遺伝子組換え植物における導入遺伝子発現用プロモーターに関する研究

遺伝子組換え植物における導入遺伝子発現用プロモ

ーターに関する研究

著者

瀬尾 直美

号

696

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16979

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年月 日

学位授与の要件

学 位 論 文 題 目

論藩

査委員

せ お なお み

瀬

尾

直

美

博

士(農

学)

農

第696号

平

成17年6,月9日

学 位 規 則 第4条

第2項

該 当

遺 伝 子 組 換 え植 物 に お け る導 入 遺 伝 子 発 現 用 プ ロモ ー

ター に関す る研究

(主

査)教

授

池

上

正

人

(副

査)教

授

西

尾

剛

教

授

山

谷

知

行

論

文

内

容

要

旨

緒 言 有 用 な 遺 伝 子 組 換 え 植 物 を作 出 す る た め に は,導 入 遺 伝 子 の 発 現 を 適 切 に コ ン トロ ー ル す る プ ロ モ ー タ ー の 開 発 が 必 要 不 可 欠 で あ る 。 植 物 の 形 質 転 換 用 に 開 発 さ れ た 代 表 的 な プ ロ モ ー タ ー と して_{,カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 由 来35SRNAプ ロ モ ー タ ー(P3∬)が あ げ ら} れ る 。P353は,構 成 的 で 強 力 な 発 現 を示 し,最 も広 く用 い ら れ て い る が,'目 的 や 導 入 す る植 物 の 種 類 に よ っ て は発 現 が 不 十 分 で あ る 場 合 が 知 ら れ て い る 。P3∬ を改 良 し,通 常 のP3∬ に 比 較 して 数 十 倍 の 発 現 量 を 示 す プ ロ モ ー タ ー が 作 出 さ れ て い る が,予 期 しな い ジ ー ンサ イ レ ン シ ン グ が 高 頻 度 に 起 こ る こ とが 知 ら れ て い る 。 ま た,植 物 の 形 質 転 換 を 行 う に 際 し て は,同 一 の ベ ク タ ー に 目 的 遺 伝 子 と選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 を 含 む 複 数 の 遺 伝 子 を 組 み 込 む こ とが 現 在 の と こ ろ 一 般 的 だ が,利 用 で き る プ ロ モ ー タ ー が 限 ら れ る た め_{,P353が 繰 り返 し使 用 さ れ る 場 合 が 多 い 。 しか し な が ら,同 一 核 内 に 相 同} 性 を 持 つ プ ロ モ ー タ ー 配 列 が 反 復 して 存 在 す る と,転 写 抑 制 型 ジ ー ンサ イ レ ン シ ン グ(TGS) が 起 こ る 可 能 性 が あ る 。し た が っ て,複 数 の 遺 伝 子 を導 入 して 安 定 的 に発 現 さ せ る た め に は, そ れ ぞ れ 異 な る配 列 の プ ロ モ ー タ ー を 使 用 す る こ とが 必 要 と考 え ら れ る 。 しか し な が ら,植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー と して,特 許 に拘 束 さ れ ず 使 用 で き る もの は 限 ら れ て お り,P353に 匹 敵 す る 実 用 的 な プ ロ モ ー タ ー の 開 発 が 求 め られ て い る 。 本 研 究 に お い て は,P353改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー に よ る 導 入 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 に つ い て 解 析 を行 っ た 。 ま た,P355と 代 替 可 能 な 植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー の 開 発 を 目 的 と し,候 補 と な る プ ロ モ ー タ ー に つ い て 発 現 特 性 を 解 析 ・評 価 し た σ

1.高

発 現 プ ロモ ー タ ー に よ る導 入 遺伝 子 の発 現

1.ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 高 発 現 さ せ た タ バ コ に お け る 転 写 後 型 ジ ー ン サ イ レ ン シ ン グ の 解 析 一 P3∬ 改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ーρE12、0を用 い て ホ タ ル 由 来 ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 高 発 現 させ た タ バ コ で は,高 頻 度 で 転 写 後 抑 制 型 ジ ー ンサ イ レ ン シ ン グ(PTGS)が 起 こ る(第1 図)。 こ の 系 で は,暗 所 で ル シ フ ェ ラ ー ゼ の 発 光 を検 出 す る こ と に よ り,非 破 壊 的 に 継 続 し て PTGSの 様 相 を 観 察 で き る 。

