Microsoft PowerPoint - shigakenniokeru_bioassay.ppt

(1)

滋賀県

における

_における

バイオアッセイ手法の動向

滋賀県琵琶湖・環境科学研究センター環境生物環境生物環境生物環境生物担当担当担当担当一瀬一瀬一瀬一瀬諭諭諭諭

(2)

～バイオアッセイとは～

生物検定法、生物学的毒性試験

人間または生態系の安全性を評価するための

一つの生物試験方法である。

有害な化学物質の存在を検出するために、

化学試薬→生物材料（例：ﾐｼﾞﾝｺ､ﾒﾀﾞｶ）

化学反応→生物応答（例：遊泳阻害､繁殖阻害）

物質量→生物作用量（例：50％阻害の濃度）

(3)

日本における標準的バイオアッセイ

藻類生長阻害試験、ミジンコ遊泳阻害試験、魚類による急性毒試験生態影響試験法ガイドライン（1992）ミジンコ遊泳阻害試験、魚類による急性毒試験 JIS 生物毒性試験（魚類急性毒性試験、甲殻類遊泳阻害・繁殖試験、繊毛虫類増殖阻害試験、藻類増殖阻害試験、細菌増殖阻害試験、細菌発光阻害試験生物濃縮成試験変異原性試験（エームス試験、ウム試験、レックアッセイ） AGP試験（藻類生産力試験）生態系影響評価試験下水試験方法変異原性試験（エームス試験、ウム試験）、魚類による常時監視法、緊急時試験上水試験方法

(4)

有害な化学物質は、一般的に化学分析によって確認されるが、環境中の全ての化学物質について分析を行うことは困難である。化学物質は、濃度によって生物に対する毒性が異なり、化学分析で複合的な毒性について把握することは極めて困難である。有害な化学物質の存在をスクリーニング的に検定したり、また、生態系生物への安全性の確認をする手段としても有用である｡

生物

生物を

を

を用

用

用いた

いた化学物質

いた

化学物質

化学物質の

の

の試験

試験

生物

生物を

を

を用

を

用

用いた

用

いた化学物質

いた

化学物質

化学物質の

化学物質

の

の試験

の

試験

(5)

物理化学的分析とバイオアッセイの

比較

（楠井先生）

バイオアッセイ

物理化学的分析

原理

生物学的特性

個別物質の分離定量

VS

物理化学的特性

総括的影響評価

個別物質規制

_VS

毒性による規制

_{毒性による規制}

混合物

未規制物質

熟練度

費用

原因物質同定

対応可能

対応困難

小-大

中

対応可能

中

小-大

-

容易-？

測定手法管理手法

(6)

バイオアッセイの特徴

環境汚染

環境汚染について

について

について私達

私達

私達が

が知

が

知

知りたいことは

りたいことは

りたいことは、

、

、どのよう

どのよう

な

な物質

物質

物質を

を

を何

何ppm

何

ppm

ppm検出

検出

検出したかではなく

検出

したかではなく、

したかではなく

、

、そこに

そこに

そこに棲

棲

棲む

む

む生

む

生

物

物に

に

に影響

影響

影響があるのか

があるのか

があるのか、

、無

、

無

無い

い

いのか

のか

のか？

？

長所長所長所長所（理化学的分析方法に対して） (1)複合汚染な影響を評価できる。 (2)生物に対する直接の影響が測定できる。有害性が明確にできる (3)一般市民へのアピール効果がある。 (4)安価で簡易に早く測定できる項目もある。短所短所短所短所 (1)影響因子の同定が困難である。

(7)

バイオアッセイ

₍

生態影響試験

_{生態影響試験}

₎

の生物

_の生物

食物連鎖食物連鎖食物連鎖食物連鎖におけるにおけるにおけるにおける生産者生産者生産者生産者一次生産者一次生産者一次生産者一次生産者藻藻藻藻類類類類一次消費者一次消費者一次消費者一次消費者甲殻類甲殻類甲殻類甲殻類二次消費者二次消費者二次消費者二次消費者魚類魚類魚類魚類

(8)

急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性

急性毒性

すぐに現れる毒性：短期間暴露で発現する毒性

慢性毒性

長期にわたる反復投与または暴露によって発現

する毒性

遺伝毒性

遺伝情報の伝達をつかさどる遺伝子が損傷を受

けたため、変異した形質が子孫や娘細胞に伝え

られる毒性（発ガン性、催奇形性）

(9)

滋賀県

滋賀県で

で

でバイオアッセイ

で

バイオアッセイ

バイオアッセイ手法

バイオアッセイ

手法の

手法

の

の導入

導入

導入の

の

必要性

近畿1400万人の飲料水源に、各種排水が流入してくる。事業場に対する排水規制という形で対応がなされてきたが、全ての化学分析は不十分である。更に、環境ホルモン化学物質の流入やＰＲＴＲＰＲＴＲ法ＰＲＴＲＰＲＴＲ法法法導入による化学物質の低減化を計るためにも、新たな低減対策による安全な水の確保が必要である。工場工場工場工場・・・・事業場排水事業場排水事業場排水事業場排水・・・・河川水河川水河川水河川水工場工場工場工場・・・・事業場排水事業場排水事業場排水事業場排水・・・・河川水河川水河川水河川水他府県琵琶湖

