金属イオンと薬物間の錯体形成を検出するためのハイスループットスクリーニング法の開発

溶 媒 系 に あ ら か じ め 任 意 の 金 属 イ オ ン を 添 加 し て HSCCC を 行 っ た と こ ろ ，Fe2+_，Co2+_， Ni2+_，Cu2+_{の 各 イ オ ン 添 加 時 に 親 水 的 な BMP−金 属 錯 イ オ ン が 移 動 相 中 で 形 成 さ れ て 素} 早 く 溶 出 し た （1-B (d~g)）． す な わ ち ， BMP は こ れ ら の 金 属 イ オ ン と 選 択 的 に 錯 体 形 成 す る と 判 定 で き た ． 同 様 な 手 法 で ，BMP 以 外 の 4 種 類 の 薬 物 と 7 種 類 の 金 属 イ オ ン 間 の 錯 体 形 成 の ス ク リ ー ニ ン グ を 実 施 し ， こ れ ま で 報 告 例 の な い 金 属 錯 体 の 事 例 を 複 数 見 出 し た ．さ ら に ，Cu2+_{含 有 二 相 溶 媒 系 を 用 い る HSCCC に よ り（ Cu}2+_{と の 選 択 的} な 錯 形 成 に 基 づ く ） 血 中 BMP 濃 度 の 迅 速 定 量 法 も 開 発 し た ． 第 二 章 固 相 抽 出 媒 体 を 用 い る 薬 物 も し く は 関 連 化 合 物 の 金 属 錯 体 形 成 検 出 の た め の ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 検 討 第 一 章 の 手 法 よ り も ス ク リ ー ニ ン グ の 効 率 を 飛 躍 的 に 向 上 さ せ る 目 的 で ，SPE 媒 体 と HPLC 分 析 を 組 合 せ た 手 法 を 新 た に 検 討 し た ． 任 意 の 金 属 イ オ ン を キ レ ー ト 保 持 さ せ る SPE 媒 体 （ 遠 心 用 ス ピ ン カ ー ト リ ッ ジ ） と し て ， イ ミ ノ 二 酢 酸 基 が 修 飾 さ れ た MonoSpin ME と ニ ト リ ロ 三 酢 酸 基 が 修 飾 さ れ た MonoSpin NTA を 使 用 し た ． 両 カ ー ト リ ッ ジ の 金 属 キ レ ー ト 特 性 を 把 握 し た 後 ， リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 （PBS） を 用 い た 擬 似 生 理 的 条 件 下 で の 金 属 イ オ ン と 薬 物 間 の 錯 体 形 成 検 出 手 順 を 最 適 化 し た ． 具 体 的 に は ，NTA カ ー ト リ ッ ジ に 任 意 の 金 属 イ オ ン を キ レ ー ト さ せ た 後 ， CH3CN 含 有 PBS 溶 液（pH 7.4）で 希 釈 し た 被 験 薬 物 溶 液 を 通 液 し た（ Fig. 2-A）．次 に ，通 液 前 後 の 溶 液 中 薬 物 含 量 を HPLC 定 量 し （ Fig. 2-B, 通 液 前 : (a), 通 液 後 : (b)~(m)）， 各 金 属 （ キ レ ー ト

Fig. 1 A: The HSCCC apparatus and the two-phase solvent system of the present method. B:

NTA カ ー ト リ ッ ジ ） へ の 吸 着 率 （ %） を 算 出 し た （ Fig. 2-C）． 同 図 に 示 し た よ う に ， BMP を 被 験 薬 物 と し て ス ク リ ー ニ ン グ し た 結 果 ， Co2+_{, Ni}2+_{, Cu}2+_{に 対 す る 選 択 的 な 錯} 体 形 成 が 検 出 で き た ． 続 け て ，BMP 以 外 の 54 種 類 の 薬 物 と 11 種 類 の 金 属 イ オ ン 間 の 錯 体 形 成 の 網 羅 的 な ス ク リ ー ニ ン グ を 実 施 し た ． ま た ，ME カ ー ト リ ッ ジ を 用 い る 生 理 的 pH 条 件 下（ 1 mM HEPES 緩 衝 液 ，pH 7.4）で の 実 験 系 を 構 築 し ，生 体 ア ミ ノ 酸 （20 種 類 ）及 び ペ プ チ ド（ 5 種 類 ）と 12 種 類 の 金 属 イ オ ン 間 の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た ．さ ら に ，ME カ ー ト リ ッ ジ で の 24 種 類 の ポ リ フ ェ ノ ー ル 化 合 物 と 12 種 類 の 金 属 イ オ ン 間 の ス ク リ ー ニ ン グ も 試 み た ．各 手 法 の SPE 条 件 と 結 果 の 一 部 を Fig. 3 に 示 し た ．

Fig. 3 Comparison of the a d s o r p t i o n c a p a c i t y ( % ) o f v a r i o u s k i n d s o f c o m p o u n d s t o

each of twelve different metal ions chelated onto a MonoSpin NTA or ME cartridge.

