技術論文
質量分析法（VITEK MS）と生化学的性状による
臨床分離株同定の比較検討
服部 拓哉
1)西山 秀樹
1)池上志乃富
1)鈴木真由子
1)村上いつか
1)美濃島 慎
1)山岸 宏江
1)湯浅 典博
1) 1) 名古屋第一赤十字病院検査部（〒 453-8511 愛知県名古屋市中村区道下町 3-35） 要 旨 マトリックス支援レーザー脱離・イオン化―飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）法による細菌名同定に関する報告 は多数あるが，最新の MALDI-TOF MS 装置である VITEK MS と従来の細菌名同定法を比較した報告は少ない．我々は臨 床分離株 314 株を用いて，VITEK MS と細菌の生化学的性状に基づく菌名同定機器 VITEK2 の菌名同定結果を比較した． VITEK MSの同定率は属レベルで 93.6%，種レベルで 88.9%，VITEK2 の同定率は属レベルで 95.9%，種レベルで 85.0%で あった．属レベルでは VITEK2 の方が VITEK MS より高い同定率を示したが，種レベルでは VITEK MS が VITEK2 より 有意に高い同定率を示した．腸内細菌科の株では検査手技に起因して VITEK MS で菌種が同定できないことがあった．手 技の向上及びデータベースの整備により VITEK MS の同定率は上がると考えられる．キーワード
質量分析，MALDI-TOF MS，VITEK MS，VITEK2
序 近年，細菌感染症において薬剤耐性菌や抗菌薬適 正使用の観点から，起因菌の迅速かつ正確な同定が ますます重要となっている．これまで臨床細菌検査 室では形態学的及び生化学的手法により菌名を同定 してきたが，こうした同定には数時間から数日を要 する1)．一方，16S rRNA 解析等の分子生物学的手法 は正確な同定に優れているがサンプル処理が煩雑で あり，多量の検体を扱う臨床細菌検査室での日常検 査には不向きである2)． 1988年，マトリックス支援レーザー脱離・イオ
ン 化 ― 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry
（MALDI-TOF MS）法が開発され3)，蛋白質解析技術 が臨床細菌検査にも応用されるようになった4)．本法 による細菌同定は生化学物質の反応を必要としない ので，わずかな菌量で迅速な細菌同定が可能であ る5),6)．本法による細菌同定結果に関する研究はこれ まで多数報告され，それらでは菌名同定に関して従 来法と比較して本法が優れていることが示される一 方，問題点も指摘されている1),2),7)．我々の調べ得た 限りでは，最新の MALDI-TOF MS 装置であるVITEK MS（Sysmex bioMérieux）と従来法による同定結果 を比較した報告は Dubois らの報告のみであり，本邦 からの報告は極めて少ない8)．今回我々は，VITEK MSが従来法に劣らない細菌同定能を有するかどう かを明らかにするため，VITEK MS と生化学的性状 に基づく菌名同定装置 VITEK2 コンパクト（Sysmex bioMérieux）による同定結果の比較を行った． I 対象及び方法 1．対象 対象は 2012 年 8 月～12 月の 4 ヵ月間に当院細菌 （平成 26 年 1 月 14 日受付・平成 26 年 5 月 15 日受理）
検査室に提出された臨床材料分離株 314 株である． 全ての分離株は 18 時間の培養後，あるいはコロニー が微小な場合は肉眼で確認できる大きさになるまで 発育させた後，菌名同定を行った．分離培養にはポ アメディア羊血液寒天培地（栄研化学），チョコレー ト寒天培地（極東製薬），パールコアマッコンキー寒 天培地‘栄研’（栄研化学），またはカンピロバクター 血液無添加選択寒天培地（関東化学）を用いた． 2．菌名同定検査 MALDI-TOF MS法として VITEK MS とその専用 解析ソフトである VITEK MS ver. 2.0 が有するデータ ベースを用いた．分離培養後，独立した一つのコロ ニ ー を 釣 菌 し ， タ ー ゲ ッ ト ス ラ イ ド （ Sysmex bioMérieux）に直接塗布した．その上に専用の CHCA マトリックス試薬（Sysmex bioMérieux）を 1.0 μL 滴 下して，室温で十分に乾燥させた．16 検体毎に
Esherichia coli ATCC 8739を較正スポットに塗布し，
較正及び内因性コントロールとして使用した．全て の菌株に 1 スポット測定を適用し，蟻酸による蛋白 抽出処理は行わなかった． 従来法として細菌の生化学的性状に基づいて細菌 名判定を行う VITEK2 コンパクトを用いた．コロニー の性状もしくはグラム染色結果によってそれぞれに 適した同定カード（GP，GN，NH，ANC，及び YST カード）を用いた． VITEK MS及び VITEK2 が複数菌名を表示した場 合や属レベルまでしか同定ができなかった場合，そ れ以上の追加同定検査は行わなかった． 3．結果の解釈 VITEK MSと VITEK2 各機器によって菌名が得ら れた場合に同定率と両者の一致率を計算したが， Table 1に示すように同定率と一致率を算出する際 の例外を設けた．VITEK MS では Table 1 左列に 示す Acromobacter denitrificans，A. xylosoxydans など の菌種は判別ができないため，統一菌名として Acromobacter denitrificans/xylosoxydansなどの右列に 示す菌名を採用した． 4．統計解析 VITEK2と VITEK MS の同定率は属レベルと種レ ベルにおいてそれぞれ McNemar 検定により比較し， P < 0.05を統計学的有意差ありとした．解析ソフト
は EZR（The R Foundation for Statistical Computing, Perugia, Italy）を用いた． II 結 果 1．VITEK MS と VITEK2 の同定率 VITEK MS により属レベルで 294 株（同定率 VITEK MSでは判別が不可能な菌種の一覧 候補菌名 統一菌名 Achromobacter denitrificans
