Characterization of Akt InteractlngMOleCuleS （Akt結合因子の機能解析）

博 士 （ 医 学 ）    松 田 真 実

学 位 論 文 題 名

Characterization of Akt InteractlngMOleCuleS      （Akt 結合因子の機能解析）

（背景と目的）

学位論文内容の要旨

  生 体 細 胞 に おけ る 生 理 機 能の 恒 常 性 は 、 構成 成 分であ るタン パク質 の合 成と分 解のバ ランス によっ て 保た れ て い る 。 細胞 内 に お け るた ん ぱ く 質 の分 解は 、ユビ キチン プロテ アソー ム系 に代表 される 選 択 的タ ン パ ク 質 分 解と 、 オ ー ト ファ ジ ー に 代 表さ れる 非選択 的分解 とに大 別され る。 オー卜 ファジ ー は 細胞 が 持 っ て い る、 白 食 と も 呼ば れ る 細 胞 内の タ ン パ ク 質を 分 解 す るた めの仕 組みの1っ でライ ソ ゾ ーム に お け る 細 胞質 成 分 の 分 解の 総 称 で あ る。 オー トファ ジーは 飢餓や 細菌感 染な どによ って誘 導 さ れる だ け で は な く、 細 胞 機 能 維持 の た め の クリ アラ ンス機 能とし ても働 くこと が知 られて いる。 哺 乳 類に お い て は 、 細菌 感 染 防 御 、免 疫 応 答 、 異常 性タ ンパク 質蓄積 を伴う 神経変 性疾 患、癌 化や細 胞 死 など の 多 く の 病 態、 現 象 に 関 与し て い る 。 近年 、 次 々 と オー 卜 フ ァ ジー 関連遺 伝子(Atg)が 同定さ れ てき て か ら オ ー トフ ん ジ ー の 分子 機 構 の 解 明も 進み 、哺乳 動物に おいて オート フん ジーの 生理的 な 役 割が 明 ら か に な りつ っ あ る。ま たその 中で 、オー トファ ジーの 制御にPI3K一AktーmTORシグナ ル伝 達 の 関与 を 強 く 示 唆 する 報 告 が 相 次い で い る 。 しか しこ れらの 詳細な 分子機 構につ いて はまだ 詳細が 明 ら かで は な ぃ 。 ま た、 タ イ プ1細胞 死 と タ イ プ2細 胞 死 が どの よ う 分 別 され 制 御 さ れ てい る の か未だ 不 明 の た め 、 そ の 生 理 的 な 意 義 や 分 子 学 的 な 仕 組 み を 明 ら か に す る 必 要 が あ る   今 回 我 々 はYeast two hybridを 用 い たス ク リ ー ニ ング に お い てAkt新 規 結 合因 子 と し てPHド メ イ ン とFyveド メ イ ン を 有 す る ラ イ ソ ゾ ー ム 蛋 白 のPhafin2を 同 定し た 。Phafin2はFyveドメ イ ン を 介 し てPI (3)Pに 結 合 する こ と が 予 想さ れ た 。 そ こ でPhafin2はPI3K―Akt―mTORシグナ ル伝達 のオー ト フ ん ジ ー 制 御 の 分 子 機 構 解 明 の 鍵 を 握 る 重 要 な 分 子 と し て 注 目 し 解 析 を 進 め た 。

（方法）

Yeast two hybrid法 を 用 い てAkt結 合 因 子 を 同 定 し た 。 免 疫 沈 降 法 を 用 い てPhafin2とAktの 結 合 能 を 検 証 し た 。 さ ら にPhafin2のAktリ ン 酸 化 依存 性 お よ ぴ 結合 部 位 を 検 証 する た め にpull―down assayを 用 い て 調 べ た 。 ま た 、Phafin2の 細 胞 内に お け る 局 在部 位 お よ びAktと の 共 局在 を 検 証 す る た め 、 螢 光 抗 体 法 と 共 焦 点 顕 微 鏡 を 用 い た 実 験 よっ てAktとPhafin2の 局 在 を観 察 た 。BiFC法 、 電 子 顕 微鏡 を 用 い た 解析 に より 、Aktと目 的分子 の細胞 内での さら に詳細 な局在 を検証 した。 また 、FRET 法 を 用 い てAktとPhafin2の 結 合 が 細 胞 内 で ど のよ う に 変 化 する か を 検 証 し た。 ま た ス ク ロー ス 勾 配 法 を 用 い て ラ イ ソ ゾ ー ム の 分 画 を 集 め 、 ウ ェ スタ ン ブ ロ ッ ト でラ イ ソ ゾ ー ム内 のAktとPhafin2 の 挙 動を オ ー ト フ ァジ ー 誘 導 前 と誘 導 後 で 比 較し た 。 オ ー ト ファ ジ ー の誘導 にはRapamycin（lOuM） も し く は ア ミ ノ 酸 飢 餓 状態 に す る た めHBSSで4時 間 細 胞 を 処理 し 、 オ ー 卜フ ん ジ ー マ ーカ ー で あ る LC3の 分 布 を 共 焦 点顕 微 鏡 と 共 に ウェ ス タ ン ブ ロッ ト に てLC3―Iか ら11へ の 変 化を 確 認 し た 。ま た

