シクロデキストリンとの複合体形成による
経口糖尿病治療薬の準安定形結晶の選択的結晶化
2006
園田 陽
Selective Preparation of Metastable Crystals of Oral Hypoglycemic Agents Utilizing Cyclodextrin Complexation
Yoh Sonoda
Selective Preparation of Metastable Crystals of Oral Hypoglycemic Agents Utilizing Cyclodextrin Complexation
Yoh Sonoda Crystal modifications significantly affect various pharmaceutical properties, such as solubility, dissolution rate, stability and bioavailability of drugs. Therefore, it is of great importance to discover, produce and isolate crystalline polymorphs of a given solid drug and to control their polymorphic transformations in pharmaceutical fields. In this study, we attempted to control crystallization and polymorphic transition of hypoglycemic agents (tolbutamide (TB) and chlorpropamide (CPM)) utilizing cyclodextrins (CyDs) complexation. The crystallizations of TB and CPM in the absence and presence of CyDs in solution were investigated. In addition, the inclusion complexation of CyDs with the drugs was studied by the solubility method, spectroscopic methods (UV, CD and NMR) and molecular docking simulation. Furthermore the effect of 2-hydroxypropyl-β-CyD (HP-β-CyD) on crystallization and polymorphic transition of solid CPM polymorphs during storage and compression was investigated. The results are summarized as follows:
Chapter I
1) From aqueous solutions without CyDs, metastable Form IV crystals of TB precipitated at initial stages of crystallization, but it quickly transformed to stable Form I crystals via solution-mediated process. By contrast, in the presence of 2,6-di O-methyl-β-CyD (DM-β-CyD), the solution-mediated transformation of From IV to Form I was markedly inhibited, and Form IV crystals existed stably for more than 1 week. This suppression occurred at a very low concentration of 0.1 mM DM-β-CyD.
In the presence of competitive inclusion agents, the transformation of Form IV to Form I was significantly accelerated, and the 50% inhibitory concentrations of competitors were correlated well with the magnitude of stability constants of the competitor/DM-β-CyD complexes.
2) The 1:1 stability constant (Kc = 1920 M-1) of TB/DM-β-CyD complex determined by the solubility method was much higher than those of other CyD complexes (< 344 M-1). NMR spectroscopic studies and molecular docking simulations suggested that the butyl moiety of TB is preferentially included in the DM-α-CyD cavity, whereas the toluene moiety is included in the DM-β-CyD cavity.
Chapter II
3) In the case of CPM, stable Form A crystals were crystallized in the absence of CyDs.
On the other hand, metastable Form II crystals precipitated at initial stages of crystallization in the presence of HP-β-CyD, but they quickly transformed to Form A crystals via solution-mediated process. By contrast, in the presence of DM-β-CyD, the solution-mediated transformation of From II to Form A was markedly inhibited
and there was no transition of Form II to Form A crystals over 24 hours.
4) By the addition of inclusion competitors to DM-β-CyD solutions, a new CPM polymorph (Form D) was precipitated. Form D crystals were rapidly converted to Form A in the absence of DM-β-CyD, but the conversion was significantly inhibited by the addition of DM-β-CyD. The solubility of CPM polymorphs increased in the order of Form A < Form D < Form II.
5) The Kc value (380 M-1) of CPM/DM-β-CyD complex determined by the solubility method was higher than those of other CyD complexes (< 160 M-1). NMR spectroscopic studies suggested that the chlorobenzene moiety of CPM is preferentially included in the DM-β-CyD cavity.
Chapter III:
6) CPM/CyD complexes showed AL type phase solubility diagrams, and the stability constants of the CyD complexes increased in the order of γ-CyD < α-CyD < β-CyD and HP-γ-CyD < HP-α-CyD < HP-β-CyD.
7) The amorphous solid complex of CPM with HP-β-CyD in a molar ratio of 1:1 was prepared by the spray-drying method. On storage at 25 and 40°C, amorphous CPM in the HP-β-CyD solid complex slowly crystallized to metastable Form C, but the conversion of Form C to Form A was suppressed. On the other hands, Form C alone without HP-β-CyD was converted to Form A according to the Jander equation.
8) The dissolution rate of CPM polymorphs increased in the order of Form A < Form C
< HP-β-CyD complex in JP XIV first fluid and Form A ≈ Form C < HP-β-CyD complex in JP XIV second fluid. These in-vitro dissolution characteristics were clearly reflected in the in-vivo absorption of CPM and the glucose plasma levels after oral administration in dogs.
9) Amorphous CPM/HP-β-CyD complex was not affected by compressing pressure, whereas Form A and Form C alone were changed to amorphous forms and to Form C and Form A, respectively, under the compression. The dissolution rates of Form A and Form C alone were increased after the compression, because of the partial conversion to amorphous forms. On the other hands, the dissolution rate of HP-β-CyD complex was not changed by the compression, maintaining the fast dissolution characteristics.
In conclusion, DM-β-CyD is useful for controlling crystallization and polymorphic transition and for preparing metastable crystals of poorly water-soluble drugs. This CyD-based crystallizing method will provide an opportunity to isolate labile intermediate metastable polymorphs and will be a valuable tool for the detection and preparation of new polymorphs that are undiscovered so far.
