博士学位論文
電気化学検出超臨界流体クロマトグラフィーの開発と実試料分析への応用
略語表
CAD : Charged aerosol detection DoE : Design of experiments ECD : Electrochemical detection
ELSD : Evaporative light scattering detector FID : Flame ionization detection
FUMI : Function of mutual information GC : Gas chromatography
HPLC : High-performance liquid chromatography
ICH : International council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use
IS : Internal standard substance
ISO : International organization for standardization LOD : Limit of detection
LOQ : Limit of quantification MS : Mass spectrometry PDA : Photodiode array PEEK : Polyetheretherketone
PMC : 2,2,5,7,8-Pentamethyl-6-hydroxychroman PTFE : Polytetrafluoroethylene
RSD : Relative standard deviation RSM : Response surface methodology SFC : Supercritical fluid chromatography SFE : Supercritical fluid extraction
TBATFB : Tetrabutylammonium tetrafluoroborate TEATFB : Tetraethylammonium tetrafluoroborate
緒 論 超 臨 界 流 体 は 気 体 ・ 液 体 ・ 固 体 と 同 様 に 温 度 ・ 圧 力 条 件 に よ っ て 決 定 さ れ る 物 質 の 状 態 の 一 つ で あ り ， 臨 界 点 (臨 界 温 度 ， 臨 界 圧 力 ) 以 上 の 温 度 と 圧 力 条 件 下 に お け る 物 質 の 状 態 を 指 す (Fig. 1) 1 )． 超 臨 界 流 体 の 状 態 で は 高 温 で あ る た め 分 子 の 熱 運 動 が 激 し く ， 加 圧 し て も 固 体 の よ う に 分 子 が 凝 集 せ ず ， 流 体 の ま ま 密 度 の み が 高 く な る ． そ の た め ， 圧 力 を 調 節 す る こ と で 気 体 の よ う に 低 圧 ・ 低 密 度 な 状 態 か ら ， 液 体 に 近 い 高 密 度 な 状 態 ま で 物 性 を 連 続 的 に 変 化 さ せ る こ と が で き る ．し た が っ て ， 超 臨 界 流 体 は 密 度 ， 拡 散 性 や 粘 度 な ど の 各 物 性 に お い て ， 液 体 と 気 体 の 性 質 を 兼 ね 備 え た 特 性 を 示 す (Table 1) ．
Fig. 1 Phase diagram for a pure substance.
Table 1 Characteristics parameters of gas, supercritical fluid and liquid2 ).
ま た ，各 物 質 に お い て 臨 界 温 度 及 び 臨 界 圧 力 は 固 有 の 値 を 示 す (Table 2) ．特 に ， 二 酸 化 炭 素 の 臨 界 温 度 及 び 臨 界 圧 力 は そ れ ぞ れ 31℃，7.37 MPa で あ り ，そ の 他 の 化 合 物 に 比 べ て 穏 や か な 条 件 で 超 臨 界 状 態 と な る こ と が 分 か る ． さ ら に ， 超 臨 界 二 酸 化 炭 素 の 特 徴 と し て ， ア ル コ ー ル 類 な ど 様 々 な 有 機 溶 媒 と 混 合 で き る こ と ， 人 体 に 対 す る 有 害 性 が 低 い こ と ， 化 学 的 に 不 活 性 で あ る こ と ， 高 純 度 な 試 薬 が 安 価 に 入 手 で き る こ と ， な ど が 挙 げ ら れ る た め ， こ れ ら の 特 性 を 活 か し て 種 々 の 研 究 領 域 や 産 業 に お い て 多 用 さ れ て き た 3 )．
Table 2 Critical temperature and pressure in various compounds4 ).
