濾胞性リンパ腫におけるユビキチンリガーゼ Skp2 の発現に関する免疫組織化学的検討
昭和大学薬学部医薬品評価薬学部門
石原 里美
昭和大学医学部病理学講座（病理学部門）
本間まゆみ 佐々木陽介 塩沢 英輔
昭和大学医学部病理学講座（臨床病理診断学部門）
野呂瀬朋子 矢持 淑子 瀧本 雅文
要約：濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma：FL）は，「胚中心を構成する B 細胞，すなわち 中型の centrocyte と大型の centroblast を正常対応細胞とする腫瘍で，通常は明瞭な腫瘍性胚 中心様構造が 1 個以上存在するもの」と定義されている．FL では腫瘍細胞中の centroblast の割合により Grading が行われ，Grade によって生命予後や再発率に差が出ることが示され ている．細胞周期の進行は，ユビキチン プロテアソーム経路による厳密なタンパク質分解に より調節されており，ユビキチンリガーゼの一種である S-phase kinase-associated protein 2
（Skp2）の過剰発現は細胞周期回転を促進し，腫瘍の発生や増殖速度と関連があるとされてい る．今回われわれは，FL における細胞周期関連タンパク質の発現および Grade との関連を免 疫組織化学的に検討した．対象は昭和大学病院でFLと診断された70症例で，Grade 1は15例，
Grade 2 は 30 例，Grade 3A は 20 例，Grade 3B は 5 例であった．70 例のホルマリン固定パ ラフィン包埋組織切片を用いて，Skp2，p27，Ki-67 の免疫組織化学的染色を行った．Skp2，
p27，Ki-67 それぞれについて，陽性率の最も高い部分を hot spot とし，hot spot 内の腫瘍細 胞 500 個中の陽性細胞数の割合を算出し，FL における細胞周期関連タンパク質の発現および Grade との関連を検討した．Skp2 と p27，および p27 と Ki-67 の発現にはそれぞれ負の相関 を認めた．Skp2 と Ki-67 の発現には正の相関を認めた．Grade 別の検討では，Grade があが るにしたがい，Skp2，Ki-67 の発現率は有意に増加し，p27 の発現率は有意に減少していた．
FL の細胞増殖性の指標として Skp2，p27，Ki-67 の免疫組織化学的染色は有用な手段と考え られた．また，Skp2 も Ki-67 と同様に細胞増殖マーカーのひとつとなり，Skp2 の高発現は FL の悪性度の指標となり得る可能性が示唆された．
キーワード：follicular lymphoma，Skp2，p27，Ki-67，細胞周期
濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma：FL）は，
「胚中心を構成するB 細胞，すなわち中型のcentrocyte と大型の centroblast を正常対応細胞とする腫瘍で，
通常は明瞭な腫瘍性胚中心様構造が 1 個以上存在す るもの」と定義されている1）．欧米では悪性リンパ 腫のうち 20 〜 35％程度を占める代表的なリンパ腫 であり2），非ホジキンリンパ腫の中で 22％を占め，
びまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫（Diffuse large B-cell lymphoma：DLBCL）（31％）についで多い3）． 日本では 1994 〜 1995 年のデータにおいて全悪性リ ンパ腫の 6.7％であったが，成人リンパ腫治療研究
会の集計では 2004 〜 2008 年で 18.3％を占めたと 報告されている4）．昭和大学病院においても濾胞 性リンパ腫は 11.7％とを占めており5），近年わが国 でも FL が増加傾向にあることが指摘されている．
FL では腫瘍細胞中の centroblast の割合により Grading が行われ，強拡大視野あたり centroblast が 5 個以下のものを Grade 1，6 〜 15 個のものを Grade 2，16 個以上で centrocyte を伴うものを Grade 3A，それを欠くものを Grade 3B と定義している1）． 近年，Grade によって生命予後や再発率に差が出る ことが示されている6，7）．また，Grade が上がるほど 原 著
細胞の増殖活性が上がるとされており8，9），Grade 1，
2 では Ki-67 の発現率は 20％未満，Grade 3 では 20％を超えると言われている1）．
Ki-67 は細胞増殖マーカーのひとつで10），多くの 腫瘍において悪性度や予後とよく相関することが知 られている．Ki-67 は細胞周期中の，G0 期（休止期）
を除く G1，S，G2，M 期において発現が認められ る11）．
細胞周期の進行は，ユビキチン プロテアソーム 経路による厳密なタンパク質分解により調節されて おり12），それぞれの時期に特異的な複数のサイクリ ンと，サイクリンに結合して活性を発揮するサイク リ ン 依 存 性 キ ナ ー ゼ（cyclin-dependent kinase：
CDK）によって制御されている．サイクリンがユ ビキチン化され，これを標識としてプロテアソーム によりタンパク質分解される．サイクリンのユビキ チン化には，ユビキチン活性化酵素，ユビキチン結 合酵素，ユビキチンリガーゼという 3 つの酵素が 関与している．このなかで，ユビキチンリガーゼは 標的タンパク質の識別という最も重要な役割を担っ ている．近年，ユビキチンリガーゼの一種である S-phase kinase-associated protein 2（Skp2） が 細 胞周期の制御に関与していることが明らかとなって