Achromobacter xylosoxidans Achromobacter denitrificans/xylosoxidans Bacillus cereus
Bacillus thuringiensis Bacillus mycoides
Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Bacillus subtilis
Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis/amyloliquefaciens Corynebacterium amycolatum
Corynebacterium xerosis Corynebacterium amycolatum/xerosis Enterobacter cloacae
Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae complex Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus gasseri Lactobacillus acidophilus/gasseri Lactobacillus casei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei
Lactobacillus casei/paracasei/paracasei subsp. paracasei Proteus vulgaris
Proteus penneri Proteus vulgaris/penneri Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae
Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis
Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae/equisimilis Table 1
臨床分離株 314 株の同定結果
VITEK MSによる同定菌種名 菌株数 VITEK2と結果が一致した菌種 VITEK2と属レベルでも
一致しなかった菌種 種レベル 属レベル Staphylococcus aureus 13 12 1 Staphylococcus capitis 4 4 Staphylococcus epidermidis 15 9 3 3 Staphylococcus haemolyticus 12 6 5 1 Staphylococcus hominis 5 3 1 1 Staphylococcus lugdunensis 2 1 1 Staphylococcus saprophyticus 2 1 1 Staphylococcus simulans 1 1 Enterococcus faecalis 9 9 Enterococcus faecium 15 14 1 Enterococcus raffinosus 7 3 4 Enterococcus avium 1 1 Enterococcus gallinarum 1 1 Streptococcus pyogenes 5 4 1 Streptococcus agalactiae 6 5 1 Streptococcus pneumoniae 12 9 3 Streptococcus mitis/oralis 4 2 2 Streptococcus equisimilis/dysgalactiae 2 1 1 Streptococcus anginosus 2 2 Streptococcus constellatus 2 2 Streptococcus salivarius 1 1 Streptococcus sanguis 1 1 Aerococcus urinae 1 1 Grobicatella sanguinis 1 1 Esherichia coli 18 17 1 Klebsiella oxytoca 13 12 1 Klebsiella pneumoniae 10 10 Proteus mirabilis 9 9 Proteus vulgalis/penneri 2 2 Morganella morganii 5 4 1 Serratia marcescens 10 10 Serratia liquefaciens 1 1 Salmonella group 6 6
Enterobacter cloacae complex 8 8
Enterobacter aerogenes 5 5 Citobacter freundii 3 3 Citobacter amalonaticus 1 1 Citobacter braakii 1 1 Citobacter fermeri 1 1 Citobacter koseri 1 1 Citobacter youngae 1 1 Kluyvera cryocrescens 1 1 Raoultella ornithinolytica 8 1 4 3 Raoultella planticola 2 1 1
Acinetobacter baumannii complex 9 9
Campylobacter jejuni 4 1 3 Pseudomonas aeruginosa 14 13 1 Pseudomonas putida 2 2 Plesiomonas shigeroides 1 1 Elizabethkingela meningoseptica 2 2 Stenotrophomonas maltophilia 6 5 1 Achromobacter xylosoxidans/denitrificans 2 2 Aeromonas hydrophila/caviae 1 1 Moraxella catarrhalis 6 5 1 Corynebacterium jeikeium 1 1 Corynebacterium pseudodiphtheriticum 1 1 Corynebacterium amycolatum/xerosis 2 1 1 Corynebacterium striatum 8 5 2 1 Bacillus thuringiensis/cereus/mycoides 2 2 Rothia mucilaginosa 2 2 Pasteurella multocida 1 1 No identification 20 Total 314 233 38 23 Table 2