Critical temperature, ℃ Critical pressure, MPa
作 用 な ど の 生 物 活 性 を 示 す 化 合 物 が 含 ま れ て い る こ と か ら ， 創 薬 の リ ー ド 化 合 物 を 探 索 す る 手 法 と し て 期 待 さ れ て い る 1 0 )．超 臨 界 二 酸 化 炭 素 を 抽 出 溶 媒 に 用 い る こ と で ， 有 機 溶 媒 を 用 い る 一 般 的 な 抽 出 方 法 に 比 べ て 回 収 率 が 高 く ， 比 較 的 穏 や か な 実 験 条 件 で 扱 う こ と が で き る た め ， 熱 分 解 性 の 化 合 物 や 空 気 酸 化 さ れ 易 い 化 合 物 も 抽 出 す る こ と が 可 能 と な る ． さ ら に ， 二 酸 化 炭 素 は 室 温 ・ 大 気 圧 条 件 に お い て 気 体 で あ る こ と か ら ， 抽 出 後 は 減 圧 す る だ け で 簡 単 に 二 酸 化 炭 素 を 除 去 で き る た め 高 純 度 な 精 製 物 を 得 る こ と が で き る ， な ど い く つ か の 利 点 が 挙 げ ら れ る ． 特 に ， 有 機 溶 媒 に 比 較 し て 人 体 及 び 環 境 へ の 影 響 が 少 な く ， リ サ イ ク ル 可 能 な 資 源 で あ る こ と か ら 工 業 生 産 ス ケ ー ル な ど の 大 規 模 な 抽 出 工 程 に お い て は ， 従 来 の 抽 出 方 法 に 替 わ る 方 法 と し て 実 用 化 が 検 討 さ れ て き た ． さ ら に ， 抽 出 条 件 の 検 討 に は DoE や RSM な ど の 実 験 計 画 法 を 活 用 す る こ と に よ っ て ， 分 取 ス ケ ー ル や パ イ ロ ッ ト プ ラ ン ト ス ケ ー ル か ら 工 業 生 産 ス ケ ー ル ま で の ス ケ ー ル ア ッ プ が 可 能 で あ り ，SFE は 実 用 的 な 技 術 と し て 確 立 さ れ て き た 11 )．
一 方 ，SFC は 1960 年 代 初 め に Klesper ら に よ っ て 報 告 さ れ た “ High Pressure Gas Chromatography above Critical Temperature ”1 2 )を 起 源 と し ， そ れ か ら 現 在 ま で 約 60
1-3-2 移 動 相 と モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 の 組 成 比 の 検 討 移 動 相 と モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 の 組 成 比 を 80:20, v/v か ら 70:30, v/v の 範 囲 で 検 討 し た ．各 測 定 条 件 に お い て 100 μmol/L フ ェ ロ セ ン /メ タ ノ ー ル 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し た ． 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 を 算 出 し た ． 各 組 成 比 に お け る フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 を Fig. 6 に 示 し た ． 移 動 相 と モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 の 組 成 比 を 変 化 さ せ た と き ， モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 の 組 成 比 が 増 加 す る に し た が っ て ， フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 は わ ず か に 減 少 し た ． ま た ， 移 動 相 と モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 の 組 成 比 が 80:20, v/v の と き ， フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 は 他 の 条 件 に 比 べ て 大 き な SD を 示 し た ． 一 方 ， フ ェ ロ セ ン の 保 持 時 間 は い ず れ の 条 件 に お い て も ほ と ん ど 変 化 し な か っ た ．
1-3-3 総 流 速 の 検 討
総 流 速 を 2.0 mL/min，3.0 mL/min 及 び 4.0 mL/min の 範 囲 内 で 変 更 し ，各 測 定 条 件 に お い て 100 μmol/L フ ェ ロ セ ン /メ タ ノ ー ル 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し た ． 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 を 算 出 し た ． 各 総 流 速 に お け る フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 を そ れ ぞ れ Fig. 7 に 示 し た ． 総 流 速 を 増 加 さ せ る に し た が っ て ， フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 は い ず れ も 減 少 し た ． 総 流 速 が 速 い 場 合 に は ， フ ェ ロ セ ン が カ ラ ム 電 極 に お い て 十 分 に 電 解 さ れ ず に 通 過 し て し ま う も の と 考 え ら れ た ．し た が っ て ，総 流 速 は 3.0 mL/min と し た ．
1-3-4 背 圧 の 検 討
SFC 一 般 の 特 徴 と し て ， 背 圧 制 御 装 置 を 有 す る こ と が あ り ， 検 出 器 の 後 ろ か ら 背 圧 を 加 え る こ と に よ っ て ， 系 内 を 臨 界 (又 は 亜 臨 界 ) の 状 態 に 保 っ て い る ． 本 実 験 で は ， 背 圧 を 10 MPa か ら 20 MPa の 範 囲 で 変 化 さ せ ， 各 条 件 に お い て 100 μmol/L フ ェ ロ セ ン の メ タ ノ ー ル 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し た ． 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 を 算 出 し た ． 各 背 圧 に お け る フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 を Fig. 8 に 示 し た ． 背 圧 を 変 化 さ せ て も ， フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 及 び 保 持 時 間 は ほ と ん ど 変 化 し な か っ た ． 以 上 の 結 果 か ら ， 背 圧 は 20 MPa と し た ．
1-3-5 印 加 電 位 の 検 討 電 気 化 学 検 出 器 の 印 加 電 位 を+0.2 V～ +1.2 V の 範 囲 で 変 化 さ せ た と き ， 各 条 件 に お い て 100 μmol/L フ ェ ロ セ ン /メ タ ノ ー ル 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し た ．得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら ピ ー ク 面 積 を 算 出 し た ．そ の 他 の 測 定 条 件 は Table 4 に 示 し た ． 測 定 回 数 は 各 条 件 に つ き ， そ れ ぞ れ 1 回 と し た ． 各 印 加 電 位 に お け る フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 を Fig. 9 に 示 し た ． 印 加 電 位 が +0.2 ～+0.4 V の と き ， フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た が ， +0.6 V 以 降 は 一 定 の ピ ー ク が 認 め ら れ た ． ま た ， ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ は 0.0005～ 0.01 μA で あ っ た ． 印 加 電 位 を 増 加 さ せ る こ と で ピ ー ク 高 さ が 高 く な り ， シ グ ナ ル の 電 流 値 が 増 加 す る が ， 一 方 で 印 加 電 位 を 増 加 さ せ る こ と に よ り ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ が 大 き く な る こ と か ら ，シ グ ナ ル 対 ノ イ ズ 比 (S/N 比 ) を 算 出 し た ．各 印 加 電 位 に お け る S/N 比 は Table 3 に 示 し た 通 り で あ り ， 以 上 の 結 果 か ら ， 印 加 電 位 は +0.8 V と し た ．
Table 3 Effect of applied potential on ferrocene peak height and baseline noise. Applied potential, V
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Peak height, µA 0.04 0.11 5.10 7.53 7.33 6.50 Noise level, µA 0.0005 0.0005 0.005 0.005 0.005 0.01
S/N 88 220 1020 1506 1466 650
SFC-ECD conditions except for applied potential were same as shown in Table 4.