きた12，13）．Skp2 は主に p27 などの CDK 阻害タン
パク質の分解を誘導し，G0 期から細胞周期への再 進入を促し，細胞増殖を開始する．Skp2 の過剰発 現は細胞周期回転を促進し，腫瘍の発生や増殖速度 と関連があるとされ14），これまでに前立腺癌15）や 口腔扁平上皮癌16）など多くの癌において，Skp2 の 高発現が腫瘍の予後や悪性度と相関したと報告され ている．悪性リンパ腫においては DLBCL において Skp2 高発現例は予後不良であるという報告がある
が17‑19），FL に関する報告はほとんどない．
今回われわれは，FL における細胞周期関連タン パク質の発現および Grade との関連を免疫組織化 学的に検討した．
研 究 方 法
1986 年 12 月から 2010 年 12 月までに昭和大学病 院で診断され，WHO 造血器・リンパ系腫瘍分類第 4 版1）に基づいて再検討し，FL と診断された 70 症 例を対象とした．本研究ではヘルシンキ宣言（1964 年制定， 2008 年修正）を遵守し，倫理的配慮に基
づいた医学研究を行った．対象症例の病理検体の研 究利用は研究倫理委員会で承認されている（昭和大 学ヒトゲノム・遺伝子解析倫理審査委員会 110 号，
平成 21 年 3 月 2 日承認）．
70 例のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片 を用いて，Skp2（Polyclonal，1：1000，Santa Cruz，
USA），p27（1B4，1：100，Novocastra，UK），
Ki-67（MIB-1，1：200，DAKO，USA） の 一 次 抗 体を使用して免疫組織化学的染色を行った．パラ フィン切片を脱パラフィン処理後，抗原賦活処理と して，pH7 または pH9 の抗原賦活化液（pH7；三 菱化学メディエンス，pH9；ニチレイ）中でマイク ロウェーブ処理（98℃，20 分間または 40 分間照射）
を行った．その後，3％過酸化水素水で 5 分間反応 させ内因性ペルオキシダーゼの除去を行い，pH7.2 リン酸緩衝液（PBS）に 5 分間浸漬した．Skp2 に ついては 5 分間血清 blocking 処理を行った．一次 抗体を室温で 60 分または 4℃で一晩反応させた後，
PBS で 5 分間 3 回洗浄し，室温で二次抗体（DAKO ENVISION キ ッ ト/HRP（DAB） ポ リ マ ー 試 薬，
ダコ・ジャパン）を 40 分間反応させた．次に PBS で 5 分 間 3 回 洗 浄 し た の ち，Diaminobenzidine Tetorahydrochloride（DAB）（DAKO ENVISION
＋キット/HRP（DAB）DAB ＋発色基質キット，
ダコ・ジャパン）で発色させた．ヘマトキシリンで 核染色し，脱水後封入した．
Skp2，p27，Ki-67 それぞれについて，低倍率視 野で陽性率の最も高い部分を hot spot とし，高倍 率（対物 40 倍）視野で hot spot 内の腫瘍細胞 500 個中の陽性細胞数の割合を算出した．病理専門医を 含む 2 名が独立してカウントし，その平均値を求 め，FL における細胞周期関連タンパク質の発現お よび Grade との関連を検討した．
統計学的解析は，χ2検定および Fischer の直接 検定法を用い，いずれも p 値が 0.05 未満を統計学 的に有意差ありとした．
結 果
FL70 例の内訳は，男性 41 例，女性 29 例，年齢 は 28 〜 83 歳， 年 齢 中 央 値 は 52.9 歳 で あ っ た．
検体採取部位は，リンパ節 65 例，節外病変 5 例
（扁桃 1 例，唾液腺 3 例，耳下腺 1 例）であった．
Grade 1 は 15 例，Grade 2 は 30 例，Grade 3A は
20 例，Grade 3B は 5 例であった．
Fig. 1 に FL の Grade 別における各抗体の染色性 の代表例を示す（Fig. 1）．
Skp2 と p27 の発現には負の相関を認めた（P ＝ 0.0014，r ＝−0.371）．Skp2 と Ki-67 の発現には正 の 相 関 を 認 め た（P ＜ 0.0001，r ＝ 0.579）．p27 と Ki-67 の発現には負の相関を認めた（P ＝ 0.0005，r ＝
−0.402）（Fig. 2）．
FL の Grade 別の検討では，Grade があがるにし たがい，Skp2，Ki-67 の発現率は有意に増加してい た（P ＝ 0.0003，P ＜ 0.0001）． ま た，Grade が あ がるにしたがい，p27 の発現率は有意に減少してい た（P ＝ 0.0021）（Fig. 3）．
考 察
細胞周期は DNA 合成が起こる S 期，複製された 染色体 DNA が娘核に分配される M 期，これらの 複製と分配のステージに介在する 2 つのギャップ期 として G1 期と G2 期があり，G1 → S → G2 → M → G1 というステージを繰り返すことによって細胞増殖が 行われる．細胞周期は，周期のそれぞれの時期に特 異的な複数のサイクリンと，サイクリンに結合して 活性を発揮する CDK によって制御され，ユビキチ ン プロテアソーム経路による厳密なタンパク質分 解により調節されている．ユビキチン化されたサイ クリンを標的として，プロテアソームによるタンパ ク質分解がなされ，サイクリン濃度はユビキチン Fig. 1 Immunohistochemical analysis of Skp2, p27 and Ki-67 expression in follicular lymphoma （FL）. Higher grade