目 次
緒 言 1
第1章 トルブタミド (TB) の結晶化経路に及ぼす シクロデキストリンの影響
第1節 序 7
第2節 TBの結晶化挙動 7 第1項 TB の結晶化に及ぼす各種CyDs の影響 7 第2項 TB 準安定形Form IV の水溶液中における
多形転移挙動 13
第3項 TB 結晶化に及ぼす競合包接剤の影響 15
第3節 TBとCyDsの相互作用 17 第1項 溶解度相図 18 第2項 NMR スペクトル法 20
第4節 DM-β-CyD の多形転移制御機構 25
第5節 小括 27
第2章 クロルプロパミド (CPM) の結晶化経路に及ぼす シクロデキストリンの影響
第1節 序 29 第2節 CPM の結晶化挙動 30 第1項 CPMの結晶化に及ぼす HP-β-CyD, DM-β-CyD の影響 30 第2項 CPM 準安定形Form IIの水溶液中における
多形転移挙動 33 第3項 CPM の結晶化に及ぼす競合包接剤の影響 35 第4項 CPM とDM-β-CyD の相互作用 37 第3節 新規多形 Form D のキャラクタリゼーション 40 第1項 Form II の転移に及ぼす DM-β-CyD, EHBA の影響 41 第2項 Form D の転移に及ぼす DM-β-CyD の影響 42 第3項 CPM 多形の溶出挙動 44 第4節 CPM の結晶化挙動とDM-β-CyD の影響 45 第5節 小括 48
第3章 シクロデキストリン固体複合体からの クロルプロパミド (CPM) の結晶化挙動
第1節 序 50 第2節 CPM と CyDs の相互作用 51
第1項 溶解度法 51
第2項 UV, CDスペクトル法 52
第3項 1H-NMR スペクトル法 53
第4項 CPM/HP-β-CyD 固体複合体の調製 59
第3節 HP-β-CyD 固体複合体保存時における CPM の結晶化と
多形転移挙動 60 第1項 HP-β-CyD 複合体からの CPM の結晶化と
多形転移挙動 60 第2項 保存時における CPM 多形の転移挙動 62
第４節 HP-β-CyD 固体複合体打錠時における CPM の結晶化と
多形転移挙動 70 第1項 HP-β-CyD 複合体からの CPM の結晶化と
多形転移挙動 71 第2項 打錠による CPM 多形の転移挙動 72 第5節 CPM の溶出及び in vivo 吸収に及ぼす
HP-β-CyD の影響 75
第1項 CPM 多形の溶出ならびに HP-β-CyD 複合体からの
CPM の溶出挙動 75
第2項 CPM 多形ならびに HP-β-CyD 複合体の
in vivo 吸収挙動 77
第6節 小括 79
総括 82
謝辞 86
実験の部 87
参考文献 92
本論文は学術雑誌に収載された次の論文を基礎とするものである
1) Effect of 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin on Polymorphic Transition of Chlorpropamide in Various Conditions: Temperature, Humidity and Moulding Pressure
Yoh Sonoda，Fumitoshi Hirayama，Hidetoshi Arima and Kaneto Uekama Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 50, 73-77 (2004).
2) Cyclodextrin-based Isolation of Ostwald’s Metastable Polymorphs Occurring during Crystallization.
Yoh Sonoda, Fumitoshi Hirayama, Hidetoshi Arima, Yoshihiro Yamaguchi, Wolfram Saenger and Kaneto Uekama.
Chemical Communications, 5, 517-519 (2006)
緒 言
固体物質は，原子や分子が 3 次元空間に配列した結晶とその配列が乱れた非 晶質に大別され，結晶はさらに安定形と準安定形に分類される．1-3) 近年，検出 技術の進歩により，無機および有機化合物について多くの多形の存在が確認さ れ，有機化合物の約 1/3 は 2 種あるいはそれ以上の結晶多形を有するものと推 定されている．4-6) 多形の中で融点が高く，溶解度が小さいものを安定形，それ より熱力学的に不安定なものを準安定形という． 薬物が複数の結晶多形を有す る場合，多形間において融点・打錠性・溶解性などの物理化学的性質が異なる ため，使用目的に適した結晶多形を効率よく生産することが重要である．7-9) 特 に，準安定形や非晶質体は，安定形に比べ，化学ポテンシャルが高く，溶解度 や溶解速度が大きいため，難水溶性薬物のバイオアベイラビリティ改善を目的 として意図的に製剤設計するケースが増えてきた．10-12)
多形の結晶化は，溶媒・結晶化温度・過飽和度・冷却速度・攪拌の有無・溶
液の pH・不純物の存在などの影響を受ける． 目的とする結晶多形を選択的に
結晶化させるには，これらの因子の中で一般に溶媒の種類・結晶化温度・薬物 濃度・過飽和度を調節する手法がとられる．13-17) これらの手法は結晶化の制御 法として古くから用いられてきたが，最近では，第 3 物質との相互作用を利用 して，有機化合物の結晶化経路や溶解，多形転移挙動などを制御する結晶工学 的手法が注目を集めている．18-21) 結晶化現象は，結晶核の発生と結晶面の成長 の2つの過程から構成される．22) 2個，3個，4個････の原子，分子あるいはイ オンが凝集して胚芽的なクラスターがエネルギー的に離散しにくい臨界サイズ になると結晶核が形成される． この結晶核の配列は，その後の結晶形を決める 重要な要素であり，結晶核をコントロールすることにより目的とする結晶多形 を結晶化させることができる． 例えば，Matzger らは，不溶性の高分子を
heteronuclei として薬物溶液に添加することにより，アセトアミノフェン多形の 選択的結晶化を行った (Fig. 1)．23) さらに，多数の不溶性高分子を合成して高分 子ライブラリーを作り，その官能基の違いを利用してアセトアミノフェン多形 の選択的結晶化およびスルファメトキサゾールの新規多形の結晶化に成功して いる．24) 結晶核が形成されると，結晶成長が起こる． 結晶成長は固/液界面に おける分子の供給によって進行し，成長速度は固/液界面における過飽和あるい は過冷却などの条件によって異なる． 例えば，結晶成長阻害剤は結晶成長に必 要な基質の吸着を阻害し，その面に垂直方向の結晶成長を抑制する． Scheme 1 は，ベンズアミドの結晶成長に対する安息香酸の抑制機構を示す．25，26) ベンズ アミドは，エタノール中でNH･･･O の分子間水素結合により b-軸方向に結晶成 長するが，安息香酸を添加すると末端のNH･･･O結合がO･･･Oとなり静電的反 発によって b-軸方向の成長が抑制される． その結果，a-軸方向の結晶成長が進 行する． このように，結晶化を制御することにより目的の結晶を析出させる方 法が最近検討されている． しかしながら，準安定形や非晶質は不安定であり，