海

滋賀県

海

(10)

藻類生長阻害試験

水系食物連鎖水系食物連鎖水系食物連鎖水系食物連鎖におけるにおけるにおけるにおける生産者生産者である生産者生産者であるであるである藻類藻類藻類藻類（（（（単細胞緑藻単細胞緑藻単細胞緑藻単細胞緑藻類類類類））を））をを対象を対象対象対象としとしとしとし、、、、化学物質化学物質に化学物質化学物質に７２にに７２７２７２時間暴露時間暴露時間暴露した時間暴露したした際した際際際のの藻類のの藻類藻類藻類のののの生長生長生長生長、、、、増殖増殖増殖増殖にに及にに及及及ぼすぼすぼすぼす影響影響影響（影響（（（生長生長生長生長阻害半数影響濃度阻害半数影響濃度阻害半数影響濃度

阻害半数影響濃度 EC50EC50EC50EC50 、、、、無影響濃度無影響濃度無影響濃度無影響濃度 NOECNOECNOECNOEC ））を））ををを求求求求めますめますめますめます。。。。

ミジンコ

ミジンコ急性遊泳阻害試験

急性遊泳阻害試験

水系食物連鎖における水系食物連鎖水系食物連鎖水系食物連鎖におけるにおける一次消費者における一次消費者一次消費者であ一次消費者であであであるるるるミジンコミジンコミジンコミジンコ（（（（甲殻類甲殻類甲殻類）甲殻類）））をを対象をを対象対象とし対象としとしとし、、、、化学物質化学物質化学物質化学物質にに４８にに４８４８４８時間暴露時間暴露時間暴露時間暴露したしたした際した際際際ののミジンコののミジンコミジンコミジンコののの遊泳の遊泳に遊泳遊泳にに及に及及及ぼすぼすぼす

ぼす影響影響影響（影響（（遊泳阻害半数影響濃度（遊泳阻害半数影響濃度遊泳阻害半数影響濃度遊泳阻害半数影響濃度EC50EC50、EC50EC50、、、NOECNOECNOECNOEC））））をを求をを求めます求求めますめますめます。。。。ミジンコミジンコ繁殖阻害試験ミジンコミジンコ繁殖阻害試験繁殖阻害試験繁殖阻害試験のののの予備予備予備予備試験試験試験試験のののの役割役割役割も役割も担もも担担います担いますいますいます。。。。

ミジンコ

ミジンコ繁殖阻害試験

ミジンコ

繁殖阻害試験

水系食物連鎖水系食物連鎖水系食物連鎖水系食物連鎖におけるにおける一次消費者におけるにおける一次消費者一次消費者である一次消費者であるであるであるミジンミジンミジンミジンココココ（（甲殻類（（甲殻類甲殻類）甲殻類）））ををを対象を対象対象対象としとし、としとし、、化学物質、化学物質化学物質化学物質にににに２１２１２１２１日間暴露日間暴露した日間暴露日間暴露したした際した際際際ののののミジンコミジンコミジンコのミジンコののの繁殖繁殖に繁殖繁殖ににに及及及ぼす及ぼすぼすぼす影響影響影響影響（（（

（繁殖阻害半数影響濃度繁殖阻害半数影響濃度EC50繁殖阻害半数影響濃度繁殖阻害半数影響濃度EC50EC50EC50、、、無影響濃度、無影響濃度無影響濃度無影響濃度NOECNOECNOECNOEC））を））ををを求求求求めますめますめますめます。。。。

魚類急性毒性試験

水系食物連鎖水系食物連鎖における水系食物連鎖水系食物連鎖におけるにおけるにおける高次消費者高次消費者である高次消費者高次消費者であるであるである魚類魚類魚類魚類（（（メダ（メダメダメダカカカカ））を））をを対象を対象対象とし対象としとしとし、、、、化学物質化学物質に化学物質化学物質ににに９６９６９６９６時間暴露時間暴露時間暴露時間暴露したしたした際した際の際際のの魚類の魚類魚類魚類にににに及及及及ぼすぼす影響ぼすぼす影響影響影響（（（（半数致死濃度半数致死濃度LC50半数致死濃度半数致死濃度LC50LC50、LC50、、、 NOEC NOEC NOEC NOEC））））をををを求求求求めますめますめます。めます。。。

魚類延長毒性試験

水系食物連鎖水系食物連鎖における水系食物連鎖水系食物連鎖におけるにおけるにおける高次消費者高次消費者である高次消費者高次消費者であるであるである魚類魚類魚類魚類（（（メダ（メダメダメダカカカカ）））を）をを対象を対象対象とし対象としとしとし、、化学物質、、化学物質化学物質化学物質ににに１４に１４１４日間暴露１４日間暴露日間暴露した日間暴露した際したした際際の際ののの魚類魚類魚類魚類へのへのへの影響への影響（影響影響（（半数致死濃度（半数致死濃度半数致死濃度LC50半数致死濃度LC50LC50LC50、、、、 NOEC NOEC NOEC NOEC））））をををを求求求求めますめますめます。めます。。。急性毒性急性毒性の急性毒性急性毒性ののの付加的付加的付加的な付加的な情報なな情報情報情報となりますとなりますとなりますとなります。。。。