93.6%），種レベルで 279 株（88.9%），の菌名が同定 された．一方，VITEK2 により属レベルで 301 株 （95.9%），種レベルで 267 株（85.0%）が同定され た．統計学的に属レベルでは VITEK2 が VITEK MS より有意に高い同定率を示し（P = 0.02），種レベル では VITEK MS が VITEK2 より有意に高い同定率を 示した（P = 0.001）． 2．同定結果の比較 VITEK MSで属レベルまで同定された 294 株のう ち，VITEK2 の同定結果と属レベルで一致した菌株 は 271 株（92.2%）であった（Table 2）．属レベルで も両者が一致しなかった 23 株（7.8%）のうち 13 株 は VITEK2 では Unidentified と表示され同定されな かった．残りの 10 株（3.4%）の菌名を Table 3 に示 した．Staphylococcus epidermidis（VITEK MS）と
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris（VITEK2）
の組み合わせが 2 株，その他の不一致例は 1 株ずつ であった．VITEK MS で種レベルまで同定された 279 株のうち，VITEK2 による同定結果と種レベルまで 一致した菌株は 233 株（83.5%）であった． VITEK MSにより菌種名が同定されなかった（No identificationと表示された）20 株のうち 17 株（85%） は VITEK2 では菌種名が同定された．その内訳は，
S. aureus， S. hominis ， S. caprae ， Streptococcus
agalactiae， Corynebacterium jeikeium ， E. coli ，
Enterobacter cloacae complex， Klebsiella oxytoca ，
Citrobacter freundii，C. koseri，Kluyvera intermedia，
K. ascorbata， Campylobacter jejuni ， Pseudomonas
aeruginosa，P. putida（E. cloacae complex のみ 2 株，
その他はそれぞれ 1 株ずつ）で，47%が腸内細菌科 グラム陰性桿菌であった．この 20 株中 3 株（15%） は VITEK2 でも菌種名が同定されなかった． VITEK MSと VITEK2 の同定菌名が一致しなかっ た菌種名 VITEK MS VITEK2
Staphylococcus epidermidis Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris
Streptococcus pyogenes Micrococcus luteus/lylae
Morganella morganii Proteus mirabilis
Raoultella ornithinolytica Klebsiella pneumoniae
Raoultella ornithinolytica Klebsiella oxytoca
Raoultella ornithinolytica Enterobacter cloacae complex
Raoultella planticola Klebsiella oxytoca
Campylobacter jejuni Neisseria cinerea
Rothia mucilaginosa Granulicatella adiacens
Table 3 III 考 察 今回我々は VITEK MS と VITEK2 を用いた臨床分 離株の同定結果を比較することで両法による菌名同 定の違いを明らかにした．MALDI-TOF MS 法と生化 学的性状に基づく細菌名同定結果を比較した報告は 多数あるが1),2),7)，最新の MALDI-TOF MS 装置であ る VITEK MS の同定能を従来法と比較した報告は少 ない8)．MALDI-TOF MS 法による細菌名同定では， 蟻酸による蛋白抽出や 2 スポット測定を行うことで より高精度の菌名同定を行えることが報告されてい るが，我々は蟻酸処理を行わず 1 スポット測定で実 施した．これは日常検査においては簡便かつ低コス トの方法で細菌名同定を行うことが重要と考えたか らである． 今回の検討では，属レベルでは VITEK2 が VITEK MSより，種レベルでは VITEK MS が VITEK2 より それぞれ同定率が高かった．種レベルの細菌名同定 で MALDI-TOF MS 法が従来法に劣らないことは複 数の研究者により報告されており，我々の検討でも 裏付けられた1),2)．我々の研究では属レベルでの同定 率は VITEK2 に比べて VITEK MS 法が劣ったが，こ れは VITEK MS と VITEK2 の菌名判定法の違いが一 因と考えられる．VITEK2 は種レベルまでの同定が 困難な場合でも，属特異的な生化学的性状が得られ れば属レベルで候補菌名を表示するが，VITEK MS はデータベースのデータ単位が菌種レベルなので， 属レベルでの候補菌名は表示せず No identification と 表示することが一因であろう． 今回の我々の検討で同定菌名が一致しなかった 23 株中，VITEK2 では菌種が同定されなかった 13 株を 除いた 10 株（Table 3）のうち，臨床的に重要な不 一致として S. pyogenes（VITEK MS）と Micrococcus
luteus/lylae（VITEK2）及び C. jejuni（VITEK MS）と
Neisseria cinerea（VITEK2）の 2 株が挙げられる．
M. luteus/lylaeと N. cinerea はヒトの常在菌の一種で あるが，S. pyogenes と C. jejuni は通常，起因菌とみ なされるのでこの不一致は臨床に与える影響が大き い．前者のコロニーは羊血液寒天培地上に溶血環を 認め，ランスフィールド抗原分類（セロアイデンス トレプトキット‘栄研’）では A 群に属したため M.