A

B

第1図 導 入 した ホ タル 由 来 ル シ フ ェ ラー ゼ 遺 伝 子 の不 活性 化 A:高 発 現 個 体,B:PTGS個 体

PTGS個 体 に お け る ル シ フ ェ ラ ー ゼ の 発 光 をCCDカ メ ラ に よ り詳 細 に 観 察 し た と こ ろ(第 2図),茎 頂 お よ び 発 達 中 の 花 芽 な どの 分 裂 組 織 に お い て 発 光 が 検 出 さ れ た 。 花 器 官 の 中 で も 細 胞 分 裂 が 終 了 した と み ら れ る 組 織 で はPTGSが 起 こ る が,種 子 は 発 生 の 最 終 段 階 ま で,発 光 が 確 認 さ れ た 。PTGS植 物 か ら得 ら れ た 種 子 を播 種 す る とす べ て の 芽 生 え で 強 い 発 光 が 検 出 さ れ た 。 次 に,PTGSを 起 こ し て い る 葉 の 切 片 を培 養 して そ の 切 り口 か ら カ ル ス を 誘 導 さ せ る と,新 生 カ ル ス に お い てPTGSを 起 こ して い な い もの と同 等 の 強 い 発 光 が 認 め ら れ,DNA 合 成 の 阻 害 剤 で あ る ア フ ィ デ ィ コ リ ン を 処 理 す る と,発 光 は 弱 くな っ た 。こ れ ら の 結 果 よ り, PTGSは 細 胞 分 裂 の 盛 ん な 細 胞 で は 解 除 さ れ る こ と,細 胞 分 裂 が 終 了 し た 細 胞 で は,植 物 の 他 の 部 分 か ら伝 え ら れ るPTGSシ グ ナ ル の た め,新 た にPTGSが 起 こ る と 考 え ら れ た 。 発 達 中 の 種 子 で は 活 発 な 細 胞 分 裂 の た め にPTGSが 阻 害 さ れ て お り,親 植 物 か らPTGSが 伝 え ら れ る 前 に物 理 的 に 隔 離 さ れ る た め,次 世 代 に はPTGSが 伝 え ら れ な い と考 え ら れ た 。 A 高発 現 個 体 未展開葉 茎頂分裂組織 `トへ ・,. 」   L'風「「 ¶疑 亨 一 を、-. 虫 鴇∴ ρi 舜 ゴ 弓 へ 一㌧ 匡一吃 一ユ .彰 `L一」 一'= {熱 一'. 可視光下 で観察 PTGS個 体 未展 開葉 茎頂 分裂組織

B

開花20日 前

眠

開花17日

鶯 、

暗 黒 下 で . CCDカ メ ラ

轟

盛

可視光 暗黒 下 可視光 暗黒下 開花6日 前 可視光 暗黒下 開花10日

C

D

可視光

野鯉 轡 聡

葉片 カ ル ス 可視光 暗黒下

野生型響

聡

塞1

一.+d 暗 黒 下 可視光 暗黒下 第2図 細 胞 増 殖 が活 発 な組 織 にお け るPTGSの 解 除 A茎 頂 の 切 片 にお け る ル シ フ ェ ラ ー ゼ遺 伝 子 の発 現.赤 矢 頭:茎 頂 分 裂 組 織,黄 矢 頭:未 展 開 葉,Bar=2mm BPTGS植 物 の 花 にお け る ル シ フ ェ ラ ーゼ 遺 伝 子 の発 現.青 矢 頭:茎,赤 矢 頭:半 切 され た 種 子,Bar=5mm CPTGS植 物 の 種 子 由 来 の 芽 生 え にお け るル シ フ ェ ラ ー ゼ遺 伝 子 の発 現 Dカ ル ス にお け る ル シ フ ェ ラー ゼ 遺 伝 子 の発 現

2.キ ク 形 質 転 換 体 の 作 出 と 導 入 遺 伝 子 の 発 現 1)3∬ 改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー(pE120,ρE7∫21)にG確 遺 伝 子 お よ び エ ンバ ク 由 来 抗 菌 性 タ ン パ ク 質 チ オ ニ ン 遺 伝 子 を 連 結 し,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り キ ク[Dθ 〃4rαη伽 〃2α 創oηd卯o剛 〃3(Ramat.)Kitamura](品 種 寒 精 雪',6倍 体)に 導 入 し た と こ ろ,形 質 転 換 体 が 42個 体 得 ら れ た 。 し か しな が ら,す べ て の 個 体 に お い て 導 入 遺 伝 子 の 発 現 は 認 め ら れ な か っ た 。G∼∬ 遺 伝 子 導 入 個 体 に 脱 メ チ ル 化 剤 で あ る5'・ ア ザ シ チ ジ ン を 処 理 す る と,G醐 遺 伝 子 の 発 現 が 一 部 で 回 復 す る こ と か ら,こ の 導 入 遺 伝 子 の 不 活 化 に は メ チ ル 化 が 関 与 して い る と 考 え ら れ た(第3図)。 ま た,pE120ど σ確 を 同様 の 方 法 に よ り野 生 種 で あ る キ ク タ ニ ギ ク [Dθη4Fα融 αηαδo泥α1θ(Makino)Ling](2倍 体)に 導 入 し た と こ ろ,形 質 転 換 体 が2個 体 得 ら れ た 。 こ れ ら形 質 転 換 体 に お い て は 恒 常 的 にGO8遺 伝 子 の 発 現 が 認 め ら れ た が,発 現 部 位 は 毛 状 突 起 お よ び 維 管 束 の 一 部 に 限 ら れ た(第4図)。 こ れ ら の 結 果 か ら,P353改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー は,キ ク に お い て 発 現 抑 制 が 起 きや す く,導 入 遺 伝 子 の 発 現 に は 適 して い な い と 考 え られ た 。 Aza-C