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SiRNAに よ る 、Phafin2も し く はAktの 発 現 抑 制 の影 響に つ いて 検証 を 行っ た。

（結果 ）

  Yeast two hybrid法 を 用 い てAktに 結 合 す る 新 規 分 子 と し て 同 定 し たPhafin2は 免 疫 沈 降 法 を 用 い た 実 験 か ら 細 胞 内 でAktと 結 合 し て い る こ と が 分 か っ た 。 さ ら に ス ク ロ ー ス勾 配 法に より 分 離し た し た ライ ソゾ ー ム分 画を 用 いた 実験 で はオ ート フ んジ ー誘 導 後、 誘導 前 と比 較し て ライ ソゾ ー ムに Phafin2とAktの 強 い シ グ ナ ル が 見 ら れ た 。 ま た 螢 光 抗 体を 用 いて 共焦 点 顕微 鏡で 確 認し た結 果 オー ト フ ァ ジ ー 誘 導 後 にAktとPhafin2の 共 局 在 レ ベ ル が 亢 進 し て い た 。 ま たBiFCを 用 い た 結 果 よ り 、 AktとPhafin2の 複 合体 がラ イ ソゾ ーム 上 に位 置す る こと を確 認 した 。FRETを用 いた 解 析に おい て は、

オ ー ト フ ァ ジ ー 誘 導 後 に 、 ラ イ ソ ゾ ー ム に お い てAktとPhafin2の 結合 が 強く なる こ とを 確認 し た。

さ ら に オ ー ト フ ァ ジ ー 誘 導 後 にPhafin2が ラ イ ソ ゾ ー ム 膜 上 でPI(3)Pと 結 合 して い るこ とが 分 かっ た 。 一 方Phafin2に 結 合 で き な ぃPI3P変 異 体 で は 、AktとPhafin2が 結 合 し に く く な る と 同 時 に 、 オ ー ト フ ァ ジ ー を 誘 導 す る こ と が で き な か っ た 。 さ ら に、Phafin2 SiRNAを 用 いてPhafin2を ノ ック ダ ウ ン し た 実 験 か ら 、Phafin2が 存 在 し な い 状 態 で は 、 刺激 後Aktがラ イ ソゾ ーム に 移行 しに く いこ とが 分か っ た。 また 、Phafin2を ノッ ク ダウ ンし た 細胞 では オ ー卜 ファ ジ ーが 誘導 レ ベルが減少した。

Phafin2を ノ ッ ク ダ ウ ン し た 細 胞 にPhafin2を 再 導 入 す ると オ ート ファ ジ ー誘 導能 が 回復 した 。 また Akt SiRNAを 用 い た 実 験 か らAktが な い 状 態 で は 、 オ ー ト フ ァ ジ ー 刺 激 後Phafin2は ライ ソゾ ー ムに 移 行 す る が は 、 オ ー ト フ ァ ジ ー 誘 導レ ベル が 低い 値を 示 すこ とが わ かっ た。 さ らに 、Phafin2同 様、

Aktノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 にAktを 再 導 入 す る と 、 オ ー ト フ ァジ ー の誘 導能 が 回復 する こ とを 確認 し た。