バイオアッセイの種類

（１）

_（１）

(11)

バイオアッセイの種類

（２）

_（２）

齧歯類

齧歯類を

齧歯類

を

を用

用いた

用

いた

いた生物検定

いた

生物検定

マイクロトックス

マイクロトックス試験

試験

レックアッセイ

エームス

エームス(Ames)

(Ames)

(Ames)試験

試験

レポータージーンアッセイ

レポータージーンアッセイ法

法

変異原性試験

染色体異常試験

その

その他

他

(12)

バイオアッセイ用の毒性評価

半数致死濃度

LC

₅₀

（生存率が50%に低下する濃度)

半数影響濃度

EC

₅₀

(試験生物に影響が 50%低下する濃度）

最大無影響濃度

NOEC

(試験生物に影響を与えない最大の濃度)

最小影響濃度

LOEC

(試験生物に影響が最小の影響濃度)

(13)

琵琶湖産藻類用

琵琶湖産藻類用いた

いた

藻類生長阻害試験

水系食物連鎖における生産者

(14)

藻類生長阻害試験藻類生長阻害試験藻類生長阻害試験藻類生長阻害試験のののの方法方法方法方法とととと条件条件条件条件項　目項　目項　目項　目方法方法方法方法およびおよびおよび条件および条件条件条件　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生物種 Selenastrum capricornutum 開始時前培養後使用試験期間７２時間試験濃度と連数５濃度と対照区試験初期細胞濃度 _{S ． capricornutum １０}４cells/ml 試験方式止水式助剤使用有機溶剤(対照区：アセトン) 培　地規定の調整培地培養条件振とう培養　、攪拌温度２１～２５℃±１℃ 照明連続的均一照射　4000lux コールターカウンターで計数生長速度に基づいて算出する。測定５０％生長阻害濃度（EC₅₀）対照区の細胞濃度が３日以内で少なくとも１６倍に増加すること。成立条件

(15)

藻類の予備培養結果

（ＯＥＣＤの指定培地）種類培養株結果 ① Selenastrum capricornutum 標準株 ●→詳細試験 ② Closterium sp. CLO株 × ③ Staurastrum dorsidentiferum ST株 ●→詳細試験 ④ Pediastrum biwae PB株 ▲ ⑤ Chlorella vurgaris CHL株 ▲

⑥ Ankistrodesmus falcatus ANK株 ●→詳細試験

⑦ Picoplankton (緑藻) PLL株 ●→計数が困難(蛍光顕微鏡) ⑧ Anabaena spiroides AS株 ×

⑨ Anabaena flos-aquae AF株 ▲

⑩ Anabaena macrospora AM株 × ⑪ Synechococcus sp.(ﾋﾟﾝｸ株) PP株 ▲

⑫ Synechococcus sp.(小型) PGS株 ●→計数が困難(蛍光顕微鏡) ⑬ Microcystis wesenbergii MWE株 ×

⑭ Phormidium tenue (緑株) PTG株 × ⑮ Phormidium tenue (ﾌﾞﾗｳﾝ株) PTB株 ▲

⑯ Microcystis aeruginosa MAE株 × ⑰ Microcystis aeruginosa MK株 ×

(16)

藻類予備培養試験結果

OECD

OECDの

の

の試験用指定培地

試験用指定培地

試験用指定培地で

で

で10

10倍以上

10

10 倍以上

倍以上

倍以上の

の

の増加

の

増加が

増加

が

が認

が

認

められた

められた種類

種類

種類は

は

Selenastrum

Selenastrum capricornutum

capricornutum

capricornutum､､､､

capricornutum

Ankistrodesmus

Ankistrodesmus falcatus

falcatus

、

Staurastrum

dorsidentiferum

、

Synechococcus

sp.

、微小

、

微小

微小な

な

な球

球

形緑藻株

形緑藻株であった

であった

であった。

。

藍藻に

藍藻

に

に属

属

属する

属

する

する微小

微小

微小な

微小

な

Synechococcus

sp.

や

や微小

微小

な

な球形緑藻

球形緑藻

球形緑藻については

については

については、

、計数作業

、

計数作業

計数作業が

が

が蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡

下

下でないと

でないと困難

でないと

困難

困難であるため

であるため

であるため、

であるため

、

、緑藻

緑藻

緑藻の

の3

の

33 3種

種

種を

を

を用

用

用いて

いて

除草剤

除草剤を

を

を用

を

用

用いた

いた

いた生長阻害試験

生長阻害試験を

生長阻害試験

を

を実施

実施

実施した

した

した。

した

。

(17)

セレナスツルムの生長阻害

チオベンカルブチオベンカルブチオベンカルブ チオベンカルブEC₅₀ 23.64μｇ/Ｌ５０５０５０５０％％％％ 0.1 0.1 0.1 0.1 1111 10101010 100100100100 1000100010001000 10 10 10 10００００％％％％００００％％％％