十

第3図5'一 ア ザ シ チ ジ ン を 処 理 し た ρE70ゐ'Gぴ ∫導 入 キ ク に お け る G鵬 伝 子 の 発 現(Bar-5㎜) A B

;轟 嬉

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覧、.

繁罫

騒,・ 第4図 ρ盈2ρ'」σ0写 導 入 キ ク タ ニ ギ ク に お け る (}U雪 遺 伝 子 の 発 現 A葉(Bar-10㎜) B茎 の 縦 断 切 片(Bar=200μm)

II.植 物 由 来 既 知 配列 の 有 用遺 伝 子 発 現 プ ロ モ ー ター と して の 利用

1.既 知 配 列 を 利 用 し た 有 用 プ ロ モ ー タ ー の 単 離 と発 現 解 析 既 に 遺 伝 子 の 解 析 を 目 的 と して 単 離 ・解 析 さ れ た 植 物 プ ロ モ ー タ ー の な か か ら,構 成 的 に 発 現 す る'プロ モ ー タ ー と して 有 用 遺 伝 子 の 導 入 に 利 用 可 能 と 考 え ら れ た ア ラ ビ ド プ シ ス 由 来 ト リ プ ト フ ァ ン合 成 酵 素 βサ ブ ユ ニ ッ ト(TSB1)お よ び ブ イ ト ク ロ ー ムB(PHYB)遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー を選 出 し,』実 用 性 が あ る か 評 価 し た 。PCRに よ っ て 増 幅 し た 各 プ ロ モ ー タ ー 領 域(P∬ 別,1.5kb; PP野 溜,2.1kb)お よ び 対 象 の ダ イ ズ 退 緑 斑 紋 ウ イ 6 5 4 3 2 1 0 (﹂ 召 、 ≧ ﹂ 悶 霞 こ O 言 唱 ⇔ 混 尋 ) 坦 些 go 箭 Q 」P∬BIPP石 「B凸vごRP353 対P355「 比0.720.44α46LOO 第5図 形 質転 換 カ ル ス に お け るGUS 活性 値(8試 料 の 平 均 値)

ル ス 由 来NCRプ ロ モ ー タ ー(Pソ>CR)にGO3 遺 伝 子 を連 結 し,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り タ バ コ に 導 入 し た 。 対 象 と し て,pBI121 (P353」'σσ∫を 含 む)を 同 時 に 導 入 し た 。 得 ら れ た 形 質 転 換 タバ コ に お け るGUS活 性 を調 査 し た と こ ろ,PZ∫81"Gα ∫,.PP別 倣'(兀 む, P1》CR」'σ確 は,カ ル ス で 各 々P35&'Gα ∫の0.72, 0.44,0.46倍.(第5図),葉 で2.4,1.5,0.67倍 の 活 性 を 示 し た(第6図)。P7認1!'σ 肥 お よ び ♪PHyB'」 σ肥 導 入 タバ コ の 自殖 次 世 代 植 物(播 種2か 月 後)を 用 い て 器 官 別 のGUS活 性 を 測 定 し た と こ ろ,葉 だ け で な く,花 弁 の 有 色 部,が く,葉 柄,根 に お い て も活 性 が 検 出 さ れ た 。 葉 位 別 のGUS活 性 は,、P∬BI」rσ㏄ 導 入 タ バ コ で は 上 位 葉 で 低 く,下 位 に な る ほ ど増 加 す る 傾 向 が み られ た が,㎜}B"σ α∫導 入 タ バ コ で は 葉 位 に よ る 活 性 の 差 は 判 然 と しな か っ た 。 成 熟 葉 の 横 断 切 片 を 組 織 化 学 的 にGUS活 性 染 色 した と こ ろ,P㎜1,PP別 沼,P353の 組 織 特 異 性 は や や 異 な っ て い た(第7図)。 さ ら に,PZ∫B1, PP別IB,P%α ∼,P355に 選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 2>PZπ を 連 結 し,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り タバ コ に 導 入 し た 後,カ ナ マ イ シ ンで 選 抜 す る と,4種 と も ほ ぼ 同 等 の 形 質 転 換 効 率 を 示 し た 。 しか し な が ら,P珊1'」G〔 凋 お よ びPP㎜ 」ノ(兀確 を イ ネ に 導 入 し て 発 現 を 調 査 す る と,GUS活 性. は検 出 限 界 以 下 で あ っ た 。 こ れ ら の 結 果 よ り, P∬ 別 お よ びPP別 四 は 双 子 葉 植 物 で あ る タ バ コ に お い て 構 成 的 に 発 現 す る プ ロ モ ー タ ー と し て 有 用 で あ る こ とが 示 さ れ た 。 三35 詫300 ぎ25 嚢 … 垂158