1-3-6 フ ェ ロ セ ン 標 準 溶 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム SFC-ECD シ ス テ ム に よ る フ ェ ロ セ ン の 最 適 な 測 定 条 件 を Table 4 に 示 し た ． さ ら に 最 適 条 件 下 に お け る ブ ラ ン ク 溶 液 (メ タ ノ ー ル の み ) 及 び 100 μmol/L フ ェ ロ セ ン /メ タ ノ ー ル 溶 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 10 に 示 し た ． 下 記 の 条 件 に お い て ， フ ェ ロ セ ン の 保 持 時 間 は 約 45 秒 で あ り ， イ ン ジ ェ ク シ ョ ン ノ イ ズ (約 34 秒 ) と 重 な ら な い こ と が 確 認 さ れ た ． ま た ， フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク を 妨 害 す る そ の 他 の ピ ー ク も 認 め ら れ な か っ た ．た だ し ，フ ェ ロ セ ン の k’は 0.32 で あ り ，ほ と ん ど 保 持 さ れ て い な か っ た ． こ の こ と か ら ， フ ェ ロ セ ン の 保 持 に 対 し て 移 動 相 へ の モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー の 混 合 が ほ と ん ど 影 響 し な い 結 果 (Fig. 6) と 考 え 合 わ せ る と ，本 系 は 分 離 挙 動 を 議 論 す る に は 必 ず し も 適 し た 系 で は な い と 考 え ら れ た ． し か し ， 本 章 は ピ ー ク シ グ ナ ル 強 度 で ECD の 性 能 を 評 価 す る こ と を 目 的 と し て い る た め ，実 験 を 先 に 進 め る こ と に し た ．
Table 4 Optimized SFC-ECD conditions for the determination of ferrocene. Mobile phase : liquified carbon dioxide
Modifier solvent : 1 mol/L ammonium acetate in methanol Ratio of mobile phase and modifier solvent : 70:30, v/v
Total flow rate : 3.0 mL/min
1-3-7 分 析 法 パ ラ メ ー タ ー の 評 価 1-3-7-1 直 線 性 本 法 の 直 線 性 を 評 価 す る た め 10 μmol/L～ 400 μmol/L の フ ェ ロ セ ン 標 準 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し て 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら フ ェ ロ セ ン の ピ ー ク 面 積 を 求 め て 回 帰 直 線 を 作 成 し た ． フ ェ ロ セ ン の 濃 度 と ピ ー ク 面 積 を プ ロ ッ ト し て 得 ら れ た 検 量 線 は y = 0.3039x - 0.3422 (相 関 係 数 0.999) で あ り ， 良 好 な 直 線 性 を 示 し た (Fig. 11) ．
Fig. 11 Calibration curve of ferrocene. Ferrocene standard solution s of 10, 20, 50, 75, 100, 150, 200 and 400 μmol/L were injected into SFC -ECD system. Values are average ± SD (n=3). Chromatographic conditions were same as shown in Table 4.