(18)

アンキストロデスムスの生長阻害

チオベンカルブチオベンカルブチオベンカルブ チオベンカルブEC₅₀ 4.83μｇ/Ｌ５０５０５０５０％％％％ 0.1 0.1 0.1 0.1 1111 10101010 100100100100 1000100010001000 10 10 10 10００００％％％％００００％％％％ μｇ/Ｌ

(19)

スタウラスツルムの生長阻害

チオベンカルブチオベンカルブチオベンカルブ チオベンカルブEC₅₀ 108.3μｇ/Ｌ５０５０５０５０％％％％ 0.1 0.1 0.1 0.1 1111 10101010 100100100100 1000100010001000

(20)

藻類の生長阻害試験結果

(チオベンカルブ)

プロビット法 (単位：μg/Ｌ) 種類 72hEC_２０ 72hEC_５０ ①Selenastrum capricornutum 8.19 23.64 ②Ankistrodesmus falcatus 0.67 4.83 ③Staurastrum dorsidentiferum (47.20) (108.3) 大型種で増加が遅い

(21)

簡易

簡易な

な

なミジンコ

ミジンコ

簡易

簡易な

な

なミジンコ

な

ミジンコ

を

を用

を

を用

を

用いた

用

用いた

用

いた

急性遊泳阻害試験

水系食物連鎖

水系食物連鎖における

における

一次消費者

(22)

ミジンコの生活史

ミジンコは普通は、雌だけで卵を作って増え、幼生の個体差が少ないのが特徴です。卵は親の体内で幼生になり、動き出すようになると親の体外に放出されます。試験にはこの幼生を使用します。しかし、水温が下がったり、水質が悪化すると雄が出てきて受精を行ない耐久卵を作ります。耐久卵は鞘の中に１～２個入っていて、乾燥にも耐えることができます。そして、環境条件の良くなると幼生が発生して再び増えていきます。ミジンコ雌耐久卵

(23)

ミジンコミジンコミジンコミジンコ類急性遊泳阻害試験類急性遊泳阻害試験類急性遊泳阻害試験類急性遊泳阻害試験のののの方法方法方法と方法とと条件と条件条件条件項　目項　目項　目項　目方法方法方法方法およびおよびおよびおよび条件条件条件条件　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生物種 D aphnia m （オオミジンコ） a g n a 開始時生後２４時間以内の体幼試験期間２４時間、４８時間試験濃度５濃度と対照区試験生物数５頭４連×５濃度試験方式止水式助剤使用有機溶剤(対照区：アセトン) 希釈水天然水・規定の調整水生物密度１０ｍｌ以上／頭温度２０℃±１℃ 照明１６時間明／８時間暗幼体の生死（頭数）幼体の遊泳阻害（頭数）測定ｐＨ(換水前後) 溶存酸素死亡率結果の算出遊泳阻害率ＥＣ_５０遊泳阻害濃度ＮＯＥＣ無影響濃度２４２４２４２４ｈｈｈｈ４８４８４８４８ｈｈｈｈ４連５頭

(24)

Ｄａｐｈｎｉａの生活史

単為生殖単為生殖単為生殖単為生殖受精受精受精受精をををを必要必要必要としない必要としないとしないとしない良好良好良好良好なななな環境環境環境環境

(25)

遊泳阻害の基準

遊泳阻害の基準としてはミジンコが死亡、

あるいは触角は動かせても遊泳できない状

態のものを遊泳阻害とする。

(26)

生態影響試験

生態影響試験の

の

の計算

計算

環境毒性学会提供のソフトを使用

し本試験の結果からプロビット法で

EC

₅₀

（50％生長阻害濃度、遊泳阻

害濃度）を求める。

(27)

(28)

Daphnia magna

(ｵｵﾐｼ

ｵｵﾐｼ

ｵｵﾐｼﾞﾞﾞﾞﾝｺ

ﾝｺ

ﾝｺ))))

48h

滋賀県立大学教授安野正之氏より分譲 1.13μμμμｇｇｇｇ/ＬＬＬＬダイアジノンダイアジノンダイアジノン ダイアジノンEC₅₀ ５０％ 0.1 1 10 10０％０％ μ μ μ μｇｇｇｇ/ＬＬＬＬ

(29)

Daphnia galeata

(ｶﾌ

ｶﾌ

ｶﾌﾞﾞﾞﾞﾄﾐｼ

ｶﾌ

ﾄﾐｼ

ﾄﾐｼﾞﾞﾞﾞﾝｺ

ﾝｺ

ﾝｺ))))

48h

琵琶湖産カブトミジンコ 1.45μμμμｇｇｇｇ/ＬＬＬＬダイアジノンダイアジノンダイアジノン ダイアジノンEC₅₀ ５０％ 0.1 1 10 10０％０％ μ μ μ μｇｇｇｇ/ＬＬＬＬ

(30)

Daphnia obtusa

(ﾐｼ

ﾐｼ

ﾐｼﾞﾞﾞﾞﾝｺ

ﾐｼ

ﾝｺ

ﾝｺ))))