Fig. 2 A: Schematic showing a s c r e e n i n g m e t h o d f o r c o m p l e x f o r m a t i o n w i t h a m e t a l

i o n o n a M o n o S p i n N T A c a r t r i d g e . B: HPLC stacked chromatograms of BMP in eluates after passing a BMP test solution through a metal ion chelated NTA cartridge. C: Comparison of the a d s o r p t i o n c a p a c i t y ( % ) o f B M P t o each of eleven different metal ions chelated onto the NTA cartridge.

7 13 13 12 12 14 12 13 92 39 96 18 13 12 18 11 15 11 36 50 42 94 90 38 13 20 20 20 42 20 21 21 35 22 32 21 17 15 30 18 23 22 23 66 39 40 67 31 81 16 12 14 17 11 7 23 32 12 10 64 12 9 8 7 7 6 7 7 11 19 9 13 37 12 28 5 21 73 23 23 59 69 99 95 98 93 89 98 6 0 1 4 3 1 7 70 2 1 4 4 0 8 13 20 16 16 17 54 94 15 12 30 20 26 3 11 30 15 29 20 53 83 17 18 33 26 24

*Each solution contains CH3CN in arbitary proportion.

Fe2+ _Fe3+ Mg2+ _Co2+ Quercetin Catechin Tyr-Tyr-Tyr Cys Caffeic acid LTG Trp Tyr Solution* Cartridge SPE condition Drugs NTA _{(pH 7.4)}PBS Category ME 1 mM HEPES (pH 7.4) Amino acids & peptides ME H2O Polyphenols Mo5+ Adsorption capacity (%) Compound Name _metalno Zn2+ BMP LVX Al3+ _Ca2+ _Cr3+ _Mn2+ _Ni2+ _Cu2+ .. . .. . .. . 0 20 40 60 80 100 % A dso rp tio n Ni 2+ Cu2+ Zn 2+ bar e N TA Mg 2+ Al 3+ Ca₂₊ Cr3+ Mn 2+ Fe 2+ Fe 3+ Co 2+ N H N Br N O BMP

C

A

Retention time / min

free-BMP

B

第 三 章 銅 イ オ ン 選 択 性 電 極 を 用 い る 簡 便 迅 速 な 銅 −薬 物 錯 体 形 成 検 出 法 の 検 討 第 二 章 の ス ク リ ー ニ ン グ の 結 果 ，Cu2+_{と 錯 体 形 成 す る 薬 物 が 多 数 見 出 さ れ た ． そ こ} で さ ら に ，Cu2+_{と の 錯 体 形 成 の み を 選 択 的 か つ 迅 速 に 検 出 す る 新 規 な ス ク リ ー ニ ン グ} 法 に つ い て 検 討 し た ．具 体 的 に は ，生 理 的 pH 条 件 下（ 10 mM HEPES 緩 衝 液 ，pH 7.4） に お け る（ 固 定 化 さ れ て い な い ）遊 離 状 態 の Cu2+_{と 薬 物 間 の 錯 体 形 成 の 有 無 に つ い て ，} 銅 イ オ ン 選 択 性 電 極 を 用 い て（ 錯 体 形 成 に 伴 う 遊 離 Cu2+_{減 少 に 基 づ く ）電 位 変 化 量（ 電} 位 減 少 率 ） を 計 測 し た ． 計 測 に 際 し て は ， 市 販 の 銅 イ オ ン 選 択 性 電 極 を 活 用 し て 少 量 の 試 料 液（500 μl）の 電 位 計 測 が 可 能 な 装 置 を 自 作 し（ Fig. 4），測 定 条 件 を 最 適 化 し た ． 本 装 置 に よ り ，44 種 類 の 薬 物 に 対 す る 銅 イ オ ン と の 錯 体 形 成 の 有 無 の ス ク リ ー ニ ン グ を 実 施 し た 結 果 ，19 種 類 に お い て 顕 著 な 電 位 の 減 少 （ 減 少 率 50 %以 上 ） を 確 認 で き た （Fig. 5）． 本 法 は 極 め て 迅 速 か つ 簡 便 な 手 法 で あ り ， 薬 物 以 外 の 生 体 成 分 に も 適 用 で き る ． ま た ， 電 極 の 種 類 を 変 更 す る こ と で ， 他 の 金 属 イ オ ン （Ca2+_{や Cd}2+_{な ど ）} と の 選 択 的 な 錯 体 形 成 の 検 出 も 可 能 と 考 え ら れ る ．