1-4 考 察 本 章 で 開 発 し た SFC-ECD シ ス テ ム の 有 用 性 を 検 証 す る た め ， こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る SFC-ECD シ ス テ ム 5 2 , 5 4 , 5 5 , 5 7 )と の 比 較 を Table 5 に 示 し た ． は じ め に ，本 SFC-ECD シ ス テ ム と 他 の SFC-ECD シ ス テ ム の 分 析 条 件 を 比 較 し た ． 本 法 を 含 め て ， こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る SFC-ECD シ ス テ ム の 移 動 相 は い ず れ も 超 臨 界 二 酸 化 炭 素 で あ り ， 移 動 相 中 に お い て フ ェ ロ セ ン の 酸 化 電 流 を 効 率 的 に 検 出 す る た め に は ， 導 電 率 を 改 善 す る 必 要 が あ る こ と か ら ， モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 へ の 支 持 電 解 質 の 添 加 5 2 , 5 5 )ま た は 電 極 表 面 の 修 飾 5 4 )が 行 わ れ て い た ．本 章 で 開 発 し た フ ロ ー 型 カ ラ ム 電 極 の 電 極 材 料 で あ る 炭 素 繊 維 は 電 極 表 面 の 修 飾 を 必 要 と し な い こ と か ら ， 再 現 性 よ く 電 極 を 作 製 す る こ と が 可 能 で あ り ， 電 極 作 製 に 要 す る 労 力 を 削 減 す る こ と が で き る と 考 え ら れ た ． ま た ， モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 に 添 加 す る 支 持 電 解 質 と し て 揮 発 性 の 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 使 用 す る こ と で TBATFB5 2 )や TEATFB5 5 )を 使 用 し た 場 合 に 比 べ て ，SFC-ECD シ ス テ ム 内 部 の 圧 力 変 動 に よ り 配 管 内 や 配 管 出 口 で 析 出 す る リ ス ク を 低 減 で き る と 考 え ら れ た ． 次 に ， 本 SFC-ECD シ ス テ ム と 他 の SFC-ECD シ ス テ ム の 検 出 感 度 を 比 較 し た ． い ず れ の SFC-ECD シ ス テ ム に お い て も ， フ ェ ロ セ ン の 測 定 結 果 が 示 さ れ て い た こ と か ら ， フ ェ ロ セ ン の 検 出 限 界 を 比 較 す る こ と に よ り ， 各 SFC-ECD シ ス テ ム の 検 出 感 度 を 評 価 し た ．既 報 の SFC-ECD シ ス テ ム で は ，フ ェ ロ セ ン の 検 出 限 界 が 0.16 pmol ～54 nmol で あ る (た だ し ，Di Maso ら 5 2 )及 び Dressman ら 5 4 )の 報 告 に お い て は 検 出
Table 5 Comparison of SFC-ECD conditions for the determination of ferrocene .
Working electrode Modifier Supporting electrolyte Analytical column LOD
Present method Carbon fiber Methanol Ammonium acetate Spherisorb
150 mm x 4.6 mm i.d., 5 μm 0.98 pmol
Di Maso5 2 ) Pt wire Acetonitrile TBATFB Rexchrom C18
100 mm x 2.1 mm i.d., 5 μm
Less than 54 nmol
Dressman5 4 ) Pt wire coated with
LiCF3SO3 and Ru(bpy)3(PF6)2
Methanol or acetonitrile - Nucleosil C18 100 mm x 1 mm i.d., 5 μm Less than 5.4 nmol
Wallenborg5 5 ) Pt wire Acetonitrile TEATFB C18 Packed capillary column
50 cm x 200 μm i.d., 5 μm 0.16 pmol
径 0.45 μm の メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー で ろ 過 し て 試 料 溶 液 と し た ． 試 料 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し た ． 測 定 回 数 は 各 試 料 に つ き ， そ れ ぞ れ 3 回 と し た ．
2-2-7 デ ー タ 解 析
2-3-2 総 流 速 の 検 討
γ-tocopherol; δ, δ-tocopherol. SFC conditions except for the total flow rate were same as shown in Table 46. 2-3-3 印 加 電 位 の 検 討 電 気 化 学 検 出 器 へ の 印 加 電 位 を+0.5 V～ +0.9 V の 範 囲 で 0.1 V ず つ 変 化 さ せ て ， 各 測 定 条 件 に お い て 100 μmol/L ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し た ． 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら 各 ト コ フ ェ ロ ー ル の ピ ー ク 面 積 を 算 出 し た ． 測 定 回 数 は 各 条 件 に つ き ， そ れ ぞ れ 3 回 と し た ． 上 記 の 操 作 に よ っ て 得 ら れ た ハ イ ド ロ ダ イ ナ ミ ッ ク ボ ル タ モ グ ラ ム を Fig. 15 に 示 し た ．各 ト コ フ ェ ロ ー ル の ピ ー ク 面 積 は 印 加 電 位 を 増 加 さ せ る に つ れ て 増 大 し ， 印 加 電 位 が+0.8 V の と き い ず れ の ト コ フ ェ ロ ー ル も ピ ー ク 面 積 が 最 大 と な っ た ． 以 上 の 結 果 か ら ， 電 気 化 学 検 出 器 へ の 印 加 電 位 を+0.8 V と し た ．