48h

琵琶湖産ミジンコ(D

．

pulex

群

) 4.06μμμμｇｇｇｇ/ＬＬＬＬダイアジノンダイアジノンダイアジノン ダイアジノンEC₅₀ ５０％ 0.1 1 10 10０％０％ μ μ μ μｇｇｇｇ/ＬＬＬＬ

(31)

Daphnia pulicaria

(プリカリア))))

48h

琵琶湖産ダフニアプリカリア 1.29 μμｇμμｇｇ/ＬｇＬＬＬダイアジノンダイアジノンダイアジノン ダイアジノンEC₅₀ ５０％ 0.1 1 10 10０％０％ μ μ μ μｇｇｇｇ/ＬＬＬＬ

(32)

Daphnia magna

(ｵｵﾐｼ

ｵｵﾐｼ

ｵｵﾐｼﾞﾞﾞﾞﾝｺ

ﾝｺ

ﾝｺｷｯﾄ

ｷｯﾄ

ｷｯﾄ))))

Daphotoxkit ベルギー産ｵｵﾐｼﾞﾝｺ遊泳阻害キット

48h

0.65μμμμｇｇｇｇ/ＬＬＬＬダイアジノンダイアジノンダイアジノン ダイアジノンEC₅₀ ５０％ 0.1 1 10 10０％０％ μ μ μ μｇｇｇｇ/ＬＬＬＬ

(33)

Simocephalus vetylus

(ｵｶﾒﾐｼ

ｵｶﾒﾐｼ

ｵｶﾒﾐｼﾞﾞﾞﾞﾝｺ

ｵｶﾒﾐｼ

ﾝｺ

ﾝｺ))))

48h

琵琶湖産オカメミジンコ

2.92 μ

μ

μｇ

ｇ

ｇ/Ｌ

Ｌ

ダイアジノンダイアジノンダイアジノン ダイアジノンEC₅₀ ５０％ 0.1 1 10 10０％０％ μ μ μ μｇｇｇｇ/ＬＬＬＬ

(34)

表1 ミジンコの急性遊泳阻害試験結果

(ダイアジノン：日本環境毒性学会提供ソフト使用) 2.48< 3.41< 1.01< 0.99< 0.50< 0.92< 95% Range 沿岸帯 <3.45 2.92 琵琶湖産 Simocephalus vetylus

⑥

沿岸帯 <4.84 4.06 琵琶湖産

Daphnia obtusa

⑤

小型種沖帯 <1.69 1.45 琵琶湖産

Daphnia galeata

④

大型種沖帯 <1.63 1.29 琵琶湖産

Daphnia pulicaria

③

DAPHTOX KIT <0.78 0.65 キット

Daphnia magna

②

OECD 標準種 <1.36 1.13 滋賀県県立大学

Daphnia magna

①

備考 μg/Ｌ 95% Range 48h EC₅₀

種

類

(35)

琵琶湖産

琵琶湖産ミジンコ

ミジンコ

ミジンコの

の

の検討結果

検討結果

琵琶湖産琵琶湖産琵琶湖産琵琶湖産ミジンコミジンコミジンコミジンコ類類類類のの急性遊泳阻害試験結果のの急性遊泳阻害試験結果急性遊泳阻害試験結果から急性遊泳阻害試験結果からから、から、、、標準種標準種標準種標準種ににに

に最最も最最も近もも近近近いい濃度いい濃度濃度で濃度ででで阻害阻害阻害阻害がが認がが認認められた認められためられためられた種類種類種類種類はははは、、、、

Daphnia

pulicaria

がががが有望有望であることが有望有望であることが明であることがであることが明明らかとなった明らかとなったらかとなった。らかとなった。。。市販の市販市販市販のののミジンコミジンコミジンコ急性遊泳阻害試験ミジンコ急性遊泳阻害試験急性遊泳阻害試験キット急性遊泳阻害試験キットキットをキットを用をを用用いた用いたいた結果いた結果結果、結果、、継代、継代継代継代しているしているしている

している

Daphnia magna

とととと同様同様同様の同様のの結果の結果が結果結果がが得が得得られた得られたられた。られた。。。

Daphnia

属以外属以外の属以外属以外ののミジンコのミジンコミジンコミジンコ種類種類では種類種類ではではでは、、、、

Simocephalus vetylus

Simocephalus

vetylus

にににに

ついてもついてもついてもついても検討検討検討した検討したしたした結果結果結果結果、、、、多種多種多種多種にに比にに比比比べべべべ高濃度高濃度に高濃度高濃度ににに設定設定設定設定しないとしないとしないとしないと遊泳阻害遊泳阻害遊泳阻害遊泳阻害をををを起起起起こさないことこさないことこさないことこさないこと等等も等等もも明も明明明らかとなったらかとなったらかとなったらかとなった。。。。

(36)