藍1・

△

誓 ・

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O P7壇β1 平 均 値8.8 対P3∬ 比2.4 植 物 数13 第6図 o o 8 曲8 O O Q O O PPHYBPNCRP35S 5.52.43.6 1.50.671.0 151315 形 質 転 換 タバ コ 葉 に お け るGUS 活 性 値 アれ ヨゐ ごりこな

◎ ξ

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PPHy333σ こ贋 τ ・ ・ 触 勘 濯援!.1端 ㌦ ∴

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汐 ・'乏

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第7図 形 質 転 換 タバ コ葉 ・中肋 にお け る 組 織 化 学 的GUS染 色Bar=250μm 2.ト リ プ トフ ァ ン 合 成 酵 素 β サ ブ ユ ニ ッ ト遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー を 用 い た カ ー ネ ー シ ョ ン に 対 す る抗 菌 性 タ ン パ ク 質 遺 伝 子 の 導 入 P∬B1に エ ンバ ク 由 来 の 抗 菌 性 タ ンパ ク 質 で あ る チ オ ニ ン遺 伝 子(、48吻1)を 連 結 して カ ー ネ ー シ ョ ン に 導 入 し_{,病 害 抵 抗 性 を 付 与 す る こ と を 試 み た 。 品 種`Scania∵Percian} Pink-Sim∵U.Conn.WhiteSim'の 多 芽 体 葉 片 を 用 い て,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り

P∬ β1紐3痂1を 導 入 した と こ ろ,形 質 転 換 体 が11個 体 得 ら れ た 。RNAゲ ル ブ ロ ッ ト解 析 を 行 っ た と こ ろ,調 査 した す べ て の 形 質 転 換 体 に お い て チ オ ニ ンRNAが 検 出 さ れ た 。 さ ら に 最 も チ オ ニ ンRNAの 発 現 量 が 多 か っ た 形 質 転 換 系 統(S3-ll-12)に つ い て,タ ンパ ク 質 ゲ ル ブ ロ ッ ト解 析 を 行 っ た と こ ろ,生 葉1g当 た り約2.5μgの チ オ ニ ン タ ンパ ク 質 が 検 出 さ れ た 。 形 質 転 換 体 に カ ー ネ ー シ ョ ン萎 凋 細 菌 病 菌(β 〃r肋o娩 ア1αcαワgρ妙1〃)を 接 種 し,抵 抗 性 の 程 度 を 調 査 し た 。 そ の 結 果,抵 抗 性 の 程 度 と チ オ ニ ンRNA発 現 量 に は 相 関 が 認 め られ た(第8 図)。 した が っ て,P∬81"浸3痂1の 導 入 に よ り,カ ー ネ ー シ ョ ン萎 凋 細 菌 病 抵 抗 性 が 付 与 さ れ る こ とが 示 さ れ た 。 A 病 徴 指 数1.00.50.0 A B 0 0 0 の 0 ﹂弓 轟∠ 0 1 0 轟 U O ∩∪ 0 埋 寝 摯 唄 帥 題 A 11 魯 爪 B

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」㌧ ◆ ◆ ◆ ◆ i

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▲1 ▼ ◆'◆ 1.0 0.8 os 接種40日 後の病 徴指数 第8図Bμ7肋0146ア'αoα り評op砂11'を接 種 したP7ε 別 紐 ∫砺1導 入 カ ー ネ ー シ ョ ン 接 種40日 後 の 病 徴 チ オニ ン転 写 量相 対 値 と撞 種40日 後 の病 徴 指 数 の相 関 1と して算 出,病 徴 指 数 は6ま た は7穂 の平 均 値 0.4 チ オ ニ ン転 写 量 相 対 値 はPE7Ω ゐ廊 禰1導 入 タバ コ系 統5の チ オ ニ ン転 写 量 を

