モノシン培養した（前培養）。前培養液 5 ml をテトラサイクリン（40μg/ml）添加 SSM 50 ml（スクリュー三角フラスコ）に植菌し、30℃、230 rpm で 15 〜 23 時間振盪培養し、胞子及 びインクルージョンの形成を確認した。なお、胞子及びインクルージョンの形成が確認できなかった場合、

30 ℃、100 rpm で振盪培養を続け、胞子及びインクルージョンの形成を確認した。

７ ２．Cry タンパク質の抽出方法

Bt野生株が産生する Cry タンパク質は結晶構造をとるため、プロテアーゼに抵抗性を示すが、単一の Cry タンパク質では結晶構造が完全ではないため、菌体自身のプロテアーゼによって産生された Cry タン パク質が分解されることが明らかになっている。このため、cry遺伝子の導入株から Cry タンパク質の抽 出には、プロテアーゼ阻害剤を用いて行った。胞子及びインクルージョンの形成を確認した後、9,000  rpm, 4℃ , 10 min で集菌した。上清を除いた後、プロテアーゼインヒビターを溶解させた氷冷滅菌水 40  ml にペレットを懸濁して、50 ml ビーカーに移した。菌体懸濁液を SONIFIER 450D（BRANSON）を使用 して出力振幅を目盛 10 に設定し、15 分間超音波破砕を行った。

超音波破砕済み菌体懸濁液を 9,000 rpm, 4℃ ，10 min で集菌し、プロテアーゼ阻害剤を溶解させた氷 冷滅菌水 10 ml に懸濁してタンパク質粗抽出液とした。

８．SDS - PAGE

SDS-PAGE はラピダス・ミニスラブ^®電気泳動装置 （AE-6500 ATTO）を用いて行った。ゲルの組成は 8% ラ

ンニングゲルが 30% アクリルアミドストック 2.16 ml ，1.5 M Tris-HCl Buffer （pH8.9） 2 ml ，滅菌水 3.76 ml ， 10% SDS 80μl ，10%APS 27μl ，TEMED 4μl、スタッキングゲルが 30%  アクリルアミドストック 0.4 ml ，1.1  M Tris-HCl Buffer （pH6.8） 285μl ，滅菌水 1.78 ml ，10% SDS 25μl ，10%APS 27μl ， TEMED 4μl で行った。

タンパク質試料は、50μl の試料に等量の 2× アルカリ可溶化溶液（100 mM Na2CO3 （pH 10.5），20  mM DTT）を加え、4℃で一晩可溶化処理を行った後、Bio-Rad Protein Assay Kit によりタンパク質濃度を 測定し、泳動試料のタンパク質濃度が 10μg になるように 2×SDS Loading Buffer とアルカリ可溶化試 料を混合し、95℃で 5 分間熱変性させた後、ゲルの試料孔にアプライした。泳動は 90 分程度で終わるよ うに電圧を調整し、泳動後の染色は CBB で行った。

結   果

１．発現ベクターの構築

まず、クリスタル非産生Bt菌株でcry遺伝子を単離発現させるための発現ベクターの構築を行った。プ ロモーターは、Btiのクリスタルの主成分である Cyt1A の遺伝子プロモーターを用いた（11）。このプロモー

図１  pPcyt1A の構造

    cyt1Aのプロモーター領域とcry4Aのターミネーター領域をSphI site で連結し、シャトル ベクター pHY300LK に挿入した。SphI site は unique なので、ここに外来遺伝子を挿入す る と 転 写 さ れ、cyt1Aの SD 配 列 に よ りSphI site 内 に あ る ATG か ら 翻 訳 さ れ る。σ³⁵  promoter, Bt I；σ²⁸ promoter, Bt II；SD, ribosome binding site；ori‑ pACYC177 ，大腸菌 内で働くオリジン；ori‑ pAMα1 ，枯草菌等Bacillus属の細胞内で働くオリジン；tet^r，テト ラサイクリン耐性遺伝子； amp^r，β‑ ラクタマーゼ遺伝子（Bt細胞内では発現しない）

ターはσ³⁵，σ²⁸の 2 つの認識配列をもっており、転写活性が高くなる時期の異なる 2 つのプロモーター のはたらきにより、長い間 mRNA の細胞内濃度を高く維持できると考えた。また、cyt1AはBt. israelensis が保有している遺伝子なので、Btiのプラスミド欠損株を発現ベクターの宿主として用いれば、のプロモー ターで発現誘導がかかりやすいと考えた。

ターミネーターはcry4Aのものを用い、どの読み枠においても終止コドンが入ることを確認し、本来の

 cry4Aの終止コドンより上流から、ステムループ構造の末端までを用いた （図 1）。

プロモーター、ターミネーター部位は PCR によって調製し、制限酵素消化後に pHY300PLK にクローニ ングし、cyt1Aプロモーターおよびcry4Aターミネーターをもつ pPcyt1A を構築した （図 1）。

２．発現ベクターにクローン化した遺伝子の発現確認

構 築 し た 発 現 ベ ク タ ー の 実 用 性 の 検 定 は、cry32Ba遺 伝 子 を 用 い て 行 っ た。 組 換 え プ ラ ス ミ ド pPcyt1A -cry32Baをクリスタル非産生Bt菌株に導入し、位相差顕微鏡観察による菌体内のクリスタルの有 無および SDS PAGE による Cry32Ba 産物 （140 kDa） 量の比較によって行った。