本県

本県における

における

におけるバイオアッセイ

バイオアッセイ

バイオアッセイを

バイオアッセイ

を用

を

用

用いた

いた

いた水

水

本県

本県における

における

におけるバイオアッセイ

バイオアッセイ

バイオアッセイを

バイオアッセイ

を用

を

用

用いた

用

いた

いた水

いた

水

質管理

質管理マニュアル

マニュアル

マニュアル作成

作成

質管理

質管理マニュアル

マニュアル

マニュアル作成

作成

現在、日常的に概ね６万種類の化学物質が製造・

使用され、人や生物への影響が懸念される有害な

化学物質も多く含まれている。

化学物質の中には非意図的に生成されたり、複合

的に悪影響をおよぼすものも知られている。

琵琶湖に流入する河川や底質、土壌からも有害な

化学物質が検出されている。

(37)

滋賀県では

．．．

_．．．

「

「「

「化学物質環境汚染実態調査

化学物質環境汚染実態調査

化学物質環境汚染実態調査」

」」

」

「

「「

「琵琶湖底質調査

琵琶湖底質調査

琵琶湖底質調査」

」」

」

「

「「

「内分泌攪乱化学物質実態調査

内分泌攪乱化学物質実態調査

内分泌攪乱化学物質実態調査」

」」

」

「

「「

「地下水調査

地下水調査

地下水調査・

・・

・土壌調査

土壌調査

土壌調査」

土壌調査

」」

」

など多くの実態調査を実施しているが、全ての化学物質の分析は不可能である。

(38)

①

① 異常行動

異常行動

異常行動が

異常行動

が

が判定

が

判定

判定しやすい

しやすい

しやすい種

種

②

② 常

常

常に

常

に

に試験

試験

試験に

試験

に供

に

供

供することができる

供

することができる

することができる種

することができる

種

③

③ 飼育

飼育

飼育しやすい

しやすい

しやすい種

種

④

④ 有害物質

有害物質

有害物質に

有害物質

に

に対

対

対して

対

して敏感

して

敏感

敏感な

な

な種

種

⑤

⑤ 外界

外界

外界に

外界

に

に逃避

逃避

逃避した

した

した場合

した

場合でも

場合

でも

でも生態系

でも

生態系

生態系に

に

に影

に

影

響

響しない

しない

しない種

種

⑥

⑥ 象徴性

象徴性

象徴性のある

のある

のある種

種

生物試験

生物試験で

で

で用

用

用いる

いる生物種

いる

生物種

生物種の

の

の選択

選択

(39)

・生物モニタリング

・生物試験

最終放流槽付近（イメージ図）最終放流槽飼育水槽５頭/ビーカー１濃度４群に分ける原水濃度濃度幼体

(40)

バイオモニタリングにおける魚の行動パターン

正常正常正常正常なななな魚魚魚魚のののの行動行動行動行動パターンパターンパターンパターン異常異常異常異常なななな魚魚魚魚のののの行動行動行動行動パターンパターンパターンパターン2 異常異常異常異常なななな魚魚魚魚のののの行動行動行動行動パターンパターンパターンパターン1 ※ ※ ※ ※ 水槽水槽水槽水槽のののの横横横横からから見からから見見見たたたた画像画像画像画像

(41)

滋賀県

滋賀県が

が

が推奨

が

推奨

推奨する

する

する生物種

生物種

（（（（水産試験場水産試験場水産試験場水産試験場））））魚類：メダカニゴロブナメダカ科メダカ

Oryzias latipes

コイ科ニゴロブナ

Carassius auratus

grandoculis

(42)

監視

監視システム

システム

システムの

システム

の

の構成

の

構成

監視

監視システム

システム

システムの

の

の構成

構成

(43)

各種排水の水質事故の発見と対処・警告

連続式監視

流水式

センサー監視目視監視一定時間暴露目視監視

バッチ式監視

止水式

生物モニタリングの実施体制

評価事業場排水事業場排水事業場排水事業場排水のののの放流放流放流放流評価

異常

原因原因原因原因ののの究明の究明究明究明原因原因原因原因のののの究明究明究明究明原因原因原因原因のののの究明究明究明究明原因原因原因原因のののの究明究明究明究明

(44)

排水毒性評価課税行動レベル以上？毒性同定評価毒性削減物理化学的分析手法 No YES 河川環境影響調査生物相 PEC≧ PNEC 影響評価？希釈率、流量 YES 影響ある可能性 No 影響無し

海外の事例

楠井先生富山県立大)

(45)

排水管理手法としての全排水毒性試験

ーアメリカー

1940年代～排水や水域の監視

1950年代～1960年代ミシガン州やカリフォルニ

ア州で化学分析を補完するする排水モニタリング

試験として導入

1977 水清浄法(CWA)ーゼロディスチャージ

個別化学物質+全排水毒性+生物相調査

全排水毒性試験：Whole effluent toxicity

毒性試験法の開発・標準化と適用

排水毒性と放流河川での影響の相関関係

1940年代～排水や水域の監視

1950年代～1960年代ミシガン州やカリフォルニ

ア州で化学分析を補完するする排水モニタリング

試験として導入

1977 水清浄法(CWA)ーゼロディスチャージ

個別化学物質+全排水毒性+生物相調査

全排水毒性試験：Whole effluent toxicity

毒性試験法の開発・標準化と適用

(46)

生物相調査

個別化学物質

(化学分析)

全排水毒性

(ﾊﾞｲｵｱｯｾｲ)