実 際 、 Aktを 欠 損 し たMEFで も オ ー ト フ ァ ジ ー が 誘 導 さ れ に く い こ と を 確 認 し た 。

（考察と結論）

  Aktの 新 規 結 合 因 子 と し て 同 定 さ れ た ラ イ ソ ゾ ー ム タ ンパ ク質 のPhafin2は 、オ ー トフ ァジ ー 誘導 時 に お い て 、 ラ イ ソ ゾ ー ム 上 でAktと 共 局 在 す る こ と か ら、 細胞 質 内のAktが オー ト ファ ジー 誘 導刺 激 に よ っ てPhafin2を 介 し て ラ イ ソ ゾ ー ム に 移 行 し て い る と 考 え ら れ る 。 こ れま で にPI3Kの イ ンヒ ビ タ ー で あ る3MAやWortmanninは オ ー ト フ ァ ジ ー を 抑 制 す る こ と が 知 ら れ て いた が その 作用 機 序は 明 ら か に な っ て い な か っ た 。 今 回 の 解 析 か ら 、Phafin2は ラ イ ソ ゾ ー ム の 膜 状でPI3Pと 結合 す るこ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、PI3Pに 結 合 で き な いPhafin2変 異 体 で は 、AktとPhafin2の 共 局 在 レ ベ ル が 減 少 し た 。 こ の こ と か ら 、 こ れ ら の イ ン ヒ ビ タ ー はPhafin2とlysosome内 のPI3Pの結 合を 阻 害す る こ と で 、Aktの ラ イ ソ ゾ ー ム の 移行 が 阻害 され オ ート ファ ジ ーを 抑制 し てい ると 考 えら れる 。 また SiRNAを 用 い た 実 験 か ら 、Phafin2ま た はAktを ノ ッ ク ダ ウ ン し た 際 に オ ー ト ファ ジ ーの 誘導 能 が低 下 す る こ と か ら 、RapamycinやHBSSを 用 い て 細 胞 を ア ミ ノ 酸 飢 餓 の 状 態 に し た際 に 、Phafin2がAkt と 結 合 し 、 そ の 複 合 体 が ラ イ ソ ゾ ー ム に 移 行 し 、 ラ イ ソゾ ー ム内 のPI3Pと結 合す る こと がオ ー トフ ァ ジ ー 誘 導 に 必 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

  オ ー ト フ ァジ ー が代 謝調 節 、細 胞内 浄 化、 免疫 、 腫瘍 抑制 な どの さま ざ まな 生命 機 能に おい て 重要 な 役 割 を 果 たし て いる こと か ら、 自然 免 疫系 とし て 機能 する オ ート ファ ジ ーの 誘導 因 子や 細胞 内 の標 的 分 子 を 明 ら か に す る こ と で 様 々 な 疾 患 の 治 療 法 の 糸 口 に な る と 期 待 で き る 。

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

Characterization of Akt InteractlngM01eCuleS      （Akt 結合因子の機能解析）

   生体細胞における生理機能の恒常性は、構成成分であるタンパク質の合成と分解のバラ ンスによって保たれている。細胞内におけるタンパク質の分解は、ユビキチンプロテアソ ーム系に代表される選択的タンパク質分解と、オートファジーに代表される非選択的分解 とに大別される。オー卜ファジーは細胞が持っている細胞質成分の分解の総称で、白食と も呼 ばれる 細胞内タンパク質を分解するための仕組みの1 っである。オートファジーは飢 餓や細菌感染などによって誘導されるだけでなく、細胞機能維持のためのクリアランス機 能としても働くことが知られている。哺乳類においては、細菌感染防御、免疫応答、異常 タンパク質蓄積を伴う神経変性疾患、癌化や細胞死などの多くの病態に関与している。近 年、 オート ファジー関連遺伝子(Atg) が次々と同定され、オートファジーの分子機構の解 明も進み、哺乳動物におけるオートファジーの生理的役割が明らかになりつっある。また その 中で、 PI3K‑Akt‑mTOR シグナル伝達のオー卜ファジー制御への関与を強く示唆する報 告 が 相次 い で いる 。 し かし そ の 詳 細な 分 子 機構 に つ いて は いま だ明ら かではな い。

   本研 究では 、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより新規Akt 結合因子として、PH ドメ インと FYVE ドメイン を有す るライソ ゾームタンパク質Phafin2 を同定した。Phafin2 はAkt と結 合しライソゾーム膜へと移行、ライソゾーム膜上でのPI(3)P との結合がオート ファジー誘導に重要であること、Phafin2 と Akt の存在自体がオートファジー誘導に重要で あることを明らかにした。