2-3-4 SFC-ECD に よ る ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム SFC-ECD シ ス テ ム に よ る ト コ フ ェ ロ ー ル の 最 適 な 測 定 条 件 を Table 6 に 示 し た ． さ ら に 最 適 条 件 下 に お け る100 μmol/L ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 16 に 示 し た ． 下 記 の 条 件 に お い て ， PMC， α-ト コ フ ェ ロ ー ル ， β-ト コ フ ェ ロ ー ル ，γ-ト コ フ ェ ロ ー ル 及 び δ-ト コ フ ェ ロ ー ル の 順 に 分 離 度 Rs 1.5 以 上 で 溶 出 し ， 測 定 時 間 は 8 分 以 内 で あ っ た ．こ の よ う に SFC の 特 長 を 利 用 し た 高 速 分 離 を 行 う こ と は で き た が ， 各 ピ ー ク の シ ン メ ト リ ー 係 数 は 1 以 上 あ り ， ピ ー ク 形 状 の 改 善 は 課 題 と し て 残 っ て い る ．
Table 6 Optimized SFC-ECD conditions for the determination of tocopherol. Mobile phase : liquified carbon dioxide
Modifier solvent : 1 mol/L ammonium acetate in methanol Ratio of mobile phase and modifier solvent : 98:2, v/v
Total flow rate : 1.5 mL/min
Column : Spherisorb silica gel 4.6×150 mm, 5 μm
Column temperature : 40℃
Applied potential : +0.8V
2-3-5 分 析 能 パ ラ メ ー タ ー 本 法 の 分 析 能 パ ラ メ ー タ ー と し て ， 直 線 性 ， 精 度 （ 併 行 精 度 及 び 室 内 再 現 精 度 ）， 検 出 限 界 及 び 定 量 限 界 を 評 価 し た ． 2-3-5-1 直 線 性 本 法 の 直 線 性 を Table 7 及 び Fig. 17 に 示 し た ． 各 ト コ フ ェ ロ ー ル の 検 量 線 は 5 μmol/L～ 200 μmol/L の 濃 度 範 囲 に お い て ， 相 関 係 数 が 0.997 以 上 で あ っ た ． ま た ， 残 差 プ ロ ッ ト は 0 付 近 に ラ ン ダ ム に プ ロ ッ ト さ れ ， 濃 度 に 応 じ た 傾 向 な ど は 認 め ら れ な か っ た (Fig. 18) ． し た が っ て ， 本 法 は 上 記 の 濃 度 範 囲 に お い て 良 好 な 直 線 性 を 示 す と 考 え ら れ た ．
Table 7 Linearity of tocopherol
Range, μmol/L Regression equation Correlation coefficient α-tocopherol 5-200 y = 0.011x + 0.072 0.999
2-3-5-2 併 行 精 度 及 び 室 内 再 現 精 度 本 法 の 併 行 精 度 (n=6) 及 び 室 内 再 現 精 度 (n=3) を Table 8 及 び Table 9 に そ れ ぞ れ 示 し た ．100 μmol/L ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 を 用 い た 繰 り 返 し 測 定 に お け る 併 行 精 度 (n=6) は 1.82%RSD 以 下 ，室 内 再 現 精 度 (n=3) は 3.55%RSD 以 下 で あ り ，良 好 な 再 現 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た ． Table 8 Repeatability RSD, % α-tocopherol 1.82 β-tocopherol 0.81 γ-tocopherol 1.62 δ-tocopherol 1.17
Table 9 Intermediate precision RSD, % α-tocopherol 2.89 β-tocopherol 3.19 γ-tocopherol 2.29 δ-tocopherol 3.55 2-3-5-3 定 量 限 界 及 び 検 出 限 界 本 法 の 定 量 限 界 (S/N=10） 及 び 検 出 限 界 (S/N=3) を Table 10 に 示 し た ． 定 量 限 界 は 7.50 pmol～ 11.43 pmol (1.50 μmol/L～ 2.29 μmol/L) ，検 出 限 界 は 2.25 pmol～ 3.43 pmol (0.450 μmol/L～ 0.686 μmol/L) で あ っ た ．
2-3-6 添 加 回 収 試 験
添 加 回 収 試 験 に お け る 各 ト コ フ ェ ロ ー ル の 回 収 率 を Table 11 に 示 し た ． 各 植 物 油 に お け る 各 ト コ フ ェ ロ ー ル の 回 収 率 は そ れ ぞ れ ，α-ト コ フ ェ ロ ー ル：86.2%～ 101.0%， β-ト コ フ ェ ロ ー ル ： 89.9%～ 112.7%， γ-ト コ フ ェ ロ ー ル ： 77.9%～ 106.4%及 び δ-ト コ フ ェ ロ ー ル ：93.9%～ 105.1%で あ り ， い ず れ も 良 好 な 結 果 を 示 し た ．
Table 11 Tocopherol standard-spiked recovery study.