Ill。植 物D閥Aウ

イル ス由 来 の 有 用 な プ ロモ ー タ ーの探 索

1.レ ン ゲ 萎 縮 ウ イ ル ス 由 来 プ ロ モ ー タ 「 の 単 離 と 発 現 解 析 レ ン ゲ 萎 縮 ウ イ ル ス(ル微vε 励4wσ ゲv励5, MDV)は,N卿ov醒 ぬ θ科1物 〃ovf陶5属 に 属 す る 植 物 ウ イ ル ス で,多 粒 子 性 の 環 状1本 鎖DNA ゲ ノ ム を 持 つ 。MDVの ゲ ノ ム と し て,大 き さ が 約1kbで 配 列 の 異 な る11種 類 の コ ン ポ ー ネ ン ト(C1∼C11)が 見 出 さ れ て い る 。 各 コ ン ポ ー ネ ン ト は 一単 一 のORF,Tκ[A配 列 お よ び ポ リAシ グ ナ ル 様 配 列 を 含 ん で お り,C4 (DNA-C)は 細 胞 周 期 関 連 タ ン パ ク 質(Clink), C8(DNA-M)は 移 行 タ ン パ ク 質(MP),C9 (DNA-S)は 外 被 タ ン パ ク 質(CP),Cl1 (DNA-R)は 複 製 関 連 タ ン パ ク 質(M-Rep), P醒C1(S-Rep)398bp Iレ ● PMC2(S-Rep)409by lfl 御 「 冒,,_、 。。p .薗 「 目TATA 躍 σ 陛p)404bp鵡 PMC10(S-Rep)417by 1/ PMα1(璽 響2bp .,,釣 「 PalindromicC レASF-1 レG-box lNTBBFl lDOF PMC4(Clink)470by PMCS(U1)532by PMC6(NSP)501by t PMC7{U2)567by 語 け 酬11● ・●卜1 n ●曇」 レ ●6聴■● ●●陰 ● ●i 露 レ レ 鉗●.●卜 「 9曾 レレ欄1● ・●『「 PMCB(MP)643by Iレ PMC9(CP)472by i 函 レ..1誕 「 9冒 レ。鮒川o・ 日[ 100by 第9図MDVに 由 来 す る11種 類 の コ ン ポ ー ネ ン ト に お け る 推 定 プ ロ モ ー タ ー 領 域

C1∼C3お よ びClOは 付 属 的 な 複 製 関 連 タ ン パ ク 質(S-Rep)を コ ー ドす る と考 え られ て い る 。 C5(DNA-Ul)お よ びC7(DNA-U2)が コ ー ドす る 遺 伝 子 の 機 能 は 不 明 で あ る 。 ウ イ ル ス 遺 伝 子 の 発 現 特 性 を 明 ら か に す る た め に,PCRで 増 幅 し た す べ て の コ ン ポ ー ネ ン トに お け る 推 定 プ ロ モ ー タ ー 領 域(Pル κ7∼Pル1(:71,第9図)に,各 々(兀 な 遺 伝 子 を連 結 し,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り タ バ コ に 導 入 し た 。 形 質 転 換 タバ コ に お け るGUS活 性 を 測 定 した と こ ろ,5種 の 匙 ρ 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー(P必C1∼Pル 幻3,PMC10,P必C〃)の 活 性 は,カ ル ス お よ び 葉 に お い て ご く低 レベ ル で あ っ た 。Pル1C4∼PMC9の 活 性 は,各 々 カ ル ス に お い てP3∬ の2∼10倍(第10図),葉 に お い て0.1∼1.3倍 で あ っ た(第ll図)。 組 織 化 学 的 にGUS活 性 染 色 を行 っ た と こ ろ,分 裂 組 織 お よ び ウ イ ル ス が 増 殖 す る 節 部 組 織 に お い て 強 いGUS活 性 が 確 認 さ れ た(第12図)。PMC8は 他 の プ ロ モ ー タ ー と は 異 な り,葉 肉 細 胞 お よ び 根 の 皮 層 細 胞 に お い て もGUS活 性 が 確 認 さ れ た 。 こ れ らの 結 果 よ り,MDV由 来 プ ロ モ ー タ ー の う ち Pル幻4∼P㏄9は 形 質 転 換 タ バ コ に お い て 強 い 活 性 を 示 し,導 入 遺 伝 子 発 現 用 プ ロ モ ー タ ー と し て 利 用 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 ( ﹄ ` 、 ︾ 監 ㎝ 目 一 、 一〇 目 幽 目 b 口 ≧ ー Ψ ) 坦 躯 旨 O 0 0 盈 ﹂ 4 T 30 20 10 0 プ ロ モ ー タ ーPMCIPMC2PMC3、 躍C4PルfC5PMC6P跡C7PMC8P赫C9」PMC10PMCl1P3∬ 対P35∫ 比'0.{}0.10.14.5103-2.9544.7220.10.11.0 第10図MDV由 来 プ ロ モ ー タ ー の 形 質 転 換 タ バ コ カ ル ス に お け る 発 現 ( ﹂ ` 、 匿 ◎￡ 唱 口 、 一 〇 嘗 目 コ 一 ≧ ー マ ) 恕 躯 。噴 ∋ O 25 20 is 10 プ ロ モ ー タ ー 植物数 対P3∬ 比 5 0 PMCIPMC2PMC3PMC4PMCSPMC6PMC7PMCSPMCgPMCIOPMCIIP35Sno 23232525252527222021232612 0.00.00.00.61.20.40.41.30.10.00.01.00.0 第11図MDV由 来 プ ロ モ ー ター の形 質転 換 タバ コ葉 に お け る発 現