安定な結晶へ転移することからその安定化が必要となる．
多形転移は溶液媒介性転移と固相転移に大別される． 固相転移の場合，準安 定形結晶中に安定形の核が形成され，その成長に伴い安定形へ転移する．一方，
溶液媒介性転移はオストワルドの段階則 27) に従って核化速度の速い準安定形 結晶が最初に結晶化し，溶液の薬物濃度は準安定形結晶の溶解度まで低下する．
しかしながら，この濃度は安定形の結晶に対して過飽和であるため，引き続い て安定形結晶が結晶化する． 安定形の結晶化にともない溶液中の薬物濃度が低 下すると，準安定形結晶の溶解がおこり，さらに安定形へ結晶化する． この過 程を繰り返しながら準安定形は安定形へ転移する． このような転移現象は溶液 媒介性転移13,28-32)と呼ばれ，目的の結晶多形を選択的に析出させるにはこれら多 形転移を制御する必要がある． 結晶成長は溶解の逆過程であるため，結晶成長
の制御に関する知見は難水溶性薬物の溶解性改善あるいは溶解機構を解明する 上で有用な基礎資料になる．
Fig. 1. Orthorhombic Acetoaminophen Growing from Isotactic Polypropylene Beads．23)
Scheme 1. Schematic Drawing of Crystal Structure of Benzamide along b-Axis．25)
H
H H H H
H H
H
N
N N
N N N N
N
H
H H H H H
H O O
O O
O O O
O O
O
H
Benzamide Benzoic acid b - axis
本研究で用いた トルブタミド (TB，Fig. 2) およびクロルプロパミド (CPM，
Fig. 2) は第1世代のスルフォニル尿素系糖尿病治療薬であり，結晶多形を有す
ることが知られている． TB および CPM は多形間で溶解性が異なり，また，
消化管液に対する溶解性も低いことから，その錠剤は第 14 改正日本薬局方
(JPXIV) の一般試験法における溶出試験の適用対象となっている． TB には 4
種の結晶多形が報告されている．33-37) 準安定形 Form IV は現在確認されている TB 結晶多形の中で最も溶解性の高い多形であるが，最も不安定である．37) ま た，CPM には数種類の結晶多形が知られており，38-40) 打錠時の圧力や温度によ り多形転移することが報告されている．41,42) これまでに我々は，2-ヒドロキシ プロピル-β-シクロデキストリン (HP-β-CyD) は，ニフェジピンや TB などの難 水溶性の結晶性薬物と非晶質性複合体を形成し，溶解性やバイオアベイラビリ ティを改善すること，さらに，保存時の結晶化を抑制することを明らかにし た．43-46)
Fig. 2. Chemical Structures of TB and CPM．
環状マルトオリゴ糖であるシクロデキストリン (CyD，Fig. 3) は機能性素材として 古くから注目され，その疎水空洞内にゲスト分子を立体選択的に取り込むこと から，難水溶性薬物の可溶化や安定性の改善，放出制御，バイオアベイラビリ ティの改善，苦味・悪臭および局所刺激性の軽減などに利用されている．47-52) 天 然 CyDsと総称されるものには構成グルコースが 6，7，8 個の α-，β-，γ-CyDs が知られており，最近では CyD の水酸基に種々の置換基を導入し，天然 CyDs
(TB)
(CPM)
SO2-NH-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH3 CH3
SO2-NH-CO-NH-CH2-CH2-CH3 Cl
の物性や機能性を改善した誘導体が構築され，医薬への応用研究が活発に展開 されている．53,54) CyD は溶液中において薬物と包接複合体を形成し，①薬物の 溶解度が増大する，②分子量の増加に伴い薬物の拡散速度が低下する，③分子 間相互作用を減弱させることにより凝集体形成を抑制することが知られている．
薬物の溶解度，拡散速度，凝集体形成は，結晶化に影響する重要な因子であるため，
CyD の包接特性を利用して結晶核の形成や結晶成長を抑制し，溶液媒介性の多 形転移を制御可能なものと考えられる．
Fig. 3. Chemical Structures of Cyclodextrins (CyDs) Used in This Study．
このような背景のもと，本研究では固体物性制御用素材としての CyD のユニ ークな機能を利用して，水溶液からの薬物の結晶化，保存あるいは打錠時にお ける薬物の多形転移の制御に関する基礎的検討を行った． まず，第1章では水 溶液中における TB の結晶化に及ぼす各種 CyD の影響を検討した結果，ジメ チル-β-CyD (DM-β-CyD) は TB の準安定形 Form IV を選択的に結晶化させる ことを明らかにした． DM-β-CyD 添加による準安定形 Form IV の選択的結晶 化は，ホスト－ゲスト相互作用を介して進行するものと推定されたため，次に
TB と DM-β-CyD との分子間相互作用を詳細に検討した． 第 2 章では，水溶
液からの CPM の結晶化に対する CyD の影響を検討し，DM-β-CyD は CPM
R6O OR2
R6O
(
n OR2
O )
O O OR2
OR3
R6O
OR6
R3O O O
OR3
O
O
O
O O
O O
OR6
OR6
OR3
OR2
R3O
R2O R3O
R2O
R6O OR2
R6O
(
n OR2
O )
O O OR2
OR3
R6O
OR6
R3O O O
OR3
O
O
O
O O
O O
OR6
OR6
OR3
OR2
R3O
R2O R3O
R2O
α- CyD γ- CyD β- CyD
1 3 2
2
H H H
DM-β-CyD DM-α-CyD
H or CH2CH(CH3)OH 1
R2,6= CH3, R3 = H 2
R2,6= CH3, R3 = H 1
H or CH2CH(CH3)OH
Chemical Structures of Cyclodextrins (CyDs) Used in This Study
Compound n R D.S.