luteus/lylaeを否定した．また後者のコロニーはカン ピロバクター血液無添加選択寒天培地に発育し，グ ラム染色ではグラム陰性螺旋状桿菌が観察されたこ とから N. cinerea を否定した．従って両菌株ともに VITEK MSでの同定菌名が正しいことが確認された． 残りの 8 株は，どちらの同定菌名であってもそれが 治療計画に影響を及ぼすことは少ないと推定される． このように同定結果を報告する際にはグラム染色や コロニーの所見，発育培地を加味するべきである8)． Rischらは，臨床菌株 6 株において従来法（VITEK2
もしくは API システム；Sysmex bioMérieux）で S.
mitis/oralisと同定された菌が，MALDI-TOF MS 法 では S. pneumoniae と同定されたと報告した2)．事実， S. pneumoniaeと S. mitis/oralis は遺伝子学的に極めて 類似している2)．今回の我々の検討では VITEK MS で S. pneumoniae と同定された 12 株中 9 株は菌名が 一致し，2 株は VITEK2 で S. mitis/oralis，1 株は
VITEK2で同定されなかった．Dubois らは VITEK MS
を用いて S. pneumoniae（19 株）と S. mitis/oralis（9 株）を 100%識別できたことから，VITEK MS は S. pneumoniaeと他の α 溶血性連鎖球菌を区別すると報 告した8)．また，Saffert らは 16S rRNA 解析で K. oxytocaと同定された 16 株中，MALDI-TOF MS 法で K. oxytocaと同定されたのは 8 株のみであり，残り の 8 株は Klebsiella 属の他菌種と同定されたと報告 した．我々の検討では，VITEK2 で K. oxytoca と同 定された 15 株中，VITEK MS でも K. oxytoca と同定 されたのは 12 株であった．残りの 3 株は Raoultella
planticola，R. ornithinolytica 及び No identification で
あった．以上の結果より，これまでの MALDI-TOF MS法を用いた研究で指摘された問題点の一部は VITEK MSで改善される傾向にあることが示唆さ れた． 我々の検討では VITEK MS で菌名が同定されず， VITEK2で菌種名が同定された菌株の 47%が腸内細 菌科グラム陰性桿菌であった．これは MALDI-TOF MS法に特有の検査手技に起因すると考えられる． MALDI-TOF MS法は従来の細菌名同定法に比較し て同定作業に必要な手順が少なく複雑な知識を必要 としないので簡便かつ迅速に同定結果が得られるが， 慎重なサンプル処理が必要である8),9)．MALDI-TOF MS法で腸内細菌科グラム陰性桿菌を同定する際は， 釣菌量が過剰だと良好なスペクトルを得られないこ とはこれまで報告されてきたが8),9)，我々の経験 でも同様であった．したがって，日常検査におい て MALDI-TOF MS 法 に よ る 同 定 結 果 が No identificationとなった場合，釣菌量を減らして再検 査を行うことが推奨される8)．こうした釣菌量の微 調整は同定作業の経験の蓄積により習得されるであ ろう． 本研究では，VITEK MS と VITEK2 で菌名が一致 しなかった菌株について，16S rRNA 解析等を用いて 菌名同定は行っていない．臨床菌株には VITEK MS， VITEK2それぞれのデータベースに収載されていな い菌種も存在することが推測される．一方のデータ ベースに収載されているが他方のデータベースに収 載されていない菌種では，菌名が一致しなかった可 能性がある． MALDI-TOF MS法による細菌名同定はこれまで 微生物検査室が行ってきた同定法に比較していくつ かの利点がある．同定に要する時間が極めて短縮さ れ，我々の検討では VITEK2 による細菌名同定は最 短でも 4 時間（4–18 時間）を要したが，VITEK MS では 1 検体あたり数分であった．また，同定にかか るコストも従来の同定法より少ない7),10)．Neville ら の試算によると，1 検体あたり VITEK2 による平均 同定コストは Australian dollars（AUD）$10.00 であっ たのに対し，MALDI-TOF MS のそれは AUD$0.45 で あった7)． 我々の検討で VITEK MS は VITEK2 と同等以上の 菌種同定能を有することが明らかになったが，同定 結果を確認する際にはグラム染色，発育培地及びコ ロニーの所見を加味することで，迅速性と精度を両 立した臨床現場での運用が実現できるであろう． IV 結 語 VITEK MSは VITEK2 に比べて菌種レベルの同定 率は優れていたが，その同定精度は検査担当者のサ ンプル処理技術に影響を受ける．サンプル処理手技 の向上及びデータベースの整備により，VITEK MS の同定能は上がると考えられる．
■文献
1) Saffert RT et al. : Comparison of Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer to BD Phoenix automated microbiology system for identification of gram-negative bacilli, J Clin Microbiol 2011 ; 49 : 887–892. 2) Risch M et al. : Comparison of MALDI TOF with conventional
identification of clinically relevant bacteria, Swiss Med Wkly 2010 ; 140 : w13095.