第12図 形 質 転 換 タ バ コ の 組 織 化 学 的 染 色Bar=200μm APMご5"σ

灘

肥 導 入 タ バ コ 茎 頂 縦 断 切 片(100μm厚,染 色2時 間)

器

撒

P P P P P P B C D E F G ∵G確 導 入 タバ コ 茎 頂 縦 断 切 片(100μm厚,染 色18時 間) G肥 導 入 タ バ コ 成 熟 葉 中 肋 部 の 横 断 切 片(80μm厚,染 色2時 間) Gσ ∫導 入 タ バ コ 成 熟 葉 の 横 断 切 片(80μm厚,染 色2時 間) Gσ ∫導 入 タ バ コ の 根(80μm厚,染 色2時 間) Gσ ∫導 入 タ バ コ 成 熟 葉 の 横 断 切 片(80μm厚,染 色2時 間) σα∫導 入 タ バ コ の 根(80μm厚,染 色2時 間) 2.レ ン ゲ 萎 縮 ウ イ ル ス 由 来 プ ロ モ ー タ ー 朋 の 特 性 解 析 MDV由 来 プ ロ モ ー タ ー の う ち,最 も構 成 的 に 近 い 発 現 特 性 を示 し,か つ 活 性 が 強 か っ た PMC8に つ い て,導 入 遺 伝 子 発 現 用 プ ロ モ ー タ ー と し て の 特 性 を 詳 細 に 解 析 し た 。P ル幻&'GO3導 入 タバ コ の 自殖 次 世 代 植 物(播 種2か 月 後)を 用 い て 器 官 別 のGUS活 性 を 測 定 し た と こ ろ,葉 だ け で な く,花 弁 の 有 色 部,が く,茎,根 に お い て も強 い 活 性 が 確 認 さ れ た 。 葉 位 別 で は,上 位 展 開 葉 のGUS活 性 が 最 も 高 か っ た 。 ま た,P財C8に 選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 2>Pτπ を 連 結 し,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り タ バ コ を形 質 転 換 し,カ ナ マ イ シ ン に よ る 選 抜 を 行 っ た と こ ろ,P358!洲Pπ1と 同 等 以 上 の 形 質 転 換 効 率(第1表)を 示 し た 。 さ ら に P必C8'」G確 を イ ネ に 導 入 し,発 現 を調 査 し た と こ ろ,組 織 特 異 性 は や や 異 な る が,P3∬ と 同 等 の 活 性 を 示 した 。こ れ ら の 結 果 か ら,PルfC8はP3∬ と代 替 可 能 な導 入 遺 伝 子 発 現 用 プ ロ モ ー タ ー と して 遺 伝 子 組 換 え 植 物 作 出 に 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。 第1表 ア グ ロバ クテ リ ウム 感 染60日 後 の形 質転 換 効 率 実験Km濃 度 感 染Km耐 性 選 抜 マ ー カ ー 切 片 数 個 体 数 遺 伝 子 (A)(B) 形 質 転換 個 体 数C/BC/A (C) 1 100mg/1 P耀8 P35S: 200mg/1 Pル 幻8 P35S: z 100mg/1 P献78 P35S: 200mg/1 Pル 幻8 P35S: 計 P耀8 P35S: :NPTII36 1>Pτ万36 0 4 . 4 2 0 ノ 雪 ﹂ 2 1 7308置0 540360 '用P7万36 泥Pτπ36 凸∠ 0 / 2 J l O f J つ ﹂ -940083 790042 '1VPZ召36 ハ1P7万36 2 ﹂ 3 3 角 ∠ 4 . -帰 乙 - 720670. 480031 ・泥P7π36 NPTII36 4 5 2 1 り ∠ つ ﹂ つ 乙 1 9200.61 870036 〃PZび144 ノ>P7π144 9 1 2 8 05 52 8100.73 640036