4.2 4.8 14 12
a)
HP-β-CyD HP-α-CyDb)
c) d) e)
a) Degree of substitution. b) 2-Hydroxypropyl-α-CyD. c) 2-Hydroxypropyl-β-CyD.
d) 2,6-Di-O-methyl-α-CyD. e) 2,6-Di-O-methyl-β-CyD.
の準安定形 Form II や新規多形の転移を抑制することを明らかにした． これら の現象を利用して新規多形を高純度に単離し，その溶解性を他の多形と比較し た． 第3章では，固体状態における CPM の結晶化に対するCyDs の影響を明 らかにするために，CPM/CyDs 固体複合体を調製し，長期保存時における結晶 化挙動について検討した． その結果，HP-β-CyD は CPM と非晶質性の複合体 を形成することにより，CPM の結晶化および準安定形 Form C から安定形
Form A への転移を抑制することが明らかとなった． さらに，打錠時におけ
る多形転移挙動を検討した結果，CPM/HP-β-CyD 固体複合体は高圧力下におい ても安定なことが確かめられた．
以下に本研究で得られた結果を詳述する．
第 1 章 トルブタミド (TB) の結晶化経路に及ぼすシクロデキスト リンの影響
第1 節 序
本研究で対象とした TB は結晶多形を有する代表的な経口糖尿病治療薬であ り，これまで数種の多形の存在が報告されている． 例えば，Simonns らは2種 類，Georagarakis らは3種類，Birger や Traue らは3～4種類の結晶多形の存在 を報告している．34-36) また，当研究室では，エタノール/ジクロロメタン混合溶 媒を用いて噴霧乾燥すると，準安定形 Form IV が選択的に生成することを報告 した．37) 準安定形結晶は一般に有機溶媒を用いて調製されるが，残存溶媒や環 境保全の観点から，水を溶媒に用いて特定の準安定形結晶を高純度に調製する 方法の開発が望まれている． そこで本章では，水溶液からの TB の結晶化に及 ぼす天然 CyDs および CyDs 誘導体の影響を検討した．また，TB の結晶化に 対する CyDs 包接複合体形成の寄与を明らかにするため，CyDs と TB あるい は競合包接剤（p-ヒドロキシ安息香酸エステル類）との相互作用を溶解度法と各 種スペクトル法を用いて検討した．
第2 節 TB の結晶化挙動
第1 項 TB の結晶化に及ぼす各種 CyDs の影響
結晶多形の検出は，粉末 X 線回折，熱分析，赤外吸収スペクトル，密度，溶 解速度などの様々な物理化学的手法を用いて行われる． 本研究では，主に粉末 X線回折法により結晶多形の同定・定量を行った． TB の結晶化は，pH 8.0 リ
ン酸緩衝液にTB 5 mM を溶解後，0.5 N HCl を滴下して溶液のpH を6.8 に調 整し，冷蔵庫 (約4ºC) に保存することにより行った． CyDs 添加系では，TB 5 mM とCyDs 5 mM を溶解後，0.5 N HCl を滴下して溶液のpH を6.8 に調整し，
冷蔵庫 (約4ºC) に保存した．
Fig. 4 は，CyDs 非添加溶液および CyDs 添加（5 mM）あるいはグルコース
添加 (35 mM) 溶液を冷蔵庫に1日保存して得られた TB 結晶の粉末X線回折 パターンおよび示差走査熱量 (DSC) 曲線を示す． CyDs 非添加溶液から得られ た結晶は粉末 X 線回折において 2θ = 8.7º, 12.1º, 17.5º, 19.9º に特徴的な回折ピ ークを与え，この回折パターンは Georgarakis 34) や Traue 36) らが報告した安定 形結晶 Form I の回折パターンと一致した．また，DSC 曲線において，127ºC に
Form I の融解に基づく吸熱ピークを与えた． これらの結果は，CyDs 非存在下
において TB は安定形 Form I へ結晶化することを示唆する． また，グルコー ス添加溶液ならびに天然 α-, β-, γ-CyDs, HP-α, β-CyDs および DM-α-CyD 添加 溶液から析出した結晶は CyDs 非添加系と同様の粉末 X 線回折パターンおよ び DSC 曲線を示し，安定形 Form I へ結晶化した． 一方，DM-β-CyD 添加溶 液から得られた結晶は 2θ = 10.6º, 18.0º, 18.9º, 27.1º に TB の準安定形結晶
Form IV に特徴的な回折ピークを与え，DSC 曲線では 80ºC に Form IV から
Form II への転移に起因する発熱ピーク，100ºC に Form II から Form I への転 移に起因する吸熱ピーク，127ºC に Form I の融解に起因する吸熱ピークを与え た． これらの結果は，DM-β-CyD 存在下では TB は準安定形 Form IV へ結晶 化することを示唆する． Fig. 5 は DM-β-CyD 存在下および非存在下で析出し た結晶の形態を示す． CyDs 非添加溶液から得られた安定形 Form I は板状の 微結晶を示し，DM-β-CyD 添加溶液から得られた準安定形 Form IV は針状結晶 を示した． なお，析出した結晶中に CyDs が混入していないことを薄層クロマ トグラフィー，1H-核磁気共鳴スペクトル (NMR) ，元素分析 (実測値； H：6.72 %,
C：53.40 %, N：10.42 %，理論値； H：6.71 %, C：53.31 %, N：10.36 %) で確認 した．上記の結果より，TB はDM-β-CyD 水溶液において準安定形 Form IV へ 選択的に結晶化し，TB 単独あるいは他の CyDs 添加系では安定形 Form I へ結 晶化することが明らかとなった．
Fig. 4. Powder X-ray Diffraction Patterns (Left) and DSC Thermograms (Right) of Crystals Obtained from 5 mM TB in pH 6.8 Sodium Phosphate Buffer in the Absence and Presence of 5 mM α-CyD, β-CyD, γ-CyD, HP-α-CyD, HP-β-CyD, DM-α-CyD, DM-β-CyD or 35 mM glucose at 4 oC.