Vegetable oils Recovery, %
α-tocopherol β-tocopherol γ-tocopherol δ-tocopherol
Almond 97.3 112.2 98.1 100.1
Avocado 86.2 113.6 94.0 98.6
Corn 97.0 106.6 105.8 103.8
Cottonseed 90.5 112.7 84.3 99.8
Extra virgin olive 93.5 106.4 104.4 105.1
Grapeseed 96.5 106.7 104.3 102.5 Macadamia nut 97.7 89.9 98.3 96.3 Peanut 101.0 109.8 106.4 94.0 Rapeseed 96.3 93.8 88.5 102.1 Rice bran 89.9 110.8 95.9 93.9 Safflower 99.1 95.6 94.1 103.0 Sesame 99.0 104.7 77.9 104.5 Soybean 94.5 97.8 97.9 97.7
Values mean average (n=3).
2-3-7 植 物 油 中 ト コ フ ェ ロ ー ル 含 量 の 定 量
δ-ト コ フ ェ ロ ー ル が 0.08～ 0.34 mg/g で あ り ，植 物 油 に 含 ま れ る ト コ フ ェ ロ ー ル の 大 部 分 は α-ト コ フ ェ ロ ー ル 及 び γ-ト コ フ ェ ロ ー ル で あ っ た ．
Table 12 SFC method for the determination of tocopherols in various samples.
Mob ile p h ase
Mod ifier An a lytica l co lu mn Samp le Samp le vo lu m e Ru n time Lin ea r ran g e LO D *
Pr es en t m eth od CO2 Meth an ol
Sp h eris orb 1 5 0 mm x4 .6 mm i.d ., 5 μm
Veg etab le oi l 1 g 8 min 5 -2 0 0 μmol/ L 7 .5 0 p mol
S FC-ECD9 4 ) CO
2 Meth an ol
Kr omasi l
8 0 cm x 2 0 0 μm i.d ., 5 μm
Veg etab le oi l - 2 0 min - 0 .6 0 p mol
S FC- F ID9 1 ) CO
2 -
SB-Meth yl -1 0 0 2 0 m x 0 .0 5 mm
On ion seed 6 -7 g 2 7 min - -
S FC- F ID9 2 ) CO
2 -
Nu cleo sil C -1 8 1 0 0 mm x 1 mm i.d ., 5 μm
Ph armaceu tical p rod u ct Diet etic p rod u ct
0 .5 -1 g 1 5 min 0 .1 2 -4 .65 mmol/ L (0 .0 5 -2 mg/m L) - S FC- UV7 9 ) CO 2 Meth an ol L co lu mn OD S 2 5 0 mm x 4 ,6 mm i.d ., 5 μm
Veg etab le oi l 1 0 g 3 5 min - 3 7 p mol
S FC-M S9 3 ) CO
2 Eth an ol
Amin e Lu n a NH2 1 5 0 mm x 2 .0 mm i.d ., 3 μm
2-5 小 括
本 章 で は ，SFC-ECD シ ス テ ム に よ る ト コ フ ェ ロ ー ル 定 量 法 を 開 発 し ，実 試 料 へ の 応 用 と し て 植 物 油 中 に 含 ま れ る ト コ フ ェ ロ ー ル 含 量 を 定 量 し た ．
3章 SFC-ECD の 精 度 評 価 に お け る ISO 11843-7 を 活 用 し た 省 力 化 3-1 序 論 SFC の 精 度 や 頑 健 性 は ， HPLC や GC に 比 べ て 難 点 で あ り ， こ れ ま で し ば し ば 克 服 す べ き 課 題 点 の 一 つ で あ る と 考 え ら れ て き た ． そ の 理 由 と し て ，SFC は ， 移 動 相 (液 化 炭 酸 ガ ス ) を 送 液 す る ポ ン プ に 加 え て ，モ デ ィ フ ァ イ ヤ ー 溶 液 を 送 液 す る ポ ン プ や シ ス テ ム 内 の 圧 力 を 維 持 す る た め の 背 圧 制 御 装 置 が 必 要 で あ る た め ，HPLC や GC に 比 べ て 分 析 シ ス テ ム を 構 成 す る 装 置 が 多 く ， 全 体 的 に 複 雑 な シ ス テ ム と な っ て し ま う こ と が 挙 げ ら れ る ． ま た ， 超 臨 界 流 体 の 物 性 は 温 度 や 圧 力 の わ ず か な 変 化 に よ っ て 大 き く 変 化 す る こ と か ら ， 分 析 条 件 を 精 密 に 制 御 す る 必 要 が あ る こ と も 影 響 を 及 ぼ し て い る と 考 え ら れ る ． 最 近 で は ， い く つ か の 分 析 機 器 メ ー カ ー か ら ， よ り 精 密 に 制 御 可 能 な SFC シ ス テ ム が 上 市 さ れ て い る が ，い ず れ に し て も 分 析 法 の 開 発 に お い て 精 度 評 価 は 欠 か せ な い も の で あ る ． 分 析 法 バ リ デ ー シ ョ ン の 重 要 性 は 様 々 な 公 定 書 に 記 載 さ れ て お り ， 医 薬 品 規 制 調 和 国 際 会 議 (ICH) の ガ イ ド ラ イ ン (ICH-Q2) だ け で な く ，米 国 ，欧 州 及 び 日 本 な ど ， 各 地 域 に お け る 薬 局 方 に お い て も 記 述 が 認 め ら れ る ． こ れ ら の 文 書 で は ， 精 度 の 評 価 に は 適 切 な 濃 度 の 標 準 溶 液 を 繰 り 返 し 測 定 し て 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら ピ ー ク 面 積 ま た は ピ ー ク 高 さ の 相 対 標 準 偏 差 (RSD) を 求 め る こ と で 再 現 性 を 評 価 す る こ と が 推 奨 さ れ て い る が ， 同 一 試 料 を 複 数 回 測 定 す る た め に は 試 料 ， 試 薬 ， 装 置 を 適 切 に 稼 働 さ せ る こ と が で き る 人 材 な ど 様 々 な リ ソ ー ス が 必 要 で あ る ． そ こ で 本 研 究 で は ， 国 際 標 準 化 機 構 の ISO 11843:2012 Part 7 Methodology based on stochastic properties of instrumental noise (ISO 11843 -7) に 着 目 し て ， SFC-ECD に お け る 精 度 評 価 の 省 力 化 に つ い て 検 討 し た ．