of FL was associated with a higher expression of Skp2 and Ki-67, while p27 was significantly more preva- lent in lower grade FL. Grade 1（case 3）; （a）HE, （b）Skp2（0.4％）, （c）p27（93.7％）, （d）Ki-67（17.3％）:
Grade 2（case 34）; （e）HE, （f）Skp2（17.6％）, （g）p27（92.2％）, （h）Ki-67（36.9％）: Grade 3A（case 51）; （i）
HE, （j）Skp2（19.2％）, （k）p27（89.1％）, （l）Ki-67（41.6％）: Grade 3B（case 66）; （m）HE, （n）Skp2（32.1％）,
（o）p27（65.8％）, （p）Ki-67（43.1％）（×600）.
Fig. 2 Correlation between Skp2 and p27, Skp2 and Ki-67, p27 and Ki-67 in Follicular lymphoma. （A）Skp2 expression was inversely correlated with p27 and（B）
positively correlated with Ki-67 expres- sion. （C）P27 expression was inversely correlated with Ki-67 expression.
Fig. 3 Expression levels of Skp2, p27, and Ki-67 in the Grades. Higher grade of FL was associated with a higher expression of Skp2（A） and Ki-67（C）, while p27 was significantly more prevalent in lower grade FL（B）.
プロテアソーム経路によって時期特異的に変動す る．サイクリンのユビキチン化に関与するユビキチ ンリガーゼの一種である Skp2 は，主に p27 などの 細胞周期の抑制分子として機能している CDK 阻害 タンパク質の分解を誘導し，G0 期から細胞周期へ の再進入を促し，細胞増殖を開始する．細胞周期に 入った細胞は Ki-67 を発現する．
前立腺癌15）や肺小細胞癌20），口腔扁平上皮癌16）
などにおいて Skp2 と p27 の間に負の相関があるこ とが報告されており，また悪性リンパ腫では FL を 含む多くの組織型で同様の傾向を認めたという報
告21，22）がある．また，乳癌，大腸癌，口腔癌，前
立腺癌や，悪性リンパ腫などで，p27 の発現量の低 下が組織学的な悪性度や予後と相関したと報告され ている14‑16，23）．
Ki-67 は細胞増殖マーカーのひとつで10），非ホジキ ンリンパ腫において Ki-67 の発現率と生存率に負の 相関があること24）や，FL の Grade が上がると Ki-67 の発現率も上がることが報告されている9，21，25，26）． また，乳癌では p27 と Ki-67 の間に負の相関が あったという報告もある27）．
今回われわれの検討では，FL において Skp2 と Ki-67 は 正 の 相 関 を 示 し，Skp2 と p27，p27 と Ki-67 の間にはそれぞれ負の相関が認められ，FL に おける細胞周期の進行に Skp2 や p27 が関与してい ることが示唆された．また，これまでの報告28）と 同様に，FL の Grade があがるにしたがい，Skp2，
Ki-67 の発現率は有意に増加し，p27 の発現率は有 意に減少していた．FL では Grade があがるほど細 胞の増殖活性があがるとされており，これらの細胞 周期関連タンパク質の発現は Grade を反映してい ると考えられた．今回の検討では，FL 全体として は Skp2 と Ki-67 の発現に正の相関を認めたが，こ れまでの報告25）と同様に，Skp2 の陽性率は Ki-67 の陽性率と比較して低い傾向があった．また，Grade 別の検討においては，Skp2 の染色性は Ki-67 の染 色性と比較すると分布にややばらつきがあり，特に Grade 3A では症例 63 のように Skp2 と Ki-67 の陽 性率に大きな乖離を認める例があった．これらは，
Ki-67 が細胞周期中の G0 期（休止期）を除く G1，S，
G2，M 期において発現が認められる11）のに対し，
Skp2 は G1−S 移行期から発現し始め，S−G2 期で 発現量が最大となる29）ことに起因すると考えられ
る．個々の細胞が細胞周期のどの時期にあるかに よって Skp2 と Ki-67 陽性率の乖離が生じると思わ れる．症例 63 では Skp2 は発現してないが，Ki-67 が発現している M 期の細胞が多かった可能性があ る．今回は Grade 3B については症例数が少ないた め言及できないが，Skp2 と Ki-67 の染色性の違い が特に Grade 3A で認められたのは，Grade があが るほど細胞の増殖活性があがり増殖サイクルにある 細胞が多いために染色性の違いが明瞭になったもの と考えられる．
