博 士 （ 理 学 ） 学 位 論 文 題 名
フ ァ テ メ
サファ 1J
Regulation of Src family kinases by Pragmin via the EPIYA tyrosine‑phosphorylation motif, which is utilized
by bacterial effectors
（細菌エフェクターが模倣するEPIYA チロシンリン酸化モチーフを介した Pragmin によるSrc フんミリーキナーゼの制御）
学位論文内容の要旨
A number of bacterial pathogens injected effector proteins into host cells by a bacterial type III or type IV secretion system. After translocation, these effectors undergo tyrosine phosphorylation at
Glu‑Pro‑Ile‑Tyr‑Ala (EPIYA) or EPIYA‑Iike sequence motif by host kinases. This EPIYA phosphorylation triggers complex formation of bacterial effectors with SH2 domain‑containing proteins that results in perturbation of eukaryotic signal transduction pathways and subversion host
cell functions for the benefit of the pathogen. Sofar, no molecule has been reported in marmnals
which utilizes the EPIYA motif for the possible biological function. In this work, it was explored a mammalian protein possessing a functional EPIYA motif that may be exploited or evaded by bacterial EPIYA effectors. To this end, by searching of the human proteome with the NCBI BLAST program, six proteins which have a perfect EPIYA motif were identified. It was hypothesized that mammalian EPIYA effectors, if they exist, should have a scaffold/adopter function involved in intracellular signal transduction. Pragmin, a cytoplasmic pseudokinase, was chosen for further analysis in this study, Because many pseudokinases have been known to act as scaffolds or adaptors in the cells. It was found that Pragmin undergoes tyrosine phosphorylation by SFKs or in response to EGF stimulation at the EPIYA motif. Tyrosine phosphorylation at EPIYA motif of pragrnin makes complex formation with the
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C‑terminal Src kinase (Csk), a negative regulator of SFKs. Pragmin is a cytoplasmic protein and the Pragmin‑Csk complex formation sequesters Csk to the cytoplasm, preventing SH2 domain‑dependent recruitment of Csk to the membrane and
subsequent inactivation of SFKs. Since SFKs are kinases that phosphorylate Pragmin, therefore, these results indicated the presence of a positive feedback loop that ensures sustained SFK activation by the Pragmin‑Csk complex. It was also shown unlike bacterial EPIYA motifs which can display promiscuous specificity for multiple SH2 domains, however, the Pragmin EPIYA motif exhibited strict binding specificity to the SH2 domain of Csk. Interestingly, Helicobacter pylori EPIYA effector CagA has been shown to bind to Csk in a tyrosine phosphorylation‑dependent manner. In this study, It was demonstrated that the level of the Pragmin‑Csk complex substantially reduced in the presence of a H. pylori CagA. However, H. pylori EPIYA effector CagA binds to Csk SH2 domain in place of Pragmin and thereby enforces recruitment of Csk to the membrane to inhibit SFKs. These results introduced Pragmin as the first mammalian EPIYA effector and suggests that bacterial EPIYA effectors impair the function of Pragmin to subvert SFKs for successful infection.
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学位論文審査の要旨 主査 教授 坂口和靖 副査 教授 高岡晃教 副査 教授 谷野圭持