3-2 材 料 及 び 方 法 3-2-1 SFC-ECD シ ス テ ム の 構 成 SFC-ECD シ ス テ ム は 第 2 章 で 構 築 し た 装 置 を 使 用 し た ． 3-2-2 ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 の 調 製 1 mmol/L α-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 ， 1 mmol/L β-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 ， 1 mmol/L γ-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 及 び 1 mmol/L δ-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 を 量 り ， ヘ キ サ ン を 加 え て 希 釈 し て ，5， 10 及 び 25 μmol/L ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 を 調 製 し た ． 3-2-3 ISO 11843-7 に よ る パ ワ ー ス ペ ク ト ル の 算 出 SFC-ECD の ク ロ マ ト グ ラ ム は 0.02 秒 毎 に 1 ポ イ ン ト の デ ジ タ ル デ ー タ を 取 得 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 の 256， 512， 1024， 2048， 4096 及 び 8192 ポ イ ン ト の デ ジ タ ル デ ー タ を 抽 出 し ，FUMI 理 論 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア TOCO Ver.2 (FUMI 理 論 研 究 所 ) に よ っ て 解 析 し ， パ ワ ー ス ペ ク ト ル を 算 出 し た ．
3-2-4 ISO 11843-7 に よ る 精 度 プ ロ フ ァ イ ル の 算 出
SFC-ECD の ク ロ マ ト グ ラ ム か ら 8192 ポ イ ン ト の デ ジ タ ル デ ー タ を 抽 出 し ，FUMI 理 論 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア TOCO Ver.2 (FUMI 理 論 研 究 所 ) に よ っ て 解 析 し ，精 度 プ ロ フ ァ イ ル を 算 出 し た ．
3-2-5 ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 の 繰 り 返 し 測 定 の 精 度
3-3 結 果 3-3-1 SFC-ECD シ ス テ ム の ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ 超 臨 界 状 態 に お け る SFC-ECD シ ス テ ム ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ を 測 定 す る た め ， 背 圧 制 御 装 置 を 稼 働 さ せ た 状 態 で SFC-ECD シ ス テ ム に よ っ て フ ロ ー ス ル ー 電 解 を 実 施 し た ．Fig. 21 に 示 す よ う に ， 超 臨 界 状 態 で の ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ は ， 0.05 Hz 未 満 の 周 期 的 な ノ イ ズ が 観 測 さ れ た ． こ れ ら の 大 き な 振 幅 及 び 周 期 的 な ノ イ ズ は ， SFC-ECD シ ス テ ム の 流 路 内 に お い て 一 定 の 圧 力 を 保 持 す る た め に ，排 気 口 を 定 期 的 に 開 閉 す る 背 圧 制 御 装 置 に 起 因 す る と 考 え ら れ た ．
3-3-3 SFC-ECD シ ス テ ム に よ る ト コ フ ェ ロ ー ル 測 定 の 精 度
25 μmol/L ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 5 μL を SFC-ECD シ ス テ ム に 注 入 し て 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 24 に 示 し た ． α-ト コ フ ェ ロ ー ル ， β-ト コ フ ェ ロ ー ル ， γ-ト コ フ ェ ロ ー ル 及 び δ-ト コ フ ェ ロ ー ル の ピ ー ク は そ れ ぞ れ 保 持 時 間 3.4 分 ， 4.8 分 ， 5.2 分 及 び 6.4 分 に 認 め ら れ た ．5 μmol/L，10 μmol/L 及 び 25 μmol/L の 各 濃 度 に つ き ，6 回 の 繰 り 返 し 測 定 か ら 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム か ら 求 め た 各 ト コ フ ェ ロ ー ル の ピ ー ク 面 積 の 相 対 標 準 偏 差 を Table 13 に 示 し た ．
Table 13 RSDs and 95% confidence intervals of peak area in the chr omatogram of tocopherol standard mixture.