２ １．位相差顕微鏡による観察

pPcyt1A -cry32Bを 3 種のクリスタル非生産株Bti. 4Q7 ，Bti. HD522 C37-21 ，Btk. 4D11 に導入し、テ トラサイクリン存在下、LB 液体培地でモノード振盪培養を 140 時間行った。検定用菌株は 24 時間ごと に顕微鏡で観察したところ、Bti. 4Q7 とBti. HD522 C37-21 を宿主としたものでは培養 3 日目でクリスタ ルの形成を確認することができた（図 2）。

一方、宿主をBtk. 4D11 としたもの、およびベクター pPcyt1A のみを導入したものでは、培養を終了す るまでクリスタルは確認できなかった。

図２  pPcyt1A-cry32Ba を導入した 3 種の Bt 細胞の位相差顕微鏡写真

    プラスミドを導入した 3 種類のBt細胞を、それぞれ 5 ml の LB 培地（tet を含む）に植 菌し、30℃、3 日間モノード振盪培養した。pPcyt1A/Bti. 4Q7 ，発現ベクターのみを Bti. 4Q7 に導入し、培養したネガティブコントロール； S ，胞子；C ，クリスタル

２ ２．タンパク質粗抽出液の SDS-PAGE による観察

SSM で培養後、材料および方法の記述にしたがって調製したタンパク質粗抽出液を用い、SDS-PAGE を 行った（図 3）。3 種の宿主の何れを用いても、pPcyt1A -cry32Bを導入したサンプルでは 160 kDa 付近に バンドが確認できたが、Btk. 4D11 に導入したものでは発現量が少なかった。また、ベクターのみを導入 したものでは 160 kDa 付近にバンドは確認できなかったことから、これが Cry32Ba のであると考えられる。

考   察

本研究では、Cry タンパク質の単離発現を目的として発現ベクターを構築した。構築したベクターはク リスタル非生産株内で発現ベクターとして機能し得ることが確かめられたが、Bti. 4Q7 およびBti. HD522  C37-21 を用いたときに比べると、Btk. 4D11 では発現量は非常に少なかった。この理由として、宿主の由 来の違いが考えられる。Btk. 4D11 はBt. subsp. kurstaki HD-1 からつくられた変異株であり、Bti. 4Q7 およ びBti. HD522 C37-21 はそれぞれBt. subsp. israelensis 4Q2 およびBt. subsp. israelensis 4Q1 からつくられ た変異株である。プロモーターとして用いたcyt1AはBti由来の遺伝子であり、Btkは本来持っていないの で、発現制御機構の微妙な違いにより Btk 内では十分なプロモーターの活性化が起こらなかったのであろ う （13, 14）。

 Btは、胞子形成期から自己溶菌にかけて、特に菌体自身が産生するプロテアーゼの活性が高くなること が知られている。図 3 パネル B のレーン S で、105 kDa ，70 kDa ，30 kDa 付近に見られるバンドはレー ン N では見られないため、Cry32Ba のプロテアーゼによる部分分解物と考えられる。単体 Cry タンパク質

図３ pPcyt1A-cry32Baを導入した 3 種のBt細胞から調製した Cry32Ba 粗抽出液の SDS-PAGE     panel A：  Bti. 4Q7 を宿主とし、SSM で 24 時間培養後、プロテアーゼ阻害剤存在下でク

リスタルを調製した。

   panel B：  Bti. HD522 C37-21 を宿主とし、LB 培地で 140 時間培養後クリスタルを調製 した。プロテアーゼ阻害剤は用いていない。

   panel C： Btk. 4D11 を宿主とし、LB 培地で 140 時間培養後クリスタルを調製した。プロ テアーゼ阻害剤は用いていない。M, size marker; S, pPcyt1A-cry32Ba/Bt cell か ら調製したサンプル；N, pPcyt1A/Bt cell から調製したサンプル；C, Bt. TK-E6 

（cry32Baを保有する野生株）が生産するクリスタルから調製したサンプル

による結晶化は不完全なためにプロテアーゼの影響を受け易いと考えられ、この対策が今後の課題である。

 Btには、Cry タンパク質の結晶化を助ける因子、 p-20やorf 2 （8）などがあり、これをベクターに乗せて共 発現させることで、プロテアーゼによる影響を軽減することができるかもしれない。

本研究で構築した発現ベクター pPcyt1A は、クリスタル非生産株を宿主としてクローン化されたcry遺 伝子を効率よく発現することが確認できた。この発現系は、ネイティブな遺伝子のままでは発現量が少な く調製もままならなかった多くの Cry タンパク質の解析に有効な手段となるであろう。

謝   辞

本研究の一部は、平成 16 年度近畿大学生物理工学部戦略的研究（決定番号 03-IV-15）によって行われ た。

参 考 文 献

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２ ． E. Schnepf, N. Crickmore, J. V. Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D. R. Zeigler, D. H. Dean （1998）

 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 775-806.

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（1998） Revision  of  the  nomenclature  for  the Bacillus thuringiensis  pesticidal  crystal  proteins. 

Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 807-813. 

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11． D.J. Earp, E.S. Ward, and D.J. Ellar （1987） Investigation of possible homologies between crystal  proteins of three mosquitocidal strains of Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett. 42, 195-199.

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英 文 要 旨

Construction of new Bt expression vector, pPcyt1A

So Takebe, Naoya Yokoo, Akira Mizutani, Tsuyoshi Matsumura, and Tohru Komano

A new expression vector, pPcyt1A, was constructed.  This vector has cyt1A promoter and cry4A termina- tor, and SphI unique site for cloning foreign gene, between the two regions.  Any gene cloned into SphI site, should be enforced to express many of protein when it was introduced into Bt cell.  This Bt expression  system would be useful for single Cry protein isolation.