臨床的には，FL Grade 1，2 は低リスク群，Grade 3 は中リスク群に分類され，aggressive lymphoma の一画を占める． 治療選択のうえでも両群は異なっ た対応が求められる．FL の Grade 分類は強拡大あ たりの centroblast の数に基づいて定義されている が，細胞の大きさの評価が必ずしも容易でないこと や，陽性細胞のカウントをする手技の習熟度によっ ても異なり，必ずしも病理医間で一致しないことが 多い8）．FL の細胞増殖性の指標として Skp2，p27，
Ki-67 の免疫組織化学的染色は有用な手段と考えら れた．また，Skp2 も Ki-67 と同様に細胞増殖マー カーのひとつとなり，Skp2 の高発現は FL の悪性 度の指標となり得る可能性が示唆された．
文 献
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IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF SKP2, A UBIQUITIN LIGASE, IN FOLLICULAR LYMPHOMA
Satomi ISHIHARA
Department of Pharmaceutical Regulatory Science, Showa University School of Pharmaceutical Science
Mayumi HOMMA, Yosuke SASAKI and Eisuke SHIOZAWA Department of Pathology, Showa University School of Medicine
Tomoko NOROSE, Toshiko YAMOCHI-ONIZUKA and Masafumi TAKIMOTO Department of Pathology Clinico-diagnostic Pathology, Showa University School of Medicine
Abstract Follicular lymphoma （FL） is a neoplasm composed of follicle center B-cells, which gen- erally has at least a partial follicular pattern. FL is classified into grades 1, 2 and 3 based on the number of centroblasts in neoplastic follicles. The proliferation and progression of neoplastic cells are known to be closely related to abnormalities in various positive and negative cell-cycle regulators. Skp2 positively regulates the G1-S transition by promoting degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Re- cent evidence has indicated an oncogenic role of Skp2 in not only carcinogenesis but also lymphomagene- sis. In this study, we performed immunohistochemical analysis of the cell cycle-associated proteins, Skp2, p27, and Ki-67, in 70 patients with FL, to evaluate the correlation between FL grade and the expression levels of these proteins. In all 70 patients, Skp2 expression was inversely correlated with p27 and posi- tively correlated with Ki-67 expression. P27 expression was inversely correlated with Ki-67 expression.
Higher grade FL was associated with a higher expression of Skp2 and Ki-67, while p27 was significantly more prevalent in lower grade FL. It was suggested that Skp2 is a valuable marker to predict prolifera- tion of the neoplastic cells in FL. Analysis of Skp2 levels may also be a useful and objective approach for grading FL.
Key words: Follicular lymphoma, Skp2, p27, Ki-67, cell cycle
〔受付：9 月 24 日，受理：10 月 26 日，2012〕