γ-CyD
glucose (35 mM) alone
β-CyD α-CyD
HP-α-CyD HP-β-CyD
DM-β-CyD DM-α-CyD
2 θ( º )
10 20 30 50 75 100 125 150
Temperature (℃)
Endothermic
Melting 127ºC
Form II Form IV
8.7º 12.1º
17.5º
19.9°
10.6° 18.0º 18.9° 27.1°
Fig. 5. Photographs of Form I (A) and Form IV (B) Crystals of TB Precipitated in the Absence and Presence of DM-β-CyD (5 mM), Respectively, in pH 6.8 Sodium Phosphate Buffer at 4ºC.
そこで，DM-β-CyD 添加による準安定形 Form IV の選択的結晶化の機構を明
らかにするため，結晶化の経時変化，溶液中 TB 濃度の経時変化，DM-β-CyD 濃 度の影響，競合包接剤の影響などを検討した． なお，以後の実験では，準安定 形結晶 Form IV を与えた DM-β-CyD，安定形結晶 Form I を与えた DM-α-CyD ならびに TB 単独溶液について比較検討した． Fig. 6 (A)~(C) は，薬物単独あ るいは DM-α-CyD, DM-β-CyD 含有 (5 mM) 溶液を 4oCに保存後，析出した固 体中の多形含量の経時変化を示す． また，Fig. 6 (D) はその時の溶液中 TB 濃 度の経時変化を示す． TB 単独溶液の場合 (Fig. 6 (A))，結晶化初期に準安定形
Form IV の結晶化が観測されたが，Form IV は速やかに Form I へ転移し，結晶
化開始 16時間で完全に安定形 Form I へ転移した． また，DM-α-CyD 存在下
(Fig. 6 (B)) においても，初期に Form IV が結晶化し，薬物単独に比べて若干遅
延するものの，結晶化開始24時間までにForm IV は消失し，Form I へ100 % 転 移した． 一方，DM-β-CyD 存在下では (Fig. 6 (C))，TB は Form IV へ結晶化 したが，Form IV からForm I への転移はみられず，Form IV の状態を1週間以 上維持し，2週間後においても Form I への転移は僅か 20% であった． この時の 溶液中 TB 濃度は，Fig. 6 (D) に示すように，薬物単独の場合，結晶化開始後す
(A) (B)
200 µm 100 µm
100 µm
みやかに減少し，約 0.3 mM で平衡に達した．一方，DM-β-CyD 存在下では約 1.5 mM まで減少し平衡に達した． 溶解平衡時における固相は，薬物単独の場合
Form I，DM-β-CyD 存在下の場合 Form IV であるため，平衡時の溶液濃度 0.3
mMおよび 1.5 mM はそれぞれ Form I および Form IV の溶解度の近似値とみ なすことができる． DM-α-CyD 存在下における TB 濃度は 4 時間で約 1.5 mM まで減少し，この値をさらに約4時間維持したが, その後低下し約 0.8 mM まで減少した． DM-α-CyD は Form IV から Form I への転移を若干抑制する
Fig. 6. Time Courses (A-C) for Appearance and Disappearance of TB Polymorphs Forms I ( ) and IV ( ) and Changes (D) in TB Concentrations in Sodium Phosphate Buffer Solution (pH 6.8) in the Absence (A) and Presence of 5 mM DM-α-CyD (B) or DM-β-CyD (C) during Crystallization at 4 oC.
◆: CPM alone, ▲: DM-α-CyD, ■: DM-β-CyD.