3) Karas M, Hillenkamp F : Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons, Anal Chem 1988 ; 60 : 2299–2301.
4) Seng P et al. : Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, Clin Infect Dis 2009 ; 49 : 543–551.
5) Sauer S, Kliem M : Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria, Nat Rev Microbiol 2010 ; 8 : 74– 82.
6) Cherkaoui A et al. : Comparison of two matrix-assisted laser
desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level, J Clin Microbiol 2010 ; 48 : 1169–1175.
7) Neville SA et al. : Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification, J Clin Microbiol 2011 ; 49 : 2980–2984.
8) Dubois D et al. : Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology, J Clin Microbiol 2012 ; 50 : 2568–2576. 9) Bizzini A et al. : Performance of matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory, J Clin Microbiol 2010 ; 48 : 1549–1554.
10) Dhiman N et al. : Performance and cost analysis of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine identification of yeast, J Clin Microbiol 2011 ; 49 : 1614–1616.
Technical Article
Comparative study of bacterial identification using VITEK MS and
VITEK2 in routine clinical microbiological analysis
Takuya HATTORI1) Hideki NISHIYAMA1) Shinobu IKEGAMI1) Mayuko SUZUKI1)
Itsuka MURAKAMI1) Makoto MINOSHIMA1) Hiroe YAMAGISHI1) Norihiro YUASA1)
1)Department of Clinical Laboratory, Japanese Red Cross Nagoya Daiichi Hospital(3-35, Michishita-cho, Nakamura-ku, Nagoya 453-8511, Japan)
Summary
There have been many reports of bacterial identification using a matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) system. However, studies of the bacterial identification using the most recent MALDI-TOF MS system (VITEK MS) compared with that using a conventional biochemical identification system are scarce. We compared VITEK MS with VITEK2 (a conventional biochemical identification system) in the identification of 314 clinical isolates. The identification rate at the genus level for VITEK MS (93.6%) was significantly lower than that for VITEK2 (95.9%); however, the identification rate at the species level for VITEK MS (88.9%) was significantly higher than that for VITEK2 (85.0%). VITEK MS might fail to identify enterobacteria owing to inadequate sampling techniques in some cases or insufficient databases of these bacteria. It is necessary for bacterial identification using VITEK MS to take findings of Gram staining and bacterial colonies into consideration. The identification rate for VITEK MS will be increased by improving sampling techniques and upgrading databases.
Key words: Mass spectrometry, MALDI-TOF MS, VITEK MS, VITEK2