Concentration, μmol/L RSDs, % (95% confidence intervals)
α-tocopherol β-tocopherol γ-tocopherol δ-tocopherol
て 得 ら れ た ピ ー ク 面 積 の RSD の 95%信 頼 区 間 内 で あ っ た ．
V，背 圧 は 15 MPa と す る こ と で 4 種 類 の ト コ フ ェ ロ ー ル 同 族 体 と PMC (内 標 準 物 質 ) を 10 分 以 内 に 分 離 す る こ と が で き た ．ま た ，本 法 の 分 析 能 パ ラ メ ー タ ー は ，5 μmol/L か ら 200 μmol/L の 濃 度 範 囲 に お い て 相 関 係 数 0.997 以 上 の 良 好 な 直 線 性 ， 併 行 精 度 及 び 室 内 再 現 精 度 は そ れ ぞ れ 1.8%以 下 ，3.6%以 下 で あ り ，定 量 限 界 (S/N=10) は 7.50 ～11.43 pmol，検 出 限 界 (S/N=3) は 2.25～ 3.43 pmol で あ り ，実 試 料 の 分 析 に 応 用 で き る 分 析 能 を 有 し て い る こ と を 明 ら か に し た ． 本 法 を 植 物 油 中 に 含 ま れ る ト コ フ ェ ロ ー ル の 定 量 へ 応 用 し た と こ ろ ， 植 物 油 に 内 標 準 物 質 を 含 む ヘ キ サ ン を 加 え て 希 釈 す る こ と で 測 定 す る こ と が で き た ． ま た ， 本 法 に お け る 前 処 理 方 法 の 添 加 回 収 率 は 77.9%～ 112.7%で あ り ，良 好 な 結 果 を 示 し た ．以 上 の 結 果 か ら ， 本 SFC-ECD シ ス テ ム は 非 常 に 簡 単 な 前 処 理 方 法 で 植 物 油 中 の ト コ フ ェ ロ ー ル 含 量 を 定 量 で き る こ と を 明 ら か に し た ． 第 3 章
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・ 1 mmol/L α-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 α-ト コ フ ェ ロ ー ル 約 43.1 mg を 精 密 に 量 り ，ヘ キ サ ン を 加 え て 溶 か し て 正 確 に 100 mL と し た ． 冷 凍 庫 (-20℃) で 保 存 し た ． ・ 1 mmol/L β-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 β-ト コ フ ェ ロ ー ル 約 41.7 mg を 精 密 に 量 り ，ヘ キ サ ン を 加 え て 溶 か し て 正 確 に 100 mL と し た ． 冷 凍 庫 (-20℃) で 保 存 し た ． ・ 1 mmol/L γ-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 γ-ト コ フ ェ ロ ー ル 約 41.6 mg を 精 密 に 量 り ，ヘ キ サ ン を 加 え て 溶 か し て 正 確 に 100 mL と し た ． 冷 凍 庫 (-20℃) で 保 存 し た ． ・ 1 mmol/L δ-ト コ フ ェ ロ ー ル 標 準 溶 液 δ-ト コ フ ェ ロ ー ル 約 40.3 mg を 精 密 に 量 り ，ヘ キ サ ン を 加 え て 溶 か し て 正 確 に 100 mL と し た ． 冷 凍 庫 (-20℃) で 保 存 し た ． ・ 1 mmol/L 2,2,5,7,8-Pentamethyl-6-hydroxychroman 標 準 溶 液 2,2,5,7,8-Pentamethyl-6-hydroxychroman 約 22.0 mg を 精 密 に 量 り ， ヘ キ サ ン を 加 え て 溶 か し て 正 確 に 100 mL と し た ． 冷 凍 庫 (-20℃) で 保 存 し た ． ＜ 機 器 ＞ ・ 上 皿 天 秤 ：PM600 (メ ト ラ ー ・ ト レ ド ) ・ セ ミ ミ ク ロ 電 子 天 秤 ：XSE105 (メ ト ラ ー ・ ト レ ド ) ＜ 器 具 ＞