Time (h)
Concn. of tolbutamide (mM)
Polymorph content (%)
Time (h)
0 10 20
0 50 100
Time (h)
0 10 20 168
0 100
Time (h)
0 10 20
0 100 (A)
(D) (B)
(C)
0 24 48 72 96
0 2 4 50
50
Polymorph content (%)
Polymorph content (%)
Time (h)
Concn. of tolbutamide (mM)
Polymorph content (%)
Time (h)
0 10 20
0 50 100
Time (h)
0 10 20 168
0 100
Time (h)
0 10 20
0 100 (A)
(D) (B)
(C)
0 24 48 72 96
0 2 4 50
50
Polymorph content (%)
Polymorph content (%)
ため，Form IV が存在する間は Form IV の溶解度を維持するが，その後 Form IV
から Form I への転移に伴い溶解度が減少したものと考えられる． なお，
DM-CyDs 添加系の TB 平衡濃度が薬物単独に比べて高いのは，複合体形成に
よる可溶化に起因するものと推察される． 以上の結果から，DM-β-CyDによる 準安定形 Form IV の選択的結晶化は，Form IV から安定形結晶 Form I への転 移の抑制に起因することが明らかとなった．
次に，TB 結晶化に及ぼす DM-β-CyD 濃度の影響を検討した． Fig. 7 (A) は 種々の濃度のTB (5 mM)/DM-β-CyD (0~5 mM) 水溶液を4ºCで 1 日保存後に析 出した固相中の多形含量を示す． DM-β-CyD 濃度 0.1 mM 以下では Form I と Form IV が混在したが，0.1 mM 以上では TB は 100% Form IV として結晶化 した． 一般に，結晶化は結晶核形成と結晶成長の 2 段階を経て進行する． 結 晶核形成が律速段階の場合，外部から結晶核を添加すると結晶化速度は増大す るが，結晶成長が律速の場合は結晶核の影響は少ない． そこで，結晶核添加の 影響を検討した． Fig. 7 (B) は，Fig. 7 (A) に示す TB/DM-β-CyD 水溶液に安定形
Form I（15 mg）を種結晶として添加した系の多形含量を示す． 図から明らかな
ように，Fig. 7 (A) の含量曲線は，Form I 結晶核添加によりDM-β-CyD 高濃度 側へシフトした． 例えば，Form Ｉ と From IV の 1：1 混合物を与える DM-β-CyD 濃度は Form I 添加により，約 0.05 mM から約 0.7 mM へ増大した．
また，0.5 mM DM-β-CyD 存在下では Form IV が100% 結晶化 (Fig. 7 (A)) した が，同一条件下で Form I 結晶核を添加すると Form I 結晶が 75% 析出した (Fig. 7 (B))． これらの結果は，DM-β-CyD が Form I の結晶核形成を抑制する ことを示唆する．一方，DM-β-CyD 高濃度領域 (5 mM) において TB は100 %
Form IV として存在することから，この濃度領域では DM-β-CyD は核形成のみ
ならず，TB の結晶成長も抑制したものと推定される．
Fig. 7. Contents of Forms I ( ) and IV ( ) TB Crystals Precipitated in the Presence of Different DM-β-CyD Concentrations without (A) or with (B) Form I Seed-crystals after Storage for 1 day at 4 oC.
第2 項 TB 準安定形Form IV の水溶液中における多形転移挙動
前項の検討から，TB/DM-β-CyD 水溶液を 4oC に保存すると準安定形 Form IV が選択的に結晶化すること，また，Form IV の選択的結晶化は Form IV か ら 安定形 Form I への転移の抑制に起因することが明らかとなった．そこで次 に，安定形 Form I の飽和水溶液中に準安定形 Form IV 結晶を添加し，Form IV の多形転移挙動を検討した． Fig. 8 は安定形 Form I の飽和溶液 (0.4 mM, 20 mL) に準安定形 Form IV 結晶 (15 mg) を添加した際の固相の多形含量の経時 変化を示す． また，Fig. 9 はその時の溶液中TB 濃度の経時変化を示す． Fig.
8 (A) に示すように，添加した Form IV 結晶は速やかに Form I 結晶へ多形転移
し，約 18 時間で完全にForm I へ転移した． 一方，Fig. 8 (B) に示すように，
DM-β-CyD 添加 (5 mM) 系では Form I への転移は観察されなかった． また，
Fig. 9 に示すように，DM-β-CyD 非存在下の溶液中 TB 濃度は実験初期に増大
し，プラトーに到達後減少した． Form IV の溶解度は Form I に比べて高いた
Concn. of DM-β-CyD (mM) 0
100
0 0.5 1 5
50
Polymorph content (%)
(A)
0 0.5 1 5
(B)
め，初期に Form IV の溶解が起こり溶液中 TB 濃度が上昇するが，この濃度範 囲は Form I に関して過飽和であるため，その後 Form I が析出し，溶液中 TB 濃度は Form I の溶解度まで減少したものと考えられる． 従って，これらの結 果は，水溶液中における Form IV から Form I への多形転移が溶液媒介性機構 に従うことを示唆する． 一方，Fig. 9 に示すように，DM-β-CyD 存在下では
Form IV から Form I への転移は起こらないため，TB 濃度は初期に上昇し，そ
の後一定値を保った． これらの知見は，DM-β-CyD が TB の Form IV から Form I への溶液媒介性転移を抑制すると共に Form I の結晶核形成および結晶 成長を抑制することを示唆する．
Fig. 8. Time Courses for Polymorphic Transition of Form IV ( ) to Form I ( ) in Phosphate Buffer at 4°C.
Excess amount (15 mg) of Form IV crystals was added to saturated solution of Form I TB crystals (0.4 mM, 20 mL) in the absence of CyDs (A) or presence of DM-β-CyD (B).
TB Polymorph (%)
Time (h)
0 10 20 30
0 100
50
Time (h)
0 10 20 30
0 100
50
Time (h)
0 10 20 30
0 100
50
（A） （B）
Fig. 9. Changes in TB Concentrations in Solution during Crystallization at 4 oC.
Excess amount (15 mg) of Form IV crystals was added to a saturated solution of Form I TB crystals (0.4 mM, 20 mL) in the absence of CyDs ( ) or presence of DM-β-CyD ( , 5 mM).