lV.ま と め 本 研 究 で は,導 入 遺 伝 子 発 現 用 プ ロ モ ー タ ー の 特 性 調 査 お よ び 開 発 を 目 的 と し,P353改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー の 形 質 転 換 植 物 に お け る 発 現 抑 制 の 解 析 お よ びP353と 代 替 可 能 と考 え ら れ る プ ロ モ ー タ ー に つ い て 発 現 特 性 の 解 析 ・評 価 を行 っ た 。 そ の 結 果,1)P353改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー に よ る ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 のPTGSは,細 胞 増 殖 に よ っ て 解 除 さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ,2)P353改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー は,キ ク に お い て メ チ ル 化 を 一 因 と す る 発 現 抑 制 を受 け や す く,キ ク の 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー と して は 適 して い な い と考 え られ た 。 ま た,3)ア ラ ビ ドプ シ ス 由 来 ア㎜1お よ びPPHBは,双 子 葉 植 物 で あ る タ バ コ に お い て 構 成 的 に 発 現 す る プ ロ モ ー タ ー と して 有 用 で あ る こ と を示 し た 。 さ ら に24)MDV由 来 の ll種 類 の プ ロ モ ー ター に つ い て 形 質 転 換 タバ コ に お け る 発 現 特 性 を 明 ら か に し,5)こ の う ちP㎜8に つ い て さ ら に 詳 細 な発 現 特 性 を 調 査 し,タ バ コ だ け で な く イ ネ で も発 現 す るP353 と代 替 可 能 な 植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー と して 有 用 で あ る こ と を 示 した 。

ま とめ

1.燃9を

改 変 した高 発 現 プロモー ターの特 性 解 析

國

予期しな噂 入遺伝子の発現抑制

回

催

㈱

導入タバコにおけるPTGSの解析

分 裂 細 胞 で は発 現

(

次世代 には親植物 のPTGSが

移行 しない

懇 灘灘灘 難 講鍵魏 灘 鰹

・

キク お倍体)形 質 転換体 の作 出→導入遺伝子 の発現抑 制

メチル化が関与

(

野生 ギク ￡倍体)形 質転換体 →一部の組 織 でのみ発 現

難灘藪

2鰯3に

匹敵 す るプロモー ターの 開発

利用 できる導入遺伝子発現用 プロモーターが数少 ない 』

緻9を

同一ベクター内 に反復 して使 用 → 導入遺伝 子の発現抑制

植物由来既知配列を利用

蹴訓 伽

雪由来プロモーターの特性解析

国(

形質転換タバコ ≒欄

形質転換イネ

×

国1鑛

難 難磁 鑛 蕪 購1襯 輔

・Pπ3Bた海 醐1導

入 カーネ ー ション→ 萎 凋 細 菌 病 抵 抗 性 付 与

植 物DNAウ イルス由来 プロモーターの利用

MDV由

来 プロモー ター て1種)の特 性 解 析

 

灘 灘

儂 霧 濃 レ

驚欝

響 野 し'