○毒性把握 ○未知物質にも対処 ●人間の健康保護 ●環境中での残留・蓄積性 ○実際の影響測定 ○未知発生源の影響検知 ●流量の影響 ●原因の同定 ○能力　●限界

有害物質制御のための統合的アプローチ

-U.S.EPA

○人間の健康保護 ○毒性学作用機序 ●生物利用可能性 ●物質間の相互作用楠井先生(富山県立大)

(47)

バイオアッセイに関するU.S.EPAの

研究成果

排水毒性試験の予測能力～実水域での影響

• 混合排水毒性試験計画：70数～９０数％の相関

試験の再現性→試験の標準化

生物種の感受性の相違

• EPA:最低３種（魚類、無脊椎動物、藻類）を推奨

急性試験と慢性試験

• 急性試験から慢性試験結果の予測

• 急性/慢性比（ACR）：LC50/NOEC

• EPA推奨値：ACR＝１０

楠井先生(富山県立大)

(48)

ドイツ排水令の中で用いられている

バイオアッセイ

遊泳阻害遊泳阻害遊泳阻害遊泳阻害 24h DIN38412-L30 ミジンコミジンコミジンコ ミジンコ Daphinia magna 32h DIN38415-T 変異原性変異原性変異原性変異原性 Salmonella typhimurium （（（ （umu試験試験試験試験））））バイオマスバイオマスバイオマスバイオマス生産生産生産生産 72h DIN38412-L33 藻類藻類藻類藻類 Scenedesmus subspicatus 発光阻害発光阻害発光阻害発光阻害 0.5h DIN38412-L34 細菌細菌細菌細菌 Vibrio fischeri （（（（発発発発光細菌試験光細菌試験光細菌試験光細菌試験））））死亡死亡死亡死亡 48h DIN38412-L31 魚魚魚魚 Leudiscus idus パラメータパラメータパラメータパラメータ判定時間判定時間判定時間判定時間規規規規格格格格供供供供試試試生試生生生物物物物

(49)

フランス

フランスにおける

における

におけるバイオアッセイ

バイオアッセイ

バイオアッセイの

の

の応用

の

応用

産業排水への制御：表流水への汚濁物質の排出量へ応じて登録施設へ課税排水汚濁物質と水使用量に応じて汚染者と水消費者に課税。同時に徴収された税金は水保護のために町、企業に再分配表１：汚染者課税に用いられるパラメーター（1989年度） 0(b) _-1780 溶解塩 (kg/day) 1600-3400 生物阻害物質生物阻害物質生物阻害物質

生物阻害物質 ((((kTUkTUkTUkTU/day)/day)/day)/day)

0( b) _-700 リン含有物質 (kg/day) 30-140 窒素含有物質 (kg/day) 100-210 酸化可能物質 (kg/day)(a) 50-90 懸濁物質 (kg/day) 課税率パラメーター 3 ) ( 2 ) ( ) (a OM ₌ COD + BOD (a) (b)一部の水局では課税されていない (b) (c)TU/day=(100/EC50.daphnia) (c) ×Q(m 3_/day) 楠井先生(富山県立大)

(50)

バイオアッセイと環境管理

バイオアッセイバイオアッセイ環境管理_環境管理個別化学物質個別化学物質リスクアセスメント環境基準試験方法生物種、代表性再現性、簡易性保全対象ヒト、生態系対象水上水、下水、排水、環境水、廃棄物etc. 管理レベル問題発見、同定監視、基準etc. 毒性学的意義対策・処理不確実性リスク評価楠井先生(富山県立大)

(51)

バイオアッセイを用いた水質

自主管理を普及させるための課題

技術面の検討

・系統の明らかな生物の供給

・判断基準の明確化、指導、研修

コスト面の検討

・ミジンコ急性遊泳阻害の場合

インキュベーターとビーカー約 10 万円

・魚類自動監視装置の場合

事業場の生物自動監視装置一式約700万円

普及方法の検討

・事業場が委託できる試験機関の整備・自主管理による事業場のイメージアップ・県による普及への助成

(52)

政策課題

政策課題と

と

とバイオアッセイ

バイオアッセイ

１環境リスクの視点

① 水質異常時水質異常時水質異常時の水質異常時のの原因究明の原因究明原因究明・原因究明・影響把握・・影響把握影響把握（影響把握（（（水道事故対策等水道事故対策等水道事故対策等）水道事故対策等））） ②化学物質の種類の増加（ＰＲＴＲ等への対応） ③ 新たな毒性の把握（環境ホルモン等、超微量影響） ④ ④④ ④ 住民住民住民との住民とのとのリスクコミュニケーションとのリスクコミュニケーションリスクコミュニケーションリスクコミュニケーションののの複雑化の複雑化複雑化複雑化

２生態系保全の視点

① 化学物質による生態系への影響の把握 ② エコシステムとしての環境指標の構築

３流域管理（マザーレーク）の視点

① 流域協議会における具体的な行動目標の設定河川・琵琶湖の生物調査→行動計画への導入→ 住民の流域管理の成果指標

(53)