第3 項 TB結晶化に及ぼす競合包接剤の影響
前項の検討から，DM-β-CyD による TB の準安定形 Form IV の溶液媒介性 転移の抑制には，TB と DM-β-CyD との複合体形成が関与するものと推定され た． そこで本項では，包接複合体の関与を明らかにするため，競合包接剤の影 響を検討した．なお，競合包接剤には p-ヒドロキシ安息香酸 (HBA) および p- ヒドロキシ安息香酸エチル (EHBA), プロピル (PHBA), ブチル (BHBA) エス テルを用いた． 結晶化実験では，競合包接剤を TB および DM-β-CyD ととも に pH 8.0 のリン酸緩衝液に溶解後，0.5 N HCl を滴下して溶液の pH を 6.8 に 調整し，冷蔵庫 (約4ºC) に保存して行った． Fig. 10 は，結晶化 1 日後に得ら れた Form I および Form IV含量を競合包接剤の濃度に対してプロットした結 果を示す． DM-β-CyD 濃度 5 mM において競合包接剤が存在しない場合，TB は 100 % Form IV として結晶化したが，競合包接剤を添加すると濃度依存的に
Form IV から Form I への転移が促進された． これは競合包接剤が DM-β-CyD
0 10 20 30
0 0.5 1.5
1.0
Time (h)
Concn. of TB (mM)
と相互作用して複合体の解離を惹起し，遊離薬物濃度が上昇したことによるも のと考えられる． そこで，Form IV 結晶化に対する競合包接剤の50 % 抑制濃 度を各競合包接剤と DM-β-CyD との複合体の安定度定数に対してプロットし た結果を Fig. 11 に示す．なお，競合包接剤と DM-β-CyD との安定度定数は，
次節で述べる溶解度法により求めた． 図から明らかなように，DM-β-CyD の
50 % 抑制濃度は，競合包接剤と DM-β-CyD と複合体との安定度定数が大きく
なるにつれて低下した． これらの結果は DM-β-CyD による溶液媒介性転移の 抑制に TB との複合体形成が関与することを強く示唆する．
Fig. 10. Contents of Form I (○) and Form IV (●) Crystals of TB in the Crystals Precipitated in the Presence of Different Concentrations of Competitors (p-Hydroxybenzoic Acid (A) and Its Ethyl (B), Propyl (C) and Butyl (D) Esters) in DM-β-CyD Solution (5 mM) in pH 6.8 Sodium Phosphate Buffer at 4 oC.
50 100
Concn. of competitor (mM)
0 2 4
0
Concn. of competitor (mM)
0 2 4
0 2 4
(A) (B)
(C) (D)
50 100
0
50 100
0
50 100
0 2 4 0
Polymorph content (%)Polymorph content (%) Polymorph content (%)Polymorph content (%)
Concn. of competitor (mM) Concn. of competitor (mM)
Fig. 11. Relationship between the 50% Inhibitory Concentration of Competitors (p-Hydroxybenzoic Acid ( ) and Its Ethyl ( ), Propyl ( ) and Butyl ( ) Esters) and the Stability Constant of Competitor/
DM-β-CyD Complexes.
第3 節 TB とCyDs の相互作用
前節では，DM-β-CyD が TB と相互作用して準安定形 Form IV から安定形
Form I への溶液媒介性転移を抑制することを明らかにした． そこで本節では，
TB あるいは前節で用いた競合包接剤 (p-ヒドロキシ安息香酸エステル類) と
CyDs との相互作用を溶解度法を用いて検討した． さらに，TB/DM-α-CyD お
よび TB/DM-β-CyD 系の相互作用を 1H-NMR スペクトル法を用いて詳細に検 討した．
Stability constants (M-1) 50% Inhibitory concn. of competitors (mM)
0 2000 4000 6000
0.5 1
0
第1 項 溶解度相図
Fig. 12 は，水溶液中における TB と各種 CyDs との相互作用を溶解度法 55) により検討した結果を示す． β-CyD 添加系の相図は，CyD 濃度の増加に伴い TB の水への溶解度が直線的に増加し，その後減少する， Higuchi らの分類に よるBS 型を示した． 一方，他の CyDs 添加系では，TB の溶解度は CyDs 添 加濃度の増加に伴い直線的に増大する AL 型相図を示し，1：1 複合体形成が示 唆された． そこで式 (1) を用いて，溶解度相図の上昇直線の傾きと切片の値か
ら TB と CyDs との複合体の安定度定数を算出し，得られた結果を Table 1 に
示す．
DM-β-CyD と TB の安定度定数は 1920 M-1 となり，他の TB/CyDs 複合体 (< 344 M-1) よりも著しく大きい値を示し，DM-β-CyD は TB と強く相互作用す ることが明らかとなった．
Fig. 12. Phase Solubility Diagrams of TB/CyD Systems in Water at 25 oC.
( )α-CyD, ( ) HP-α-CyD, ( ) DM-α-CyD, ( ) HP-β-CyD, ( ) DM-β-CyD, ( , insert) β-CyD.
0
Concn. of CyDs (mM)
0 20 40 60
2 4 6
0 5 10 15
0 0.5 1.0
Concn. of TB (mM)
K1:1 =
Intercept (1-slope) slope
(1)
Table 1. Stability Constants (Kc) of TB/CyDs Complexs in Water at 25ºC.
次に，前節で用いた競合包接剤と DM-β-CyD の相互作用を溶解度法により検討 した (Fig. 13)． 競合包接剤/DM-β-CyD 系の溶解度相図は AL 型を示し，各競 合包接剤は DM-β-CyD と 1：1 複合体を形成することが示唆された． 相図の 直線の傾きと切片の値から求めた複合体の安定度定数は，HBA で 120 M-1，エ ステル部のアルキル基がエチル，プロピル，ブチルと長くなるにつれて 310 M-1， 2260 M-1，5800 M-1 と大きくなり，相互作用が増強した．
Fig. 13. Phase Solubility Diagrams of Competitor/DM-β-CyD Systems in Water at 25 oC.
p-Hydroxybenzoic acid ( ) and its ethyl ( ), propyl ( ) and butyl ( ) esters.