Fig. 5 Comparison of % decrease in EMF of 44 different drugs under the present ISE method. Fig.4 A: The ISE apparatus using a copper-ion selective electrode of the present method. B: Schematic showing a basic concept of the present method for selective detection of the

complexation formation between Cu2 + _{and a test drug.}

0% 50% 100% DA P TE IC VA N BA C LZ D AM_K GE_N AM_P PIP CF_Z CF_T CR_O LV_X ME_M TE_T VC_Z CZ_P ES_X PH_Y PR_M PH_B ZN_S NT_Z LE_V LTG DIS_O FLE LDC MX T PC A PP F ST L QU IN IM T MX_T DO_X THE_O AM P BM P DZ P AM P AX PN PS L PH T % d ecre ase in EMF Cu2+ Cu2+ Drug Cu2+ Cu2+ Cu2+ _Cu2+ Cu2+ _Drug Cu2+ _Drug Copper-ion Selective Electrode

Drug conc. (mol/l)

総 括 金 属 イ オ ン と 薬 物 間 の 錯 体 形 成 の 有 無 を 迅 速 に 検 出 す る た め の ス ク リ ー ニ ン グ 法 に つ い て ， 複 数 の 新 規 手 法 を 開 発 し た ． さ ら に ， こ れ ら の 手 法 を 用 い て ， 擬 似 生 理 的 pH 条 件 下 に お け る 金 属 イ オ ン と 薬 物（ ま た は 生 体 成 分 ）間 の 錯 体 形 成 に 関 す る 網 羅 的 な ス ク リ ー ニ ン グ を 実 施 し ，こ れ ま で に 未 報 告 の 様 々 な 錯 体 形 成 の 組 合 せ を 発 見 し た ． 構 築 し た 手 法 は 金 属 錯 体 の さ ら な る 研 究 促 進 ツ ー ル と し て 有 用 で あ り ， 発 見 し た 錯 体 形 成 の 組 合 せ は 創 薬 ・ 薬 理 ・ 臨 床 薬 学 等 の 分 野 で の 有 益 な 情 報 と し て 価 値 が 高 い ． 【 研 究 成 果 の 掲 載 誌 】

論文審査の結果の要旨 日本薬局方医薬品の中には，金属イオンに親和性の高い多座配位子構造を有するものが多数あ る．また，金属イオンとの錯体形成反応に伴い，薬物の吸収挙動や薬効の変化や，予期せぬ副作 用や配合変化が生じた事例などの報告もある．しかしながら，金属イオンと薬物の膨大な組合せ に対して，両者間の金属錯体形成の有無を網羅的に検出できる分析法はいまだに確立されていな い．また，薬物の金属錯体形成は生理的 pH やイオン強度条件下での観測が望ましいが，既存の 分光機器分析手法は測定条件の制約が大きく，生理的条件下での相互作用の報告事例は非常に少 ない．そこで申請者は，金属イオンと薬物間の錯体形成を網羅的かつ迅速に検出するためのハイ スループットスクリーニング法の開発を試みた．学位論文は全三章で構成されており．第一章で は，二相溶媒系中での金属錯体形成に伴う薬物の分配挙動の変化を高速向流クロマトグラフィー （HSCCC）で検出するシステム検討について，第二章では，任意の金属イオンをキレートさせた 固相抽出（SPE）媒体に生理的 pH 条件下で薬物を通液し HPLC で検出するシステム検討につい て，第三章では，銅イオンと薬物の錯体形成をイオン選択性電極（ISE）で選択的に検出するシ ステム検討について，それぞれ記述されており，各章での主な研究成果は以下のとおりである． ＜ 第 一 章 ＞ ベ ン ゾ ジ ア ゼ ピ ン 系 抗 不 安 薬 の ブ ロ マ ゼ パ ム （BMP ） に 対 し て ，

t-butylmethylether – CH3CN – H2O（2:2:3, v/v/v）の二相溶媒系の上相（UP）を固定相とする

逆相分配モードでのHSCCC を行った．その結果，疎水的な BMP は移動相が下相（LP）では溶

出しなかったが，一方で，あらかじめ二相溶媒系に任意の金属イオンを添加してからHSCCC を

行ったところ，Fe2+_，Co2+_，Ni2+_，Cu2+_{の各イオン添加時に親水的な BMP−金属錯イオンが移動}