現状の取り組みと課題

県民・事業者が自主的に参加でき

る仕組みづくりが重要

・行動計画における一般県民にわかりやすい目標の設定・・・・琵琶湖等水環境琵琶湖等水環境琵琶湖等水環境琵琶湖等水環境ににににおけるおけるおけるおける生態系生態系生態系生態系のののの評価評価評価評価指標指標指標指標がががが必要必要必要必要・・・・そのためにそのためにそのためにそのために広範囲広範囲広範囲広範囲ののののデータデータデータ収集データ収集収集が収集がが必要が必要必要必要・・・・化学物質以外化学物質以外化学物質以外化学物質以外のののの生物影響生物影響生物影響生物影響のののの除去除去除去除去・・・・繁殖能力影響試験等繁殖能力影響試験等繁殖能力影響試験等繁殖能力影響試験等のののの毒性毒性毒性毒性影響影響影響影響ののの検討の検討検討検討・・・・住民住民住民住民にわかりやすいにわかりやすいにわかりやすいにわかりやすいリスクコリスクコリスクコリスクコミュニケーションミュニケーションミュニケーションミュニケーションののののツールツールツールツールがががが必必必必要要要要

課題

マザーレークの流域協議会活動滋賀県生態系研究会・検討会の推進・事業所向け自主管理マニュアルの作成・ＰＲＴＲの取り組み

現状の

主な取

組

流域管理

生態系保全

環境リスク管理

(54)

今後の方向性

★住民参加の仕組みが必要 ★バイオアッセイの現場での適用とその事例の検討が必要住民・事業者による環境リスクの判断住民・事業者による生態系の監視住民・事業者による流域管理の目標設定河川・琵琶湖（特に沿岸部）の生態系の現状把握住民との協働による流域管理・水環境の保全環境モニタリングへの適用技術の確立

(55)

まとめ

琵琶湖産琵琶湖産琵琶湖産の琵琶湖産ののの生物利用生物利用した生物利用生物利用したしたしたバイオアッセイバイオアッセイバイオアッセイのバイオアッセイの検討のの検討検討検討したしたした結果した結果、結果結果、、、藻類藻類藻類藻類としてとしてとしてとしてははは

は緑藻緑藻の緑藻緑藻のののイトクズモイトクズモイトクズモイトクズモとと呼とと呼呼呼ばれるばれるばれるばれるAnkistrodesmus falcatusAnkistrodesmusAnkistrodesmusAnkistrodesmus falcatusfalcatusfalcatus ががOECDががOECDのOECDOECDののの標標標標準種

準種準種

準種ののののSelenastrumSelenastrumSelenastrumSelenastrum capricornutumcapricornutumcapricornutumcapricornutum よりよりよりより低低低低レベルレベルでレベルレベルででで感受性感受性感受性を感受性を示をを示示示ししししバイバイバイバイオアッセイオアッセイオアッセイオアッセイのののの種種種として種としてとして有望として有望有望有望であることがであることがであることがであることが推察推察された推察推察されたされたされた。。。しかし。しかし、しかししかし、、完全、完全完全には完全にはにはには無菌培養株無菌培養株無菌培養株無菌培養株ではないためではないため、ではないためではないため、、今後、今後今後今後もも更もも更更更にににに検討検討を検討検討をを進を進進進めるめるめる必要める必要があると必要必要があるとがあると考があると考考考えられたえられたえられたえられた。。。。

甲殻類としては甲殻類甲殻類甲殻類としてはとしては琶湖北湖としては琶湖北湖琶湖北湖で琶湖北湖ででで過去過去過去過去にに大量発生にに大量発生大量発生大量発生したしたしたしたDaphnia pulicariaDaphnia Daphnia Daphnia pulicariapulicariapulicariaがががが

OECD OECD OECD

OECDのの標準種のの標準種標準種である標準種であるであるであるDaphnia magnaDaphnia magnaDaphnia magnaDaphnia magna とととと同同同同レベルレベルのレベルレベルのの感受性の感受性感受性感受性をを示をを示示し示ししバしバババイオアッセイイオアッセイイオアッセイイオアッセイのののの種種種種としてとしてとしてとして有望有望であることが有望有望であることがであることが推察であることが推察推察された推察されたされた。された。。。今後今後今後、今後、、、滋賀県方式滋賀県方式滋賀県方式滋賀県方式のののの化学物質削減技術化学物質削減技術マニュアル化学物質削減技術化学物質削減技術マニュアルマニュアルマニュアル作成作成作成作成のためにものためにものためにものためにも、、、、更更更更にににに他他他他のののの生物材料生物材料生物材料についても生物材料についても検討についてもについても検討検討する検討するする必要する必要がある必要必要があるがあるがある。。。。またまたまたまた、、、、工場排水等工場排水等の工場排水等工場排水等のののバイオアッセイバイオアッセイバイオアッセイのバイオアッセイののの結果結果、結果結果、、阻害、阻害阻害が阻害ががが認認められた認認められためられた時点められた時点時点時点ににににおけるおけるおけるおける評価方法評価方法の評価方法評価方法のの確立の確立確立確立がががが今後今後今後の今後の課題のの課題課題課題であるとであるとであるとであると考考考えられた考えられたえられた。えられた。。。