Concn. of DM-β-CyD (mM)
0 20 40
0 40 80 120
Concn. of competitor (mM)
System Kc(M-1) α-CyD
β-CyD HP-α-CyD HP-β-CyD DM-α-CyD DM-β-CyD
24 344
73 194 125 1920 System Kc(M-1)
α-CyD β-CyD HP-α-CyD HP-β-CyD DM-α-CyD DM-β-CyD
24 344
73 194 125 1920
第2 項 NMR スペクトル法
本項では，1H-NMR スペクトル法を用いて TB と DM-α，β-CyDs との相互 作用および複合体のモル比を検討した．
2. 1. 1次元1H-NMRスペクトル法
Fig. 14 は，DM-α-CyD または DM-β-CyD 添加による TB プロトンの化学シ フト変化を示す． DM-α-CyD 添加により，フェニル基部分のプロトン (H1，H3， H4) に大きなシフト変化は観察されなかったが，ブチルエステル部分のプロトン (H10，H11，H12) は著しく低磁場シフトした (Fig. 14 (A))． 一方，DM-β-CyD 添 加系ではフェニル基部分 (H3，H4) およびブチル基部分 (H9，H11) のプロトンの シフト変化が大きかった (Fig. 14 (B))． これらの結果は，空洞系の小さい DM-α-CyD (α-CyD の空洞内径：約4.7～5.3 Å) は TB のブチル基部分を優位に 包接することを示唆する．一方，DM-β-CyD (β-CyD の空洞内径：約 6.0～6.5 Å) はフェニル基部分あるいはブチル基部分と相互作用することを示唆する． 前述 の溶解度法の結果より，TB は DM-α-CyD および DM-β-CyD とモル比 1：1 複 合体を形成することが示唆された． そこで，TB/DM-CyDs 複合体の組成比を正 確に求めるため，1H-NMR 化学シフト変化を連続変化法により解析した． Fig.
15 は DM-CyDs 添加によりシフト変化の大きかった TB の H12 プロトンをモ ニターして得られた連続変化法のプロットを示す．56-58) いずれの DM-CyDs 系 においてもシフト変化は，ホスト/ゲスト比が 0.5 で極大値を与え，DM-CyDs は TB とモル比 1：1 複合体を形成することが示唆された．
Fig. 14. 1H-Chemical Shift Displacements (ppm) of TB (5 mM) by the Addition of DM-α-CyD (A, 5 mM) and DM-β-CyD (B, 5 mM) in pH 9 Borate Buffer in D2O at 25 oC.
( ) H1, ( ) H3, ( ) H4, ( ) H9, ( ) H10, ( ) H11, ( ) H12.
Fig. 15. Continuous Variation Plots for TB/DM-α-CyD ( ) and DM-β-CyD ( ) Systems in pH 9.0 Borate Buffer in D2O at 25 ºC.
The 1H-shift of H12 proton of the guest was monitored under the total concentration (host + guest) of 5 mM.
∆δobs= absolute value of the 1H-chemcial shift displacements.
SO2-NH-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH3 CH3
1
3 4
9 10 11 12 SO2-NH-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH3 CH3
1
3 4
9 10 11 12
0 0.03
-0.03
1 2
(A)
0 0.03
-0.03
1 2
(A)
δwithCyD–δwithoutCyD(ppm)
0.03
-0.03 0
(B)
Molar ratio of TB/DM-α-CyD
Molar ratio of TB/DM-β-CyD
3.0
∆δobs・［TB］X10-5
1.0 2.0
10 0 5
5
Composition ratio
（TB/DM-CyDs）
0 10 0
2. 2. 2次元 1H-NMR スペクトル法
前 述 の 検 討 か ら ，DM-α-CyD は TB の ブ チ ル 基 部 分 を 包 接 し ， 一 方
DM-β-CyD はフェニル基あるいはブチル基を包接することが示唆された．そこ
で，TB/DM-CyDs 複合体の包接構造の詳細を明らかにするため，2 次元 ROESY
(rotating frame nuclear Overhauser enhancement spectroscopy) スペクトルによる検 討を行った． Fig. 16 に示すように，DM-α-CyD 系の ROESY スペクトル (Fig. 16 (A)) において，TB 分子末端のメチルプロトン (H1，H12) はいずれも CyD プロトンと相関ピークを与えた． すなわち，TB ブチル基のメチルプロト ン H12 は CyD 空洞内部の H5’ プロトンと相関を示すのみならず，空洞外部 の H1’ プロトンとも相関ピークを与えた． また，TB トルエン部分のメチルプ ロトン H1 は CyD 空洞内部の H5’ プロトンのみならず，空洞周辺の H6’，
2’-CH3，6’-CH3，さらに空洞外部の H1’ とも相関ピークを与えた． これらの結
果は，TB のトルエン部分あるいはフェニル基が DM-α-CyD 空洞内に包接され，
未包接残基は CyD 空洞表面を覆うように相互作用することを示唆する．事実，
TB の安定コンフォメーションは直線構造ではなく，ブチル基とトルエン基が折 れ曲がった U 字型構造をとることが報告されている (Fig.17 の包接構造を参 照)． 一方，DM-β-CyD 複合体の場合 (Fig.16(B))，CyD との相関ピークは，ブ チル基の末端メチルプロトン (H12) 間では観察されなかったが，トルエンのメ チルプロトン (H1) 間で観察された． また，トルエン部のベンゼンおよびメチ ルプロトン (H1, H3, H4) は DM-β-CyD の 1 級水酸基側の 6 位末端メチルプ ロトン (6’-OCH3) と相関ピークを与えることから，トルエン部分は CyD 空洞 の奥深くに位置するものと推定された．一方，トルエンのメチルプロトン (H1) は CyD 空洞内部 (H5’) や 1 級水酸基側のプロトン (H5’, H6’ ，6’-OCH3) のみ ならず，2 級水酸基側の 2’-OCH3 プロトンとも相関ピークを与えた． これらの