副査 教授 藤田恭之 （総合化学院）
副査 教授 畠山昌則
（東京大 学大学院 医学系研究科）
学 位 論 文 題 名
Regulation of Src family kinases by PragmlnViathe EPIYAtyrOSlne ‐ phOSphorylationmotif ， whiChiSutilized bybaCteriale 丑．：eCtorS
（細菌エフェクターが模倣するEPIYA チロシンリン酸化モチーフを介した Pragmin によるSrc ファミリーキナーゼの制御）
Helicobacterガ め灯 （ ″ ． ガ めガ ） の 胃 内 持続 感 染 は 萎 縮性 胃 炎 、 消化 性潰瘍 、さら には胃 がん 発症 と 密 接 に 関 わ っ て い る 。 中 で も 、cagA遺 伝 子 陽 性 の ″ ．pyloriは激 し い 胃 粘 膜病 変 を 惹 起 し、 胃 が ん 発 症 と 強 く 相 関 す る 。cagA陽 性 ″ ．pyloriは 菌 体 内 でCagAタ ン パ ク 質 を 産 生 し 、IV型 分 泌 機 構 を 介 し て 胃 上 皮細 胞 に 直 接CagAタ ンパ ク 質 を 注 入す る 。
CagAはC末 端 側 に グ ル タ ミ ン 酸 − プ ロ リ ン ＿ イ ソ ロ イ シ ン ‐ チ ロ シン ＿ ア ラ ニ ン から な るEPryAモ チ ー フ を 複 数 有 し 、 こ の モ チ ー フ 内 の チ ロ シ ン 残 基 がSrcフ ァ ミ リ ー キ ナ ー ゼ に よ ル リ ン 酸 化 さ れ る 。 チ ロ シ ン リ ン 酸 化 さ れ たCagAは 宿 主 細 胞 内 標 的 タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 し 、 正 常 な 細 胞 内 情 報 伝 達 を か く 乱 す る 。 最 近 の 研 究 よ り 、CagAの み な ら ず 、 他 の 病 原 性 細 菌 エ フ ェ ク タ ー に お い て もEPIYAモ チ ー フ が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ れ ら 細 菌 エ フ ェ ク タ ー も ま た 、CagA 同 様 、EPIYAモ チ ー フ の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 依 存 的 に 様 々 な 宿 主 細 胞 内 標 的 分 子 と 結 合 し 、 そ の 病 原 性 を 発 揮 す る。
そ こ で 本 研 究 で は 、CagAに 代 表 さ れ る 細 菌 エ フ ェ ク タ ー がEPIYAモ チ ー フ を 用 い て 宿 主 細 胞 内 タ ン パ ク 質 を 模 倣 し 、 正 常 な 細 胞 内 情 報 伝 達 を か く 乱 す る と い う 仮 説 に 基 づ き 、 哺 乳 動 物 細 胞 内 に てEPIYAモ チ ー フ を 有 す る タ ン パ ク 質 の 探 索 、 な ら び に そ の 機 能 的 解 析 を 行 っ た 。
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第1章 で は 、 哺 乳 動 物 細 胞 内 に お い てEPIYAモ チ ー フ を 有 す る タ ン パ ク 質 の プ ロ テ オ ー ム 解 析 を 行 い 、Pragminを 同 定 し た 。 細 胞 内 でPragminはSrcフ ァ ミ リ ー キ ナ ー ゼ も し く はEGF刺 激 に よ りEPIYAモ チ ー フ の チ ロ シ ン が り ン 酸 化 さ れ る こ と を 示 し た 。
第2章 で は 、EPIYAチ ロ シ ン リ ン 酸 化 依 存 的 なPragm nの 細 胞 内 標 的 分 子 の 探 索 を 行 っ た 。 PragminはEPIYAモ チ ー フ の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 依 存 的 にSrcフ ァ ミ リ ー キ ナ ー ゼ 活 性 抑 制 分 子 C‑terminal Src kinase (Csk)と 相 互 作 用 す る こ と を 示 し た 。
第3章 で は 、PragminーCsk相 互 作 用 の 生 物 学 的 意 義 を 明 ら か に す る た め 、c‑Srcの 活 性 に 着 目 し て 解 析 を 行 っ た 。Pragminは 細 胞 質 に お い てCskと 相 互 作 用 す る こ と に よ り 、Cskの 細 胞 膜 移 行 を 抑 制 し 、 細 胞 膜 に 局 在 す る c‑S rcの 活 性 を 上 昇 さ せ る こ と を 示 し た 。 第4章 で は 、 ″ ．pylori CagAに よ るPragmin‑Csk相 互 作 用 へ の 影 響 を 検 討 し た 。 細 胞 膜 に 局 在 す るCagAはPragminと 競 合 的 にCskと 結 合 し 、 細 胞 質 に 局 在 す るCskを 細 胞 膜 ー 移 行 さ せ る 。 そ の 結 果 、CagAはCskを 介 し てSrcフ ァ ミ リ ー キ ナ ー ゼ の 活 性 を 抑 制 す る こ と を 示 し た 。 こ れ を 要 す る に 、 著 者 は 、 本 論 文 に てPragminがEPIYAモ チ ー フ の り ン 酸 化 を 介 し てCskと 結 合 し 、Cskの 細 胞 膜 移 行 を 抑 制 す る 結 果 、Srcフ ァ ミ リ ー キ ナ ー ゼ 活 性 を 上 昇 さ せ る こ と を 示 し た 。 さ ら に 、 胃 が ん 発 症 と 密 接 に 関 与 す る ″ ．pylori CagAはPragminと 競 合 的 にCskと 結 合 し 、 細 胞 質 に 局 在 す るCskを 細 胞 膜 ヘ 移 行 さ せ る 結 果 、CagAは 宿 主 細 胞 内 のSrcフ ァ ミ リ ー キ ナ ー ゼ 活 性 を 抑 制 す る こ と を 明 ら か に し た 。 こ れ ら の 成 果 は 権 威 あ る 国 際 学 術 雑 誌 、 全 米 科 学 ア カ デ ミ ー 紀 要 に 報 告 し て お り 、 ″ ， 剛 め ガC噂 へ を は じ め と し たEPIYAモ チ ー フ を 有 す る 全 て の 細 菌 エ フ ェ ク タ ー の 病 態 生 理 学 的 意 義 の 解 明 に 貢 献 す る と こ ろ 大 な る も の が あ る 。
よ っ て 著 者 は 、 北 海 道 大 学 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と 認 め る 。
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