   口頭 発表後 、副査の 畠山教 授から内 在性 Akt とPhafin2 の結合について、 HT1080 以外の 細胞における定常状態（オートファジー誘導無し）での両者の結合について質問があった。

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介 次

孝 幸

雄

鎮

壽

昌

場

山

邊

口

大

畠

佐

野

授

授

授

授

教

教

教

教

査

査

査

査

主

副

副

副

ま た 、 酵 母 にAktやPhafin2、mTORが 存 在 す る ど う か 、 こ の 実 験 で 見 ら れ るAktとPhafin2 を 介 し た 現 象 が 酵 母 で も 起 こ り う る か ど う か に つ い て 質 問 が あ っ た 。 さ ら に 、 オ ー ト フ ァ ゴ ソ ー ム の 形 成 や ラ イ ソ ゾ ー ム と の 融 合 な ど オ ー ト フ ァ ジ ー 誘 導 過 程 の ど の 段 階 にPhafin2 とAktの 結 合 を 介 し た 機 構 が 関 与 す る か に つ い て の 質 問 が あ り 、 電 子 顕 微 鏡 を 用 い てPhafin2 や オ ー ト フ ァ ジ ー の 局 在 、 オ ー ト フ ァ ゴ ソ ー ム や 二 重 膜 の 形 成 に つ い て 詳 細 に 解 析 す べ き で あ る と 言 う ア ド バ イ ス が あ っ た 。 ま た 、 そ の 際 に は オ ー ト フ ァ ゴ ソ ー ム を 観 察 す る た め に 適 切 な サ ン プ ル の 処 理 等 を 専 門 家 か ら 詳 し く 学 ぶ べ き で あ る と の 指 摘 が あ っ た 。 最 後 に Aktノ ッ ク ア ウ 卜 マ ウ ス で は オ ー ト フ ァ ジ ー が ど の よ う に な っ て い る か と い う 質 問 が あ っ た 。 続 い て 副 査 の 佐 邊 教 授 か ら 、AktとPhafin2の 結 合 部 位 を 明 ら か に し 、 結 合 が 阻 害 さ れ た と き の オ ー ト フ ァ ジ ー へ の 影 響 を 見 る こ と が 大 変 重 要 で あ る と ア ド バ イ ス が あ っ た 。 ま た 学 位 論 文 はthesisで あ る た め 、 分 子 の 説 明 、 語 源 、 ど の よ う に 問 題 を 解 決 し た か 、 ど の よ う な 失 敗 が あ っ た の か な ど ネ ガ テ ィ ブ デ ー タ を 含 ん だ 詳 細 な 記 述 が 必 要 で あ る と い う 指 摘 が あ っ た 。 主 査 の 大 場 教 授 か ら は 、Phafin2はAktl、2と 結 合 しAkt3と は 結 合 し な い た め 、 三 者 の 配 列 を 比 較 し 、AktとPhafin2の 結 合 部 位 を 探 っ て み て は ど う か と い う ア ド バ イ ス が あ っ た 。 ま た 、Phafm2の み で は な くPhafmlや こ れ ま で 同 定 さ れ て き た 様 々 なAkt結 合 因 子 に 関 し て 共 通 配 列 が 存 在 す る か 、 ま た は そ れ に つ い て 解 析 し た か と 言 う 質 問 が あ っ た 。 さ ら に 、classlIIP13Kinhibitorで あ る3MAが オ ー ト フ ァ ジ ー を 抑 制 す る 機 序 に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 自 身 の 実 験 結 果 や 過 去 の 文 献 を 引 用 し つ つ 、 こ れ ら の 質 問 に 適 切 に 解 答 し た 。 な お 、 副 査 の 野 口 教 授 は 体 調 不 良 で 審 査 会 （ 平 成25年2月6日 ） を 欠 席 し た が 、 後 日 （ 平 成25年2月8日 ） 主 査 の 研 究 室 に お い て 本 論 文 を 厳 正 に 別 途 精 査 し た 。   こ の 論 文 は 、 新 規Akt結 合 タ ン パ ク 質Phafln2と オ ー ト フ ァ ジ ー に お け る 関 与 を 明 ら か に し た も の で あ り 、 今 後 の 細 胞 生 物 学 研 究 に 新 た な 展 開 を も た ら す も の と 期 待 さ れ る 。   審 査 員 一 同 は こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 、 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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