最も構成的な発現に近かった形質転換

タバコ ≧鰯

回(

一

形質転換イネ ≒螂

導 入遺伝 子発現用 プロモーター選択の幅 を拡大

論 文 審 査 結 果 要 旨

有 用 な 遺 伝 子 組 換 え 植 物 を 作 出 す る た め に は,導 入 遺 伝 子 の 発 現 を 適 切 に 制 御 す る プ ロ モ ー タ ー の 開 発 が 必 要 不 可 欠 で あ る 。 代 表 的 な 植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー と し て は,カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 由 来35SRNAプ ロ モ ー タ ー(・P3∬)が 広 く用 い られ て お り,ま たP3∬ を さ ら に 改 変 し,高 発 現 を 可 能 に した プ ロモ ー タ ー が 開 発 さ れ て い る 。 しか し な が ら,こ れ ら の プ ロ モ ー タ ー を 用 い て 作 出 され た 遺 伝 子 組 換 え 植 物 に お い て は 予 期 し な い ジ ー ン サ イ レ ン シ ン グ が 起 こ る こ と が あ る 。 そ こ で, 本 研 究 で は,P35∫ 改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー の 特 性 解 析 を行 う と と も に,P35∫ と代 替 可 能 な プ ロ モ ー タ ー の 開 発 を 目 的 と し て,候 補 と な る プ ロ モ ー タ ー に つ い て 発 現 特 性 を 解 析 した 。 P35∫ 改 変 高 発 現 プ ロ モ ー タ ー に 連 結 した ホ タ ル 由 来 ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 し た タ バ コ に お い て は,高 頻 度 に 転 写 後 型 ジ ー ン サ イ レ ン シ ン グ(prGS)が 起 き,そ の 様 相 を 詳 細 に 解 析 し た と こ ろ, PTGSは 細 胞 分 裂 に よ り解 除 され る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま たP3∬ 改 変 高 発 現 プ ロ・モ ー タ ー は,キ ク に お い て メ チ ル 化 を 一 因 とす る 発 現 抑 制 を 受 け や す く,キ ク の 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー と し て は 適 して い な い と 考 え られ た 。 予 期 しな い 導 入 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 を 回 避 す る た め の 手 段 の 一 つ と し て,同 一 の ベ ク タ ー 内 に お い て, 配 列 に 相 同 性 の あ る プ ロ モ ー タ ー を反 復 して 使 用 し な い こ と が 望 ま し い 。 し か し な が ら,利 用 可 能 な プ ロ モ ー タ ー が 限 られ て い る た め,P35∫ と代 替 可 能 で あ る 新 た な プ ロ モ ー タ ー を 得 る必 要 が あ る 。 そ こ で,既 に 遺 伝 子 の 解 析 を 目的 と して 単 離 ・解 析 され た 植 物 プ ロ モ ー タ ー の な か か ら,候 補 と し て ア ラ ビ ドプ シ ス 由 来 の ト リ プ トフ ァ ン 合 成 酵 素 β サ ブ ユ ニ ッ ト遺 伝 子 の プ ロモ ー タ ー(PTSB1)お よ び フ ィ ト ク ロ ー ムB遺 伝 子 の プ ロモ ー タ ー(PPHYB)を 選 出 し,タ バ コ お よ び イ ネ に お け る 発 現 特 性 を 解 析 し て 実 用 性 を 評 価 し た 。 そ の 結 果,こ れ ら2種 類 の プ ロ モ ー タ ー は タ バ コ に お い てP35∫ に 匹 敵 す る発 現 を 示 し,植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ.一 と して 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。 さ ら に,P∬ 別 に エ ンバ ク 由来 チ オ ニ ン 遺 伝 子 を 連 結 し,カ ー ネ ー シ ョ ン に 導 入 し た と こ ろ,得 られ た 形 質 転 換 体 に お い て カ ー ネ ー シ ョ ン萎 凋 細 菌 病 抵 抗 性 が 付 与 され た 。 ま た,1本 鎖DNAウ イ ル ス で あ る レ ン ゲ 萎 縮 ウ イ ル ス 由 来 の プ ロ モ ー タ ーll種 類(PMC1∼ Pル1C11)に つ い て,タ バ コ に お け る 発 現 特 性 を 解 析 し た と こ ろ,、P醒04∼ 以fC9は,葉 で はP3∬ の0.1 ∼L3倍 _{,カ ル ス で はP35∫ の2∼10倍 の 発 現 量 を 示 し た 。 こ れ ら の うち,最 も 構 成 的 に 近 い 発 現 を} 示 し たPMC8の 発 現 特 性 を さ ら に 詳 細 に 解 析 し,実 用 性 を 評 価 し た と こ ろ,PMC8は タ バ コ だ け で な くイ ネ で も 発 現 す るP35∫ と代 替 可 能 な 植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー と して 有 用 で あ る こ と が 示 され た 。 本 研 究 は,遺 伝 子 組 換 え植 物 に お け る 導 入 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 機 構 の 一 端 を 解 明 し,ま た,こ れ ま で 未 知 で あ っ た レ ン ゲ 萎 縮 ウ イ ル ス 由 来 プ ロ モ ー タ ー の 発 現 様 式 を 明 ら か に す る と と も に,新 た にP353 に 匹 敵 す る 有 用 な 植 物 形 質 転 換 用 プ ロ モ ー タ ー を 開 発 し た 。 以 上 の こ と か ら,本 論 文 は 博 士(農 学)の 論 文 に 値 す る も の で あ り,審 査 員 一 同 は,本 論 文 提 出 者 が 博 士(農 学)の 学 位 を 授 与 す る に 値 す る も の と 認 定